1、血型分子診斷技術(shù)進(jìn)展與應(yīng)用1主要內(nèi)容紅細(xì)胞血型系統(tǒng)分子診斷紅細(xì)胞血型系統(tǒng)分子基礎(chǔ)ABO血型系統(tǒng)Rh血型系統(tǒng)H血型系統(tǒng)(類孟買型) 紅細(xì)胞血型系統(tǒng)分子診斷技術(shù)及其應(yīng)用小結(jié)2有關(guān)分子生物學(xué)概念點(diǎn)突變同義突變無(wú)義突變有義突變起始密碼突變?nèi)笔Р迦胫嘏?有關(guān)分子生物學(xué)概念基因結(jié)構(gòu)異?；虮磉_(dá)異常點(diǎn)突變插入缺失易位和重排拷貝數(shù)擴(kuò)增DNA多態(tài)性基因的檢測(cè)4常見突變示意圖ATG CGG TAG CGT AGT CTGATG CGA TAG CGT AGT CTGATA CGG TAG CGT AGT CTGATG CGGG TAG CGT AGT CTGATG CG TAG CGT AGT CTG5新等位基因形

2、成6紅細(xì)胞血型系統(tǒng)40個(gè)基因1250個(gè)等位基因(截止2012年5月12日)參見Blood Group Antigen Gene Mutation Database7紅細(xì)胞血型分子機(jī)制點(diǎn)突變同義突變、無(wú)義突變、 有義突變、起始密碼突變、拼接接受位點(diǎn)插入缺失基因重組（RHD/RHCE）基因部分重復(fù)8ABO血型分子生物學(xué)研究1990年Yamamoto等首次克隆基因定位于染色體9q34ABO基因cDNA，其分子量為41,000 Dalton，DNA長(zhǎng)度為1062bpABO血型系統(tǒng)為三復(fù)等位基因，有A、B、O三個(gè)基因ABO基因包括7個(gè)外顯子，長(zhǎng)度大于18kb大多數(shù)編碼序列位于第6和7外顯子9ABO基因示

3、意圖10常見等位基因A和B基因 編碼的蛋白都是353個(gè)氨基酸，O基因編碼的蛋白只有 115個(gè)氨基酸A101、A102、B101、O01、O02A101作為參考序列A102等位基因 C467T(Pro-Leu)B101基因在297、526、657、703、796、803、930、1096位有8個(gè)核苷酸與A101基因不同但只有526、703、796、803四個(gè)核苷酸的變化造成了氨基酸序列的變化（A101依次是精氨酸、甘氨酸、亮氨酸和甘氨酸，B101依次是甘氨酸、絲氨酸、蛋氨酸和丙氨酸）O01基因在261位的G缺失,提前終止11ABO亞型頻率分布ABO血型中存在ABO亞型臨床輸血和獻(xiàn)血者檢測(cè)中常見4

4、40617份A亞型22份AxB 11例，AelB 3例，Ax 3例，Ael 2例，Amh 2例，A3 1例B亞型41份Bx11例，B39例，ABx7例，AB3 5例，Bel3例，Bm 2例，ABel 1例，ABend 1例，ABm 1例，Bend 1例。B(A)1例CisAB2例A2 14例A2B 35例引自中國(guó)輸血雜志2006，19（1）：2512ABO亞型的分子研究通過(guò)檢測(cè)261、526、703、796、803位的核苷酸可以確認(rèn)大多數(shù)典型的ABO血型的基因型近年來(lái)對(duì)血清學(xué)分類的ABO血型亞型抗原，應(yīng)用PCR、DNA測(cè)序等技術(shù)，在核苷酸和酶蛋白氨基酸序列水平上進(jìn)行研究結(jié)果表明：原為同一亞型的

5、抗原存在異質(zhì)性，即血清學(xué)上同一亞型，在核苷酸和酶蛋白氨基酸序列水平上有可能存在差異。幾個(gè)位點(diǎn)以外的核苷酸變化引起的ABO血型亞型常會(huì)引起檢測(cè)結(jié)果的偏差發(fā)現(xiàn)的等位基因數(shù)為290個(gè)（2012年05月22日）13A等位基因可簡(jiǎn)要分為7大類等位基因A1、A2、A3、Ax、Ael、Aw、AmA101等位基因序列作為參照標(biāo)準(zhǔn)A102(C467T)（在中國(guó)人群中比例大于A101)A103(C467T,C564T)A104(A297G)A105(A297G,B-O1重組)A106(B-O02重組)A205(A1009G )14B等位基因型可簡(jiǎn)要分為5大類等位基因B1、B3、Bx、Bel、BwB等位基因中297

6、、703、796、803位基本恒定B101-B118B101:A297G;C526G;C657T;G703A;C796A;G803C;G930A;G1096AB301-B308B301:A297G,C526G,C657T,G703A,C796A, G803C, G930A, G1096A, C1054T15O等位基因O01O74 大多數(shù)261nt缺失，13個(gè)261nt不缺失O01:261delGO02:261delG、T646A、G681T、C771T、G829A人群中常見003:261G、A297G,C526G,G802AO5016CisAB和B(A)等位基因CisAB01-06CisAB0

7、1:C467T,G803CCisAB02:C526G,C657T,G703A,G803C,B(A)01-06B(A)型單克隆試劑應(yīng)用于臨床后，抗A試劑偶爾與原定為B型的紅細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)，這類含有大量B抗原極少A抗原的紅細(xì)胞稱之為B(A)型B(A)01:A297G,C526G, 796A,G803C,G930A,G1096AB(A)02:A297G,C526G,C657T,C700G,G703A, C796A,G803C,G930A,G1096A17實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)的ABO等位基因A208 allele* C467T; G539CA210 allele* 268TC;467CT A211 allele*

8、 266CT;467CT B112 allele* 297AG; 526CG; 559CT;657CT; 703GA; 796CA; 803GC;930GA B305 allele* 297AG; 425TC; 526CG; 657CT; 703GA; 796CA; 803GC; 930GA B307 allele* 297AG; 410CT; 526CG; 657CT; 703GA; 796CA; 803GC; 930GA Bw12 allele* C278TCisAB05 allele* A297G; C526G; C657T; G703A; C 796A; G930A O61 allel

9、e* 261del 743C18ABO基因診斷PCR-SSPPCR-RFLPPCR-SSOPCR-SSCPPCR-SBT261G干擾正反定型不一致19ABO亞型分子機(jī)制和診斷凝集強(qiáng)度改變正反定型不一致點(diǎn)突變?yōu)橹鱌CR-SSP261GPCR-SBTSNP(單核苷酸多態(tài)性)20ABO亞型分子機(jī)制和診斷PCR-SBT常見為6-7外顯子擴(kuò)增雙向測(cè)序存在風(fēng)險(xiǎn)：擴(kuò)增引物SNP多態(tài)性位點(diǎn)在其它位置其它機(jī)制：表觀遺傳、其它21ABO亞型分子機(jī)制和診斷PCR-SBT1-7外顯子擴(kuò)增技術(shù)和策略全長(zhǎng)18kb一般3對(duì)引物以上外顯子上的突變ATG位置突變其它機(jī)制？22ABO亞型分子機(jī)制和診斷基層實(shí)驗(yàn)室如何有效獲取信息血

10、清學(xué)結(jié)果家系分析保存抗凝全血-20以下尋求分子診斷實(shí)驗(yàn)室?guī)椭?3Rh血型基因基因位于1號(hào)染色體短臂上，即1P3436兩個(gè)基因：RHD編碼D抗原，RHCE編碼CcEe抗原RHD和RHCE基因同源性高達(dá)96%以上RHD和RHCE基因均有10個(gè)外顯子24RHD基因第1、2、8、10外顯子的編碼序列與RHCE的相對(duì)應(yīng)序列相同RHD基因第3、4、5、6和第9外顯子序列與RHCE基因有區(qū)別兩個(gè)RH基因緊密連鎖，相隔30000bp兩個(gè)基因的3末端面對(duì)面兩個(gè)基因之間有一個(gè)獨(dú)立的基因SMP1RHD和RHCE兩個(gè)基因之間以及外側(cè)分別有1個(gè)Rhesus盒SMP1基因距中間一個(gè)Rhesus盒下游僅15bp25RHCE

11、和RHD基因組成示意圖1p34-p3626Rh血型等位基因RHAGRHDRHCE突變和缺失、基因轉(zhuǎn)換、基因重組RHD 218RHCE 104RHAG 2327RHD等位基因RhD陽(yáng)性正常RhD陽(yáng)性弱D(weak D)部分D(partial D)DelRhD陰性RHD基因缺失RHD基因功能喪失28部分弱D的分子突變點(diǎn)RHD weak D type 1 T809GRHD weak D type 1.1 C5G; T809GRHD weak D type 2 G1154ARHD weak D type 3 C8GRHD weak D intron 55A intron3 5 G5ARHD weak

12、D type33 (Taiwan1) G520ARHD weak D type Taiwan2 T809ARHD weak D type 51 A594T; C602GRHD weak D type 52 92TC RHD weak D type 53 T740G分子機(jī)制堿基突變?nèi)笔RNA拼接位點(diǎn)變異29部分D分子機(jī)制Partial D 發(fā)現(xiàn)等位基因70多個(gè) - RHD Va 2 T667G;G697C;G712A; G1273C RHD Va 3 G697A RHD Va 4 hybrid D(1-4) CE5 D(6-10)RHD VI type I hybrid (D1-3) CE(4

13、, 5) D(6-10)RHD VI type II hybrid D(1-3) CE(4-6) D(7-10)RHD VI type III hybrid D(1, 2) CE(3-6) D(7-10)RHD VI type IV hybrid D1 Ce(2/3-5) D(6-10)分子機(jī)制基因交換RHD-CE-D點(diǎn)突變30部分D分子機(jī)制示意圖31Del分子機(jī)制Del（D elution）亞洲人群常見RHD DEL (Cde)1 intron 3 G1ARHD DEL (Cde)2 G885TRHD DEL (Cde)3 intron 9 G1A; G1227ARHD DEL (Cde)4

14、 intron 5 38delCTCTRHD DEL (Cde)5 1252insTRHD DEL (Cde)6 T1203ARHD Del (Cde)7 G3ARHD Del (Cde)8 C28TRHD Del(Cde)9 T53CRHD Del(Cde)10 T251CRHD DEL T1222CRHD Del intron 8-9: del 1013RHD DEL exon8 del 995nt including 3intron7+exon8+5intron832RhD陰性的機(jī)制不同Rh陰性表現(xiàn)型頻率不同RHD陰性的可能機(jī)制RHD基因缺失RHD基因發(fā)生改變RHD-CE-D融合基因RH

15、D基因的第3到9外顯子被RHCE基因取代RHD陰性個(gè)體中約1/3具有完整的RHD基因非洲D(zhuǎn)陰性個(gè)體具有RHD（假基因）33RHCE等位基因RHCE等位基因104個(gè)正常RHCERHce 48C RHCE G48CRHCE(1)D(2-10) RHCE(1)D(2-10) RHCE D-Chinese RH(D1-9CE10) RH(CE1 D2-7 CE8-10) hybrid CE(1)D(2-7) CE(8-10) RHCE 685-687del 685-687delAGA RHCE null amorph 2 Intron 4: G1T34 9例弱D樣本RHD 845A 5例（RHD we

16、ak D type 15）RHD 1227A 3例（D-el (CDe); minimal expression of D antigen; ）RHD 1013C 1例（RHD weak D type 24）10例部分D樣本Dva(Kou) 1例Dva(Hus) 1例DVa-like(YH) 1例DVI type III 7例Molecular basis of D variants in Chinese persons. Transfusion. 2007;47(3):471-7 本實(shí)驗(yàn)室部分檢測(cè)結(jié)果Rh表型 樣本量 RHD+/RHD+ RHD+/RHD- RHD-/RHD- RhD陽(yáng)性19

17、8186（93.94%）12（6.06%）0（0）Weak D323（9.37%）29（93.63%）0（0）RhD陰性 20810（4.81%） 53（25.48%） 145（69.71%） 35RHD血型分子診斷RhD陰性多重PCR技術(shù)FQ-PCRPCR-RFLPD VariantPCR-SSP測(cè)序技術(shù)36RHD血型分子診斷分子機(jī)制復(fù)雜RhD陰性分子機(jī)制基因交換RHD-CE-D疑難標(biāo)本單一技術(shù)難以判定多種技術(shù)并存血清學(xué)結(jié)果37H血型系統(tǒng)H抗原與ABO血型，Lewis血型密切相關(guān)，屬于Hh血型系統(tǒng)（ISBT018）38其它血型系統(tǒng)血清學(xué)特性分子機(jī)制點(diǎn)突變基因重組PCR-SSP基因芯片39其它

18、血型系統(tǒng)罕見表型血清學(xué)特性基因定位測(cè)序技術(shù)體外表達(dá)40紅細(xì)胞血型系統(tǒng)分子診斷技術(shù)的應(yīng)用紅細(xì)胞血型的診斷人群遺傳的分析譜細(xì)胞血型的診斷罕見表型分子機(jī)制研究疑難血型的判斷多次輸血后的血型檢測(cè)產(chǎn)前血型的診斷41紅細(xì)胞血型系統(tǒng)分子診斷技術(shù)的應(yīng)用罕見表型多次輸血病人ABO、RhD血型的不一致RhD變異體弱表達(dá)的基因情況RHD雜合度篩選稀有系統(tǒng)（抗體缺乏）譜細(xì)胞42紅細(xì)胞血型中采用的技術(shù)PCR-RFLPPCR-SSP多重PCR技術(shù)PCR-SBTPCR-SSCPPCR-RQ基因芯片方法的優(yōu)缺點(diǎn)與血清學(xué)方法的比較43紅細(xì)胞血型系統(tǒng)基因分型技術(shù) PCR-RFLP(限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性)通過(guò)PCR擴(kuò)增出包含突變位

19、點(diǎn)的特定片段利用限制性內(nèi)切酶消化片段經(jīng)凝膠電泳不同的片斷大小檢測(cè)便能確認(rèn)基因型方法特性操作較簡(jiǎn)單酶切過(guò)程需要控制44PCR-RFLP復(fù)合PCR-RFLP技術(shù)檢測(cè)ABO基因型.中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志,1999年第2期 復(fù)合PCR 技術(shù)在ABO 血型基因分型中的應(yīng)用,北京醫(yī)學(xué)2007 年第29 卷第2 期45PCR-SSP利用3堿基特性分別設(shè)計(jì)一系列序列特異性引物直接擴(kuò)增出目的基因片段通過(guò)凝膠電泳觀察方法特性簡(jiǎn)單快捷易于操作基于已知序列4647PCR-SSCP選擇性擴(kuò)增基因片段加熱或用變性劑解開DNA雙鏈由于等位基因的核苷酸順序的不同，二級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生差異在聚丙烯酰胺凝膠電泳中電泳遷移率不同分析電泳帶型即可區(qū)別開等位基因484950DNA測(cè)序法通過(guò)PCR擴(kuò)增基因的主要片段，然后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行序列分析測(cè)定，分析發(fā)生突變的堿基便可確認(rèn)血型血型及其亞型的分子基礎(chǔ)本方法結(jié)果準(zhǔn)確可靠需要特殊的儀器設(shè)備操作煩瑣，成本高51測(cè)序技術(shù)測(cè)序技術(shù)雙脫氧終止法化學(xué)降解法高通量測(cè)序52Partial sequence in exon 6O01 alleleBw12 alleleA novel allele53基因芯片技術(shù)2005年Transfusion 45(5):654-9 Transfusion 45(5):667-679高通量同時(shí)分析多個(gè)系統(tǒng)多個(gè)位點(diǎn)(等位基因）