1、骨髓血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的別離培養(yǎng)及分化鑒定【摘要】目的研究別離、培養(yǎng)小鼠骨髓血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的方法并對其進(jìn)展誘導(dǎo)分化鑒定，為臨床進(jìn)展缺血性疾病的替代治療奠定細(xì)胞學(xué)基矗方法用灌注法別離小鼠骨髓血管內(nèi)皮祖細(xì)胞，用血管內(nèi)皮生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子誘導(dǎo)其分化，形態(tài)學(xué)觀察細(xì)胞的生長過程，并利用抗D34抗體鑒定血管內(nèi)皮祖細(xì)胞，利用抗vF抗體、抗eNS抗體鑒定血管內(nèi)皮細(xì)胞。結(jié)果小鼠骨髓血管內(nèi)皮祖細(xì)胞可在體外培養(yǎng)條件下貼壁生長，可誘導(dǎo)分化為表達(dá)特異性組織蛋白的內(nèi)皮細(xì)胞。結(jié)論在小鼠骨髓內(nèi)可別離出骨髓源性血管內(nèi)皮祖細(xì)胞，呈貼壁增殖狀態(tài)，并有分化才能?！娟P(guān)鍵詞】血管內(nèi)皮祖細(xì)胞;血管內(nèi)皮細(xì)胞;骨髓源性;分化【Keyrd

2、s】Endthelialprgenitrells;Endthelialells;Spinalrd;elldifferentiatin骨髓中的血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endthelialprgenitrells，EPs)可以游走到創(chuàng)傷組織參加新血管形成，并能分化為內(nèi)皮細(xì)胞(Endthelialells，Es)，促進(jìn)部分血管生成和血管新生。目前已有研究者將EPs用于治療缺血性疾病，并獲得了良好的治療效果，具有再生和分化才能的EPs已逐漸成為治療血管系統(tǒng)疾病的理想細(xì)胞材料1。但是，目前EPs主要通過外周血進(jìn)展提取，這種方法獲取的細(xì)胞數(shù)量較少，而骨髓來源的EPs研究報(bào)道不多。本研究從BALB/小鼠別離骨髓源性

3、EPs，在體外進(jìn)展培養(yǎng)擴(kuò)增，誘導(dǎo)其分化，建立一套完好的骨髓源性EPs的別離、培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化和鑒定的方法，為其作為細(xì)胞材料治療血管創(chuàng)傷方面提供根據(jù)。1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)材料BALB/小鼠，68齡，雌雄不限，由吉林大學(xué)醫(yī)學(xué)部根底實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供，SPF級;DE/F12(11)培養(yǎng)基、胎牛血清由Gib公司提供;內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(epideralgrthfatr，EGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basifibrblastgrthfatr，bFGF)由Siga公司提供;纖維連接蛋白(FN)由北京鼎國公司提供;抗D34抗體、抗vF抗體、抗eNS、SP免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒由博士德公司提供;6孔

4、一次性培養(yǎng)板、10一次性培養(yǎng)皿由sta公司提供。1.2EPs的別離與培養(yǎng)2BALB/小鼠斷頸處死后，置于75%酒精浸泡滅菌5in。無菌條件下別離股骨，去除肌肉組織，用1l注射器汲取1l無血清DE/F12培養(yǎng)基，從股骨一端進(jìn)針進(jìn)展沖洗，反復(fù)3次，充分沖出骨髓組織，用200目不銹鋼篩網(wǎng)進(jìn)展碾壓，別離成單個(gè)細(xì)胞。用無血清DE/F12離心，棄上清液，2l無血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞參加到淋巴細(xì)胞別離液上離心，1500r/in，30in。用吸管吸出中間白色云霧狀細(xì)胞帶，培養(yǎng)液洗滌2次。用DE/F12培養(yǎng)液(為根底培養(yǎng)基，bFGF和VEGF終濃度均為10ng/l)調(diào)節(jié)細(xì)胞終濃度為5105/l，接種到預(yù)鋪有纖連蛋白

5、10培養(yǎng)皿，37、5%2培養(yǎng)箱中進(jìn)展培養(yǎng)，每3天換液1次。1.3EPs的誘導(dǎo)分化鑒定3將培養(yǎng)細(xì)胞接種于預(yù)先置有蓋玻片(多聚賴氨酸處理過)的6孔培養(yǎng)板中進(jìn)展培養(yǎng)，并參加含bFGF和VEGF的DE/F12培養(yǎng)基進(jìn)展誘導(dǎo)分化，于4、20d后分別用丙酮固定，進(jìn)展免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀察EPs的分化。詳細(xì)步驟如下：3%H22水孵育510in，以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性;滴加封閉用正常山羊血清工作液，室溫孵育1015in，傾去，勿洗;滴加1100的一抗37孵育3h，PBS沖洗(3in3次);滴加兔抗大鼠二抗，37孵育10in，PBS洗(3in3次);滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37孵育10in，PBS沖洗

6、(3in3次)。DAB顯色，顯微鏡下控制顯色時(shí)間，自來水充分沖洗,脫水,透明,中性樹脂封片并鏡檢。2結(jié)果2.1骨髓源性EPs的培養(yǎng)從骨髓別離的細(xì)胞接種于培養(yǎng)基后，約2d開場貼壁，呈梭樣或三角形樣增長，4d后細(xì)胞生長速度開場增快，約10d開場出現(xiàn)集落樣生長狀態(tài)，有梭形細(xì)胞從集落伸出，互相連接成片(圖1)，約1820d細(xì)胞互相交融，呈鋪路石樣狀態(tài)。2.2EPs及Es的細(xì)胞免疫化學(xué)鑒定未加VEGF和bFGF的EPs免疫化學(xué)染色顯示D34陽性反響,培養(yǎng)的部分細(xì)胞外表上帶有均勻的棕色顆粒(圖2A)。培養(yǎng)10d經(jīng)VEGF和bFGF誘導(dǎo)后，部分細(xì)胞vF和eNS染色均呈陽性(圖2B，圖2)。3討論當(dāng)前，和老齡

7、化親密相關(guān)的動(dòng)脈粥樣硬化、腦缺血、心肌缺血、腦梗死和心肌梗死等疾病發(fā)病率日益增高。研究發(fā)現(xiàn)，在這些疾病的恢復(fù)過程中，高齡老化引起機(jī)體血管發(fā)育才能障礙，血管生長因子合成減少，血管內(nèi)皮細(xì)胞功能異常，對細(xì)胞因子的反響力也下降。目前已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究移植EPs治療動(dòng)脈粥樣硬化和腦梗死，增加內(nèi)皮細(xì)胞在這些疾病血液循環(huán)中的發(fā)動(dòng)及增殖，結(jié)果說明內(nèi)皮祖細(xì)胞對治療這兩種疾病有著積極的作用46。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.EPs主要來源于骨髓、外周血、臍血和胚胎，而到目前為止獲取EPs的研究大多集中在從外周血中提取,骨髓來源的EPs研究報(bào)道為數(shù)不多。因此，本實(shí)驗(yàn)的目的就是從骨髓中別離培養(yǎng)大量EPs，使其作為種子細(xì)胞進(jìn)展移

8、植用于缺血性疾病的細(xì)胞替代治療和基因治療。細(xì)胞培養(yǎng)體系中細(xì)胞因子組成成分的不同可影響別離的單個(gè)核細(xì)胞的生長和分化。本研究中應(yīng)用了細(xì)胞因子VEGF和bFGF作為EPs的誘導(dǎo)分化劑。VEGF是一種可以與肝素結(jié)合的高選擇度的促內(nèi)皮細(xì)胞分裂素，可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增生，體外培養(yǎng)中在一定范圍內(nèi)VEGF的濃度和EPS的生長率呈正相關(guān)7。bFGF和VEGF有協(xié)同作用，主要促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和移行，使之增生出毛細(xì)血管樣的構(gòu)造，促進(jìn)新生血管的產(chǎn)生8。兩者的結(jié)合應(yīng)用促進(jìn)了別離的單個(gè)核細(xì)胞向內(nèi)皮系統(tǒng)的生長和分化，證實(shí)了這是一種可行的EPs培養(yǎng)方法。D34抗原是一種表達(dá)于細(xì)胞外表的糖蛋白，隨著幼稚細(xì)胞的分化成熟，其表達(dá)程度逐漸下降，是EPs的標(biāo)志物之一9，本實(shí)驗(yàn)獲得的培養(yǎng)4d的EPsD