1、高效液相色譜法(high performance liquid chromatograph-HPLC)藥物分析教研室1第一頁(yè)，共八十三頁(yè)。 HPLC法以經(jīng)典LC為基礎(chǔ)，引入GC的理論與技術(shù)，并加以改進(jìn)而發(fā)展起來的一種分離分析方法。 是色譜法的一個(gè)重要分支，以液體為流動(dòng)相，用高壓輸液系統(tǒng)，將流動(dòng)相泵入色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣的分析。2第二頁(yè)，共八十三頁(yè)?！臼纠?0-1】現(xiàn)行中國(guó)藥典二部阿司匹林片劑的含量測(cè)定。色譜條件：用十八烷基鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-四氫呋喃-冰醋酸-水（20：5：5：70）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為276 nm。取片劑20片用1%冰醋酸-甲

2、醇溶液精密制成100 mL，精密配制阿司匹林0.l g/L對(duì)照品溶液，分別精密取供試品與對(duì)照品溶液10 L，進(jìn)行測(cè)定。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，即得。3第三頁(yè)，共八十三頁(yè)。HPLC與經(jīng)典LC的比較相同點(diǎn)：均有四種色譜機(jī)理 液固吸附色譜 (HPLSC) 液液分配色譜 (HPLLC) 離子交換色譜 (HPIEC) 凝膠色譜 (HPGPC)4第四頁(yè)，共八十三頁(yè)。不同點(diǎn): LC HPLC 固定相 全多孔 表面多孔型的 無定型 全多孔微粒 粒度 不均勻不耐高壓 均勻耐高壓 操作壓力 常壓、低壓 高壓 柱 效 10-100/m 104 -106 /m 柱 長(zhǎng) 1-2m 10-25cm 柱內(nèi)徑 2-5cm 0.

3、2- 0.5cm 5第五頁(yè)，共八十三頁(yè)。不同點(diǎn): LC HPLC 樣品用量 1-10g 10-6 - 10-2g分析時(shí)間 長(zhǎng) 1-20h 10-幾十min 裝置 間 斷 連續(xù)、自動(dòng)化 非儀器 儀器化 精度低 精度高6第六頁(yè)，共八十三頁(yè)。 10.1 高效液相色譜法類型10.2 常用固定相與流動(dòng)相10.3 高效液相色譜儀10.4 高效液相色譜條件選擇10.5 應(yīng)用與實(shí)例7第七頁(yè)，共八十三頁(yè)。 HPLC特點(diǎn)三高、兩廣、一少 高效化、高速化、高靈敏度分析范圍廣、流動(dòng)相選擇范圍廣樣品用量少色譜柱可反復(fù)使用、流出組分易 收集、安全8第八頁(yè)，共八十三頁(yè)。HPLC類型按實(shí)驗(yàn)?zāi)康?分析型（16：4.6、2.1

4、mm） 制備型（10500mm）按分離機(jī)制9第九頁(yè)，共八十三頁(yè)。按分離機(jī)制10第十頁(yè)，共八十三頁(yè)。HPLC類型反相鍵合相色譜法反相離子抑制色譜法反相離子對(duì)色譜法手性色譜法親和色譜法11第十一頁(yè)，共八十三頁(yè)。 液-固吸附色譜固定相 HPLC固定相主要用硅膠。 （1)無定形全多孔硅膠 ： YWG ( 2)球形全多孔硅膠：YQG (3）堆積硅珠：YQG高分子多孔微球：YSG12第十二頁(yè)，共八十三頁(yè)?；瘜W(xué)鍵合相色譜固定相將固定液的官能團(tuán)鍵合在載體的表面而構(gòu)成化學(xué)鍵合相。以化學(xué)鍵合相為固定相的色譜法稱為化學(xué)鍵合相色譜法(BPC)，簡(jiǎn)稱鍵合相色譜法。 13第十三頁(yè)，共八十三頁(yè)。化學(xué)鍵合相的形成14第十四頁(yè)

5、，共八十三頁(yè)。性能指標(biāo) 1）覆蓋率 指參與反應(yīng)的硅醇基數(shù)目占硅膠表面硅醇基總數(shù)的比例。 覆蓋率的大小決定鍵合相是分配還是吸附占主導(dǎo)。（2）含碳量(C%) 表示鍵合相的鍵合量，與鍵合反應(yīng)及表面覆蓋率有關(guān)。高碳、中碳及低碳型15第十五頁(yè)，共八十三頁(yè)。 特點(diǎn)機(jī)理：吸附&分配 化學(xué)鍵合相色譜法（BPC）化學(xué)鍵合相的優(yōu)點(diǎn)： 使用過程不流失，耐溶劑沖洗 化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，柱子不嬌 熱穩(wěn)定性好 載樣量大 適用于梯度洗脫16第十六頁(yè)，共八十三頁(yè)。 化學(xué)鍵合相的類型全多孔硅膠為基體鍵合相的表面結(jié)構(gòu)： 單分子鍵合 Si-O-C， Si-O-Si-C 聚合鍵合 Si-O-Si-C結(jié)合的化學(xué)鍵類型： Si-O-C、Si-

6、N、Si-C、Si-O-Si-C極性：非極性、中等極性、極性 17第十七頁(yè)，共八十三頁(yè)。 1)非極性鍵合相：表面基團(tuán)為非極性烴基，C18、C8、甲基、苯基等，用作反相色譜的固定相。最常用的非極性鍵合相是十八烷基鍵合相（ODS鍵合相），洗脫劑多為強(qiáng)極性溶劑，如水、醇、乙腈或無機(jī)鹽緩沖液。常用CH3OHH2O作流動(dòng)相，極性大先出峰，極性小后出峰。18第十八頁(yè)，共八十三頁(yè)。反相色譜常用的微粒鍵合相 官能團(tuán) 載 體 顆粒直徑十八烷基 Zorbax 310 um辛 烷 基 Nucleosil 100A 310 um苯 基 m porasil 7 um二甲硅烷 Lichrosorb 310 um 19第十

7、九頁(yè)，共八十三頁(yè)。 2)中等極性鍵合相 常用的有醚基鍵合相，既可作正相又可作反相色譜的固定相，視流動(dòng)相的極性而定。20第二十頁(yè)，共八十三頁(yè)。 3)極性鍵合相常用氨基、氰基鍵合相?？捎米髡嗌V的固定相，洗脫劑常用非極性或弱極性溶劑，加入適量的極性溶劑，以調(diào)節(jié)洗脫強(qiáng)度。極性小的先出峰，極性大的后出峰。21第二十一頁(yè)，共八十三頁(yè)。 正相色譜常用固定相結(jié)構(gòu)氰 基 -(CH2)3C=N氨 基 -(CH2)nNH2 (n=3 or 4)二 醇 -(CH2)3OCH(OH)CH2OH二甲氨基 -(CH2)3N(CH3)2二 氨 基 -(CH2) 3NH(CH2)2 NH2第二十二頁(yè)，共八十三頁(yè)。常用流動(dòng)相

8、及其選擇選擇流動(dòng)相：（1）化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。（2）粘度小。（3）溶劑的純度要高。（4）沸點(diǎn)低（制備型）。（5）與色譜系統(tǒng)的適應(yīng)性好。23第二十三頁(yè)，共八十三頁(yè)。液固色譜流動(dòng)相選擇原則極性大的試樣用極性強(qiáng)的洗脫劑極性小的試樣用極性弱的洗脫劑洗脫劑的極性強(qiáng)弱可用溶劑強(qiáng)度(0)參數(shù)來衡量；分離復(fù)雜試樣，采用梯度洗脫。24第二十四頁(yè)，共八十三頁(yè)。液固色譜中流動(dòng)相的選擇(1) 強(qiáng)溶劑 與硅膠表面活性位置結(jié)合能力強(qiáng)的溶劑，洗脫溶質(zhì)分子的能力也強(qiáng)。(2) 弱溶劑 與硅膠表面活性位置結(jié)合能力弱的溶劑，洗脫溶質(zhì)分子的能力也弱。(3) 結(jié)合能eo eo值越大，溶劑為強(qiáng)溶劑。常用：正已烷、異辛烷、氯仿、異丙醇、乙腈等。

9、(4) eo的特點(diǎn) 溶劑強(qiáng)度與溶劑的體積百分比不成線性關(guān)系。(5) 含水量的控制 通過有機(jī)修飾劑的調(diào)節(jié)，控制硅膠的含水量。25第二十五頁(yè)，共八十三頁(yè)。反相色譜流動(dòng)相注意：A 緩沖離子不能產(chǎn)生沉淀。B 溶劑的紫外切點(diǎn)必須小于所使用的檢測(cè)波長(zhǎng)。C 避免使用鹵族離子。D pH 調(diào)節(jié)在27.5之間。不能超過7.5，否則硅膠將被溶解！26第二十六頁(yè)，共八十三頁(yè)。反相色譜的流動(dòng)相最常用：水、甲醇、乙腈、丙酮、異丙醇、四氫呋喃等。主要組成是水，極性和表面張力最高，最弱的流動(dòng)相，以此洗脫非極性組分時(shí)，表現(xiàn)出的滯留時(shí)間最長(zhǎng)。甲醇和乙腈，是最常用的調(diào)節(jié)劑。（因?yàn)榧状己鸵译娴淖贤馇悬c(diǎn)相對(duì)較低，且粘度較小，及易于提純

10、。）規(guī)律：水量越高，保留時(shí)間越長(zhǎng)。27第二十七頁(yè)，共八十三頁(yè)。規(guī)律組分分子結(jié)構(gòu)對(duì)保留值的影響：組分的保留值與其分子中非極性部分的總表面積越大，保留值也越大。烷基鍵合相的特性對(duì)保留值的影響：隨碳鏈的加長(zhǎng)，組分的保留值增加，對(duì)組分分離的選擇性也增加。流動(dòng)相性質(zhì)對(duì)保留值的影響：流動(dòng)相的表面張力越大、介電常數(shù)越大，其極性越強(qiáng)，流動(dòng)相的洗脫強(qiáng)度越弱，組分的保留值越大。28第二十八頁(yè)，共八十三頁(yè)。正相色譜的流動(dòng)相 正相色譜的流動(dòng)相最常用的是烷烴溶劑。如：正戊烷、正己烷、正庚烷、環(huán)已烷等。 流動(dòng)相的極性越強(qiáng)洗脫能力越強(qiáng)，也就是強(qiáng)溶劑。反之為弱溶液劑。第二十九頁(yè)，共八十三頁(yè)。 第三十頁(yè)，共八十三頁(yè)。液-固色譜

11、的應(yīng)用(1) 主要用于脂溶性化合物的分離：如磷脂、甾體化合物、脂溶性維生素、前列腺素等。(2) 分離幾何異構(gòu)體： 如維生素A的幾何異構(gòu)體。(3)分類分離（族的分離）：從非極性很強(qiáng)的甾醇化合物到極性很強(qiáng)的磷脂酸。一般來講，溶解于有機(jī)溶劑的樣品可得到最佳分離，而強(qiáng)極性或離子型樣品常常得不到令人滿意的結(jié)果。31第三十一頁(yè)，共八十三頁(yè)。反相色譜的應(yīng)用可分離極性到非極性的各種化合物。A 氨基酸、多肽和蛋白質(zhì)的分離。B 堿基、核苷和核苷酸的分離。C 甾體化合物的分離。D 其它：兒茶酚胺、組胺、糖類、維生素、酶等。 32第三十二頁(yè)，共八十三頁(yè)。反相色譜的特點(diǎn)A 適于分離帶有不同疏水基團(tuán)的化合物。B 可通過改

12、變?nèi)軇┙M成和pH，來分離不同極性的化合物。C 可分離從極性到非極性的寬范圍的化合物。33第三十三頁(yè)，共八十三頁(yè)。正相色譜的應(yīng)用正相色譜適用于分離極性化合物。如：酚類、胺類、多環(huán)化合物、染料、炸藥、羥基化合物、氨基酸和藥物等。這些樣品在正己烷或其它烷烴溶劑中的溶解度很小，在極性溶劑中的溶解度良好。用正相色譜分離可得到較好的效果。 在使用正相色譜時(shí)一個(gè)值得注意的問題是在用氨基作固定相分離糖時(shí)，一些還原糖容易與固定相的氨基發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生席夫堿（Schiffsbase)。第三十四頁(yè)，共八十三頁(yè)。10.3 HPLC色譜儀HPLC儀組成主要部件及功能35第三十五頁(yè)，共八十三頁(yè)。 HPLC儀組成高壓輸液

13、系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)36第三十六頁(yè)，共八十三頁(yè)。HPLC 的組成及工作流程 1螺旋注射泵2往復(fù)柱塞泵3往復(fù)隔膜泵4氣動(dòng)放大泵1自動(dòng)進(jìn)樣器2手動(dòng)進(jìn)樣器1液固2液液3離子交換4空間排阻1紫外檢測(cè)器2熒光檢測(cè)器3示差折光檢測(cè)器4電化學(xué)檢測(cè)器5電導(dǎo)檢測(cè)器6放射性檢測(cè)器色譜柱 “心臟”37第三十七頁(yè)，共八十三頁(yè)。38第三十八頁(yè)，共八十三頁(yè)。 主要部件 (一)輸液泵 (二)進(jìn)樣器 (三)色譜柱 (四)檢測(cè)器39第三十九頁(yè)，共八十三頁(yè)。 (一)輸液泵高壓輸液系統(tǒng)泵的類別對(duì)泵的要求泵的保養(yǎng)40第四十頁(yè)，共八十三頁(yè)。1.高壓輸液系統(tǒng) 儲(chǔ)液罐脫氣裝置過濾器高壓輸液泵梯度洗脫裝置壓力脈動(dòng)阻滯器關(guān)

14、鍵41第四十一頁(yè)，共八十三頁(yè)。 2.泵的類別螺旋注射泵往復(fù)柱塞泵往復(fù)隔膜泵氣動(dòng)放大泵42第四十二頁(yè)，共八十三頁(yè)。 3.對(duì)泵的要求流量恒定，精密度高1%輸出壓力高，平穩(wěn)流量范圍寬0.01-10ml/min 制備液相流速較高 耐高壓耐腐蝕泵體易于清洗43第四十三頁(yè)，共八十三頁(yè)。 4.泵的保養(yǎng)如果流動(dòng)相有酸、堿、鹽等緩沖體系，必須用水沖洗。如果壓力過大，混合器可用6mol/L HNO3超聲，再用水超聲。對(duì)儀器的拆卸應(yīng)在儀器負(fù)責(zé)人或廠家工程師的指導(dǎo)下進(jìn)行。觀察有無漏液44第四十四頁(yè)，共八十三頁(yè)。(二)進(jìn)樣針 手動(dòng) 高壓進(jìn)樣閥 注射器進(jìn)樣自動(dòng) 自動(dòng)進(jìn)樣器 圓盤式自動(dòng)進(jìn)樣器 鏈?zhǔn)阶詣?dòng)進(jìn)樣器45第四十五頁(yè)，

15、共八十三頁(yè)。六通閥手動(dòng)進(jìn)樣器 46第四十六頁(yè)，共八十三頁(yè)。 （Load） （Inject） 47第四十七頁(yè)，共八十三頁(yè)。48第四十八頁(yè)，共八十三頁(yè)。 (三)色譜柱色譜柱由柱管和固定相組成。對(duì)柱的要求: 承受高壓、對(duì)流動(dòng)相呈化學(xué)惰性、對(duì)樣品的Rs大柱容量大、分析速度快49第四十九頁(yè)，共八十三頁(yè)。 1.色譜柱尺寸2.色譜柱的裝填3.色譜柱柱效的評(píng)價(jià)4.色譜柱的保養(yǎng)5.柱溫箱50第五十頁(yè)，共八十三頁(yè)。1. 色譜柱尺寸分析型： 5mm或4.6mm制備型：5mm以上微徑柱： 2mm柱長(zhǎng)：1025cm，30cm很少見柱體：直型優(yōu)質(zhì)不銹鋼柱管51第五十一頁(yè)，共八十三頁(yè)。2.色譜柱的裝填1)方法 干法裝柱、勻

16、漿法裝柱 2)裝柱要求 均勻緊密、不破壞顆粒、不形成裂縫 、顆粒粗細(xì)不可分級(jí)52第五十二頁(yè)，共八十三頁(yè)。3.色譜柱柱效的評(píng)價(jià)最小理論塔板數(shù) n104分離度R1.5拖尾因子 相對(duì)保留值的再現(xiàn)性53第五十三頁(yè)，共八十三頁(yè)。4. 色譜柱的保養(yǎng)注意流動(dòng)相的純化防止堵塞和污染柱的操作壓力裝填柱的壓力應(yīng)該用進(jìn)樣閥進(jìn)樣防止柱的反沖貯存色譜柱時(shí)應(yīng)防止干涸使用保護(hù)（預(yù)）柱54第五十四頁(yè)，共八十三頁(yè)。5. 柱溫箱采用循環(huán)空氣浴周圍環(huán)境要保持恒定55第五十五頁(yè)，共八十三頁(yè)。(四) 檢測(cè)器對(duì)檢測(cè)器的要求檢測(cè)器分類56第五十六頁(yè)，共八十三頁(yè)。 1.對(duì)檢測(cè)器的要求靈敏度高噪音低線性范圍寬重復(fù)性好適用化合物的種類廣57第五

17、十七頁(yè)，共八十三頁(yè)。2.檢測(cè)器分類選擇性檢測(cè)器 組分性質(zhì)檢測(cè)器 通用型檢測(cè)器 總體性檢測(cè)器58第五十八頁(yè)，共八十三頁(yè)。 紫外( UVD )選擇性檢測(cè)器 熒光(FD) 電化學(xué)(ECD)59第五十九頁(yè)，共八十三頁(yè)。 通用型檢測(cè)器蒸發(fā)激光散射檢測(cè)器(ELSD)示差折光檢測(cè)器(RID)質(zhì)譜檢測(cè)器(MS)60第六十頁(yè)，共八十三頁(yè)。 (1)紫外檢測(cè)器(UVD) 1)原理：被測(cè)組分對(duì)指定波長(zhǎng)的紫外光的選擇性吸收 固定波長(zhǎng)型2)類型 可變波長(zhǎng)型 掃描型 光電二極管陣列(DAD)61第六十一頁(yè)，共八十三頁(yè)。 3)特點(diǎn):靈敏度高、噪音低；不破壞樣品、能與其他DET串聯(lián)，可用于制備 ；對(duì)溫度及流動(dòng)相流速波動(dòng)不敏感，

18、可用于梯度淋洗4)弱點(diǎn):只能檢測(cè)有UV吸收的樣品；流動(dòng)相的選擇有一定的限制62第六十二頁(yè)，共八十三頁(yè)。(2)蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD) 1)原理：粒子對(duì)光的散射2)組成：噴嘴、漂移管、光電管3)定量依據(jù)：E=Kmn63第六十三頁(yè)，共八十三頁(yè)。(3)熒光檢測(cè)器1)原理：物質(zhì)分子的熒光吸收2)優(yōu)點(diǎn)：固有的靈敏度和選擇性3)缺點(diǎn)：應(yīng)用不廣泛64第六十四頁(yè)，共八十三頁(yè)。(4) 其他檢測(cè)器示差折光檢測(cè)器(RID)電化學(xué)檢測(cè)器(ECD)紅外檢測(cè)器介電常數(shù)檢測(cè)器放射性檢測(cè)器 MS檢測(cè)器 NHM檢測(cè)器65第六十五頁(yè)，共八十三頁(yè)。高效液相色譜條件選擇1、柱內(nèi)展寬 渦流擴(kuò)散項(xiàng)A縱向擴(kuò)散項(xiàng)B/u 提高柱效方法流動(dòng)

19、的流動(dòng)相的傳質(zhì)阻力項(xiàng)Csmu 靜態(tài)流動(dòng)相的傳質(zhì)阻力項(xiàng)Csmu 固定相的傳質(zhì)阻力項(xiàng)Csu 2. 柱外展寬提高柱效方法66第六十六頁(yè)，共八十三頁(yè)。選擇流動(dòng)相溶劑的原則k2的大小主要取決于流動(dòng)相溶劑的極性主要取決于流動(dòng)相溶劑的選擇性改善分離度的方法 67第六十七頁(yè)，共八十三頁(yè)。實(shí)驗(yàn)條件對(duì)分離的影響A 溫度：反相色譜流動(dòng)相當(dāng)為含有機(jī)溶劑的水溶液時(shí)，粘度較高，最好在較高柱溫下操作，以減少粘度，柱溫一般在30400C。最高可達(dá)800C。B pH 值：對(duì)于可溶解的組分，改變流動(dòng)相 pH 值，可以改變分離的選擇性，采用一定 pH 值的緩沖溶液作流動(dòng)相，可以抑制組分的離解。減少峰的拖尾。68第六十八頁(yè)，共八十三

20、頁(yè)。 注意流動(dòng)相：物理性質(zhì)極性選擇性使用前處理69第六十九頁(yè)，共八十三頁(yè)。 物理性質(zhì)（1） 對(duì)檢測(cè)器的適應(yīng)性（2） 溶劑的粘度和沸點(diǎn)（3） 溶解特性70第七十頁(yè)，共八十三頁(yè)。 流動(dòng)相的物理性質(zhì)（1） 對(duì)檢測(cè)器的適應(yīng)性： 示差折光檢測(cè)器：流動(dòng)相的折射率與樣品折射率有差別。折射率差別越大檢測(cè)器的靈敏度越高。 紫外檢測(cè)器：必須選擇紫外切點(diǎn)小于檢測(cè)器波長(zhǎng)的溶劑作流動(dòng)相。 熒光檢測(cè)器：流動(dòng)相的紫外切點(diǎn)必須小于檢測(cè)器所使用的激發(fā)光波長(zhǎng)，流動(dòng)相不能引起熒光淬滅。71第七十一頁(yè)，共八十三頁(yè)。流動(dòng)相的物理性質(zhì)（2） 溶劑的粘度和沸點(diǎn)：溶劑的粘度影響色譜分析的分辨率：在色譜分析中盡量選擇粘度小的溶劑，提高分辨率。

21、但溶劑的粘度小往往沸點(diǎn)也低，容易揮發(fā)，在色譜過程中容易產(chǎn)生氣泡，干擾檢測(cè)器的工作；在使用兩種不同溶劑的混合物做流動(dòng)相時(shí)，還容易改變不同溶劑的比例，降低分析結(jié)果的重現(xiàn)性。因此沸點(diǎn)過低的溶劑不適宜做流動(dòng)相，流動(dòng)相的沸點(diǎn)至少應(yīng)比色譜分析的溫度高30度。72第七十二頁(yè)，共八十三頁(yè)。 如：乙醇的價(jià)格雖低，但粘度較大沸點(diǎn)略高；甲醇的粘度較小沸點(diǎn)最低，價(jià)格適中；乙腈的粘度最小沸點(diǎn)較低，但價(jià)格較高；在HPLC中常用甲醇作流動(dòng)相。73第七十三頁(yè)，共八十三頁(yè)。 流動(dòng)相的物理性質(zhì)（3） 溶解特性： HPLC 要求組成流動(dòng)相的溶劑彼此能夠互相溶解。74第七十四頁(yè)，共八十三頁(yè)。75第七十五頁(yè)，共八十三頁(yè)。 溶劑的極性 溶劑的極性：溶劑分子與溶質(zhì)分子間的相互作用能力的大小。 這種能力是色散力、偶極距作用、氫鍵作用及介電的相互作用。這四種力作用的總和越大，溶劑的極性越強(qiáng)。76第七十六頁(yè)，共八十三頁(yè)。 使用前的處理（1） 溶劑常用分析純或HPLC級(jí)。水要用超純水或去離子的雙蒸餾水