1、蛋白質(zhì)研究的其他方法（2）張雪梅醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系 基因的功能研究成為熱點(diǎn)，研究的對象即為基因編碼的產(chǎn)物蛋白質(zhì)，生物功能的主要體現(xiàn)者和執(zhí)行者。 在所有生命活動中，細(xì)胞接受外源或是內(nèi)源的信號，通過其特有的信號途徑，調(diào)節(jié)其基因的表達(dá)，以保持其生物學(xué)特性，這其中必須涉及蛋白與蛋白、核酸的相互作用。 掌握或發(fā)明研究相互 作用的方法非常重要。主要內(nèi)容酵母雙雜交系統(tǒng)：蛋白（X）蛋白Pulldown：蛋白蛋白，蛋白DNA免疫共沉淀(IP)：蛋白蛋白，蛋白DNA電泳遷移實(shí)驗(yàn)(EMSA)：蛋白DNA一、酵母雙雜交系統(tǒng)yeast two-hybrid system酵母雙雜交技術(shù)的原理酵母雙雜交系統(tǒng)的組成酵母雙雜交技術(shù)的應(yīng)

2、用酵母雙雜交技術(shù)的特點(diǎn)酵母雙雜交技術(shù)的改進(jìn)其它酵母雜交技術(shù)酵母雙雜交系統(tǒng)建立的基礎(chǔ)真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子： DNA結(jié)合域： DNA binding domain, BD 轉(zhuǎn)錄激活域： Activation domain, ADFirst Two-hybrid System酵母雙雜交系統(tǒng)的組成與BD融合的蛋白表達(dá)載體，表達(dá)的蛋白稱誘餌蛋白(bait) 與AD融合的蛋白表達(dá)載體，表達(dá)的蛋白稱靶蛋白(prey或target) 帶報(bào)告基因(report gene)的宿主細(xì)胞例：用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與NifA相互作用的蛋白質(zhì)?？茖W(xué)通報(bào)，2005，50（6）：540-545采用的酵母雙雜合系統(tǒng)：酵母細(xì)胞：S.

3、 cerevisiae PJ69-4A （clontech公司）含有3個報(bào)告基因: ade2、his3和lacZ，其中ade2基因表達(dá)最為嚴(yán)謹(jǐn)，his3和lacZ的表達(dá)相對松弛。兩個載體pGBD（誘餌）和pGAD（靶蛋白）分別含報(bào)告基因trp和leu。實(shí)驗(yàn)步驟：含nifA的誘餌質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 將重組質(zhì)粒pGBD-nifA轉(zhuǎn)入釀酒酵母PJ69-4A中, 鋪于SD/-Trp, SD/-Trp/-Ade, SD/-Trp/-His+3-AT及SD/-Trp +X-Gal+BU平板上, 30培養(yǎng)25 d. pGBD-nifA轉(zhuǎn)化子在SD/-Trp和SD/-Trp+X-Gal+BU平板上有正常的菌落長

4、出, 但在X-Gal存在下不呈現(xiàn)藍(lán)色, 而在SD/-Trp/-Ade和SD/-Trp/-His+3-AT平板上沒有菌落長出, 延長培養(yǎng)時間, 仍然呈陰性結(jié)果. 這說明誘餌質(zhì)粒pGBD-nifA不能自動激活報(bào)告基因的表達(dá), 對宿主菌也沒有毒性作用, 因此pGBD-nifA可以用作誘餌質(zhì)粒. 巴西固氮螺菌Sp7基因文庫的構(gòu)建 提取巴西固氮螺菌Sp7的染色體DNA, 用Sau3A酶切后回收0.53 kb的DNA片段； 然后與經(jīng)BamH酶切的3個酵母雙雜合系統(tǒng)的質(zhì)粒載體pGAD1-C1, pGAD-C2及pGAD-C3分別進(jìn)行連接(以確保外源片段的正確閱讀), 則構(gòu)建成3個質(zhì)粒文庫, 分別命名為YSP

5、C1, YSCP2和YSCP3。 再轉(zhuǎn)化：將這109個純化后的質(zhì)粒分別與誘餌質(zhì)粒pGBD-nifA再次共轉(zhuǎn)化釀酒酵母, 在選擇性平板上進(jìn)行鑒定, 結(jié)果表明, 只有11個組合可以同時激活3個報(bào)告基因的表達(dá)。陽性克隆的序列鑒定及相互作用鑒定測序：結(jié)果表明這11個克隆屬于4個蛋白基因：其中2個含有與轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控有關(guān)的PAS結(jié)構(gòu)域，另外1個基因片段含有與鐵吸收有關(guān)的fhuE基因，另一個是未知蛋白。相互作用鑒定：載體互換實(shí)驗(yàn)和移碼質(zhì)粒構(gòu)建實(shí)驗(yàn)。已知NifA與P蛋白(glnB基因產(chǎn)物)有直接相互作用，但本次篩選的陽性克隆中并沒有該基因。（原因：可能是由于我們在用Sau3A酶切而構(gòu)建基因文庫時, 由于gln

6、B基因(編碼區(qū)只有336 bp)周圍沒有合適的Sau3A酶切位點(diǎn)而沒有被包括進(jìn)去）AdvantagesNo antibodies requiredProtein purification not necessary Direct identification of DNA sequence of interacting proteinIn vivo protein in native conformation ?more sensitive than biochemical methods（1mmol/L ）Detect low-affinity or transient interactio

7、nsDisadvantagesNeed construct gene libraryFalse negatives: Has failed to detect some known interactions, post-translational modification, non-nuclear interactionFalse positives can be a problem：self-activation, similar motif酵母雙雜交技術(shù)的改進(jìn)采用多個報(bào)告基因以減少假陽性 采用單倍體酵母的接合以提高轉(zhuǎn)化效率 采用不同的靶蛋白表達(dá)載體以適應(yīng)不同需要 雙報(bào)告基因三報(bào)告基因單倍體

8、酵母的接合酵母的有性繁殖：a接合型和接合型, 二者接合能形成二倍體。不同的靶蛋白表達(dá)載體按轉(zhuǎn)錄激活活性的大小排列（AD）: VP16 Ga14 region B42B42能消除強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活化子對酵母細(xì)胞的毒性，從而提高對靶蛋白的篩選范圍。三雜交系統(tǒng)蛋白質(zhì)（1）蛋白質(zhì)三雜交系統(tǒng)、激酶三雜交系統(tǒng)。（2）三雜交系統(tǒng)小配體（篩尋小分子藥物的作用蛋白）12單雜交系統(tǒng)（篩尋與已知DNA結(jié)合的蛋白）AD融合基因文庫已知DNA序列及下游報(bào)告基因的誘餌質(zhì)粒插入酵母染色體基因組中（即誘餌序列與報(bào)告基因融合在一起）。反向雙雜交系統(tǒng)用途：1、鑒定抑制蛋白質(zhì)相互作用的小分子。2、篩選阻斷蛋白質(zhì)相互作用的小肽類藥物。 核外雙

9、雜交系統(tǒng)細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)周期短、文庫容量大二、Pull-down實(shí)驗(yàn)（in vitro）用途： 1.鑒定兩個已知蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用 2.篩選與已知融合蛋白相互作用的未知蛋白質(zhì)原理：利用GST、HIS等標(biāo)簽蛋白將一種蛋白質(zhì)（誘餌蛋白）固定于某種基質(zhì)上(如Sepharose)，當(dāng)細(xì)胞抽提液經(jīng)過該基質(zhì)時，可與該固定蛋白相互作用的配體蛋白被吸附，通過改變洗脫液或洗脫條件即可回收所吸附的蛋白。 洗脫（2）結(jié)合（3）檢測（6）收集（5）洗脫（4）固定誘餌蛋白（1）The Polymeric Immunoglobulin ReceptorTranslocates Pneumococci across

10、Human Nasopharyngeal Epithelial Cells. Cell, 2000, 102:827837（鑒定）polymeric immunoglobulin receptor (pIgR)CbpA The hpIgR-mediated bacterial adherence and invasion were abolished by either insertional knockout of cbpA or antibodies against either hpIgR or CbpA.methods蛋白表達(dá)：Expression of CbpA Polypeptid

11、es (6His）Pulldown：Affinity Purification of the CbpA Binding Proteins鑒定：Proteins in the fractions were analyzed by SDSand IB，and N-Terminal Sequencing of the CbpA Binding ProteinsrCbpA Covalently conjugated to 1 ml of Affi-Gel 15 (BioRad) in 0.1 M MOPS (pH 7.5) at 4；The column was sequentially washed

12、 with washing buffer；Detroit cells surface proteins were labeled with Sulfo-NHS-LC-biotin； Cell lysates were prepared in a buffer containing protease inhibitors； Cellular debris was removed by centrifugation at 4 The supernatant was recycled through the CbpA1-affinity column for 4 h at 4；washing the

13、 column with washing buffer； the bound proteins were eluted in 300 ml fractions with 100mM glycine-HCl (pH 2.5)。Pulldown鑒定cbpA與hplgR結(jié)合的區(qū)段 Vncs為S.pn的另一種膜蛋白，hSC為表達(dá)hplgR的MDCK細(xì)胞，Neo為不表達(dá)hplgR的MDCK細(xì)胞。Laminin receptor initiates bacterial contact with the blood brain barrier in experimental meningitis model

14、s. J Clin Invest. 2009,119:163846.（鑒定、篩選）腦膜炎：腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(BBB, BCEC）CbpA層粘連蛋白受體（ Laminin receptor ，LR）N. meningitidis PilQ and PorA、OmpP2 of H. influenzae.已知：PulldownWestern blot未知：PulldownMALDI-TOFPulldown的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：靈敏、周期短、不需要構(gòu)建基因文庫都采用純化蛋白進(jìn)行實(shí)驗(yàn)可鑒定直接相互作用缺點(diǎn)：需要表達(dá)純化蛋白體外相互作用（假陽性、假陰性）篩選時需要大量細(xì)胞pull down實(shí)驗(yàn)篩選SDS PAG

15、E鑒定 Lane 1 cbpA表達(dá)全菌， Lane 2 鼻咽癌細(xì)胞裂解液， Lane 3 Pull down純化大柱穿透液， Lane 4 Pull down spin columun柱穿透液1 ，Lane 5 Pull down spin columun柱穿透液2， Lane 6 pull down篩檢結(jié)果，Lane 7 pull down 對照結(jié)果. DNA Pull-down實(shí)驗(yàn)應(yīng)用：主要用于篩選鑒定與目的DNA片段相互作用的蛋白質(zhì)（轉(zhuǎn)錄因子類）方法：與蛋白相互作用的pull down類似，只是固定于色譜柱或磁珠上的為標(biāo)記的DNA片段，其他步驟一樣。優(yōu)缺點(diǎn)：相較于酵母單雜交，其無需構(gòu)建基

16、因文庫、操作較簡便、周期短。缺點(diǎn)與蛋白pulldown一樣。A subset of replication proteins enhances origin recognition and lytic replication by the Epstein-Barr virus ZEBRA protein. PLoS Pathog. 2010, 6(8)In vivo DNA pull down共孵育：BZKO cells were transfected with expression vectors for the indicated forms of ZEBRA together with

17、 Biotinylated oligomers containing one of 3 regulatory regions. Pull down：The Biotinylated probes were purified from cell lysates using avidin beads. IB：The amount of ZEBRA bound to each probe and the total amount of ZEBRA present in each lysate were assessed by western blot analysis. 檢測DNA結(jié)合的蛋白量A:

18、upstream region of oriLyt BURB: a short region of Rp BRpS C: full length Rp BRpL Chip檢測（蛋白結(jié)合的DNA量）用途：鑒定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合，結(jié)合位點(diǎn)分析；篩選一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。原理： 當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質(zhì)x的抗體免疫沉淀x，那么與x在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)y也能沉淀下來。三、免疫共沉淀（in vivo）Co-Immunoprecipitation，Co-IP優(yōu)點(diǎn)：相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)；蛋

19、白的相互作用是在自然狀態(tài)下進(jìn)行的，可以避免人為的影響。缺點(diǎn)：需要高質(zhì)量的抗體進(jìn)行IP；兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者在中間起橋梁作用；檢測不到弱或瞬時的相互作用。Co-IP工作示意圖Co-immunoprecipitationbindingwashelutionYYYYYWestern blot 鑒定PAGE質(zhì)譜細(xì)菌蛋白質(zhì)的“prorein A”可特異性地結(jié)合到免疫球蛋白的FC片段IP of LR with rCbpA（鑒定pull down結(jié)果） 裂解細(xì)胞：rBCEC6 cells were lysed with 3 ml NP-40 buffer, and briefly

20、 sonicated. 與靶蛋白結(jié)合：The lysate was combined with 4 g rCbpA免疫反應(yīng)：Incubated overnight with 35 g of either anti-LR (1:1000) or anti-CbpA (1:2,000). 共沉淀：Protein A beads (Invitrogen) were added, and the mix was incubated for 1 hour. 洗脫：Samples were washed 7 times with 1 ml NP-40 buffer, resuspended in 40 l

21、 sample buffer, and boiled for 10 minutes. 鑒定：Samples were analyzed by SDSand immunoblotting.Structural basis of G proteincoupled receptorG protein interactions。Nature Chem Biol, 2010, 6: 541-548（分析蛋白相互作用位點(diǎn)）大鼠G蛋白耦聯(lián)受體M3R G蛋白（綠色）（藍(lán)色）（紫色）亞基 將不同變異體的表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入cos-7細(xì)胞中，單獨(dú)轉(zhuǎn)染的為對照；左圖為IP前的IB,右圖為IP后的IB，二者復(fù)合物為80k

22、D（陽性結(jié)果）。圖為單獨(dú)兩次實(shí)驗(yàn)的其中一次。TAK-242 (Resatorvid), a Small Molecule Inhibitor of Toll-Like Receptor (TLR) 4 Signaling,Binds Selectively to TLR4 and Interferes with Interactions between TLR4 and Its Adaptor Molecules. Mol Pharmacol, sep,29, 2010（鑒定）分析已知蛋白與小分子化合物的作用：The immunoprecipitates were separated usin

23、g SDSanalyzed using immunoblotting with anti-FLAG M2 mAb or anti-HA tag mAb. analyzed using autoradiography.TRAM分析小分子化合物對蛋白相互作用的干擾染色質(zhì)免疫共沉淀Chromatin Immuno-precipitation, ChIP)原理： 在活細(xì)胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)DNA復(fù)合物，將其隨機(jī)切斷為一定長度的小片段； 通過免疫學(xué)方法沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段； 純化、檢測目的片段，獲得與蛋白質(zhì)相互作用的DNA信息。 應(yīng)用：轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合序列信息、組蛋白的修飾Ch

24、ip-chip or Chip-seq 可獲得數(shù)百萬條序列標(biāo)簽，并能把所關(guān)注的蛋白的DNA結(jié)合位點(diǎn)精確定位到基因組上。Genome-Wide Mapping of in Vivo Protein-DNA Interactions. Science, 2007, 316(5830): 1497-1502 Johnson等利用 ChIP-seq 對轉(zhuǎn)錄因子NRSF(神經(jīng)元限制性沉默因子)在DNA上的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了全基因組的篩查:結(jié)果： 獲得了1946個結(jié)合位點(diǎn)； 結(jié)合位點(diǎn)的最小能分辨為50bp。 獲得的經(jīng)典與非經(jīng)典的神經(jīng)限制性沉默元件(NRSE)序列。 高質(zhì)量的ChIP-seq結(jié)果提供了研究新的DNA-蛋白相互作用的內(nèi)容，包括胰島發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要轉(zhuǎn)錄因子。 又叫凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)（Gel retardation assay） 或DNA遷移率變動實(shí)驗(yàn)（DNA mobility shift assay）。 是在80年代初期出現(xiàn)的用于在體外研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術(shù)。它具有簡單、快捷等優(yōu)點(diǎn)，