1、神經(jīng)母細(xì)胞瘤與FISH檢測(cè) FISH產(chǎn)品事業(yè)部液基細(xì)胞學(xué)HPV檢測(cè)免疫組化FISH+專注病理診斷產(chǎn)品的研發(fā)、生產(chǎn)與服務(wù)page1神經(jīng)母細(xì)胞瘤概述流行病學(xué)臨床分期常用檢測(cè)方法FISH檢測(cè)的靶點(diǎn)及意義page2概述神經(jīng)母細(xì)胞瘤(neuroblastoma,NB)又稱成神經(jīng)母細(xì)胞瘤,是威脅兒童生命的多見(jiàn)的惡性腫瘤之一,據(jù)文獻(xiàn)報(bào)告它在兒童惡性腫瘤中排列第四位.NB是從原始神經(jīng)嵴細(xì)胞演化而來(lái),交感神經(jīng)鏈、腎上腺髓質(zhì)是最常見(jiàn)的原發(fā)部位,惡性程度高,預(yù)后差.page3Izbicki T，Mazur J,Izhicka E，et a1Epidemiology of neuroblastoma：analysis

2、 of a single institutionAnticancer Res，2003，23(2)：19331938流行病學(xué)NB是兒童最常見(jiàn)的顱外實(shí)體瘤,占所有兒童腫瘤的8%10%約75%的NB患者在5歲以下 96%的病例10歲前發(fā)病,3.5%在10-20歲發(fā)病男性女性比例24 ：1年發(fā)病率0.3-5.5/10萬(wàn)Izbicki T,eta Epidemiology of neuroblastoma:analysis of a single institution.Anticancer Res,2003,23(2C):1933-1938page4NB的INSS國(guó)際臨床分期page5常用的檢測(cè)方法

3、 組織病理學(xué)檢查:HE染色 蛋白質(zhì)組檢測(cè)：免疫組化（IHC）方法優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)組織形態(tài)學(xué)（HE染色） 操作簡(jiǎn)易，成本低與小圓形細(xì)胞惡性腫瘤在HE上無(wú)法區(qū)分，不能夠指導(dǎo)預(yù)后判斷 IHC 靈敏度較高，快速NB與一些惡性腫瘤在IHC中表型中有重疊鑒別診斷困難，結(jié)果受主觀因素影響，而且不能指導(dǎo)預(yù)后判斷 HE染色+IHC提高敏感度和特異性結(jié)果更可靠NB和尤文氏肉瘤在形態(tài)學(xué)和IHC表型有重疊，鑒別診斷困難page6page7鑒別診斷，指導(dǎo)預(yù)后判斷都有困難尋找新的方法NB有關(guān)的癌基因 NB細(xì)胞的細(xì)胞遺傳學(xué)研究，證實(shí)約80病例出現(xiàn)染色體異常表現(xiàn)。1p缺失，主要發(fā)生缺失是1p36區(qū)段MYCN基因擴(kuò)增和蛋白過(guò)表達(dá)11q

4、缺失，主要發(fā)生缺失是11q23區(qū)段MDM4基因擴(kuò)增和蛋白過(guò)表達(dá)page8分子生物學(xué)檢測(cè)反轉(zhuǎn)錄-聚合酶反應(yīng)技術(shù)（RT-PCR）southern印跡雜交（southern blot)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-雜合型缺失（PCR-LOH）熒光原位雜交(FISH) page9反轉(zhuǎn)錄-聚合酶反應(yīng)技術(shù)（RT-PCR）RT-PCR是將RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（PCR）相結(jié)合的技術(shù);首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成 cDNA,再以cDNA為模板,擴(kuò)增合成目的片段.RNA提取反轉(zhuǎn)錄（RNA-cDNA）PCR擴(kuò)增電泳,顯示結(jié)果southern印跡雜交page11聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-雜合型缺失（PCR-L

5、OH）原理： 通過(guò)PCR擴(kuò)增DNA某多態(tài)位點(diǎn)來(lái)確定該位點(diǎn)的雜合 性缺失（Loss of Heterozygosity）即PCR-LOH.page12檢測(cè)方法比較檢測(cè)方法優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)RT-PCR快速，靈敏度高，結(jié)果可靠易污染，RNA提取難度大且易降解southern blot快速，靈敏，精確的給基因定位步驟繁瑣，組織用量大，常有同位素污染，衰變，價(jià)格也比較昂貴PCR-LOH簡(jiǎn)單，快速，樣本需求量少染色體缺失最常發(fā)的區(qū)段必須有已知的多態(tài)位點(diǎn)page13FISH - Fluorescence In Situ Hybridization一項(xiàng)快速、準(zhǔn)確、高靈敏度的細(xì)胞分子生物學(xué)技術(shù)在惡性腫瘤相關(guān)基因/染色體

6、區(qū)域的大片段缺失、擴(kuò)增、轉(zhuǎn)位等方面具有重要診斷價(jià)值是常規(guī)分子診斷技術(shù)的重要補(bǔ)充page14FISH 技術(shù)原理熒光原位雜交 Fluorescence In Situ Hybridization原理采用體外熒光標(biāo)記的DNA探針，利用探針與被檢測(cè)的目的基因堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則，探針與目的基因經(jīng)高溫變性雜交后，通過(guò)熒光顯微鏡檢測(cè)熒光信號(hào)而得出結(jié)果，從而檢測(cè)細(xì)胞，組織樣本中的染色體或基因異常。page15FISH 技術(shù)原理page16NB中FISH檢測(cè)的靶點(diǎn)SRD基因缺失檢測(cè)探針MYCN基因擴(kuò)增檢測(cè)探針page17MDM4基因擴(kuò)增檢測(cè)探針MLL基因檢測(cè)探針page18NB中FISH檢測(cè)的靶點(diǎn)1p缺失 、期

7、NB中80100有1p缺失,與臨床預(yù)后差、生存期 短相關(guān),是NB的特征基因改變之一. 1p36的缺失一般都是雜合型缺失（LOH）. 1p缺失的主要區(qū)段發(fā)生在1p36.3,它的缺失是NB易復(fù)發(fā)的 因素之一,1p36區(qū)上含有腫瘤抑制因子CHD5.J Natl Cancer Inst 2008;100:940949Oncogene (2005) 24,26842694page19 1p36.3缺失（FISH陽(yáng)性）熒光原位雜交 (FISH)檢測(cè)1p36.3缺失 SRD基因缺失檢測(cè)試劑盒 正常型（FISH陰性）page20MYCN基因定位于2號(hào)染色體2p24區(qū)段的原癌基因.25%以上的NB患者出現(xiàn)MYC

8、N基因擴(kuò)增.MYCN基因擴(kuò)增和過(guò)度表達(dá)與NB的浸潤(rùn),轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后密切相關(guān),MYCN基因拷貝數(shù)增多在NB中較早期（I、II、IVS期）多見(jiàn).MYCN基因擴(kuò)增每單倍基因組大于10個(gè)拷貝被認(rèn)為是預(yù)后不良的標(biāo)志.page21陳霞靜兒童神經(jīng)母細(xì)胞瘤36例診斷分析右江民族醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2003，25(2)：225-226Clin Cancer Res 2009;15:2085-2090page22 FISH檢測(cè)結(jié)果中：MYCN基因的擴(kuò)增形式有兩種 一種在均質(zhì)染色區(qū)擴(kuò)增（HSR） 一種是雙微體擴(kuò)增（DMs）熒光原位雜交 (FISH)檢測(cè)MYCN擴(kuò)增 MYCN基因擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒page23NeoplasiaV

9、ol.3,No.2,2001,pp.105-109FISH陽(yáng)性的檢測(cè)結(jié)果FISH陽(yáng)性（DMs）FISH陽(yáng)性（HSR）page24FISH陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)紅色眾多信號(hào)連接成簇（擴(kuò)增表現(xiàn)為均質(zhì)染色區(qū)） 紅色信號(hào)出現(xiàn)雙微體擴(kuò)增紅綠信號(hào)比1.5page25MDM4基因定位于1q32區(qū)段是p53上游重要的調(diào)節(jié)因子MDM4擴(kuò)增或/和過(guò)表達(dá)在65%的NB中出現(xiàn)可作為NB腫瘤的特異性化療靶點(diǎn)可成為腫瘤潛在的治療靶點(diǎn)Jin G,Cook S,et a1.HDMX regulates p53 activity and confers chemoresistance to 3-bis(2-chloroethyl)-1-

10、nitrosoureaNeuro Oncol,2010,12:956-966國(guó)際遺傳學(xué)雜志20112年4月15日第35卷 第二期page2611q缺失11q缺失在原發(fā)性NB中出現(xiàn)在未出現(xiàn)MYCN擴(kuò)增的NB惡性進(jìn)展過(guò)程中，出現(xiàn)定位于11q23.3（MLL）失活（擴(kuò)增或者缺失）N Engl J Med 2005;353:2243-53page27FISH檢測(cè)靶點(diǎn)的臨床意義SRD基因缺失檢測(cè)探針檢測(cè)1p雜合性缺失對(duì)NB的臨床治療指導(dǎo)和判斷預(yù)后方面有著重要的意義染色體，1p缺失與NB易復(fù)發(fā)，預(yù)后差，對(duì)化療比較敏感，1p缺失支持NB診斷.MYCN基因擴(kuò)增檢測(cè)探針MYCN擴(kuò)增倍數(shù)越多，預(yù)后越差，擴(kuò)增倍數(shù)1

11、0時(shí)，臨床治療方案：完整切除原發(fā)腫瘤后可不予其它治療；擴(kuò)增倍數(shù)10時(shí)，手術(shù)切除后應(yīng)常規(guī)化療12個(gè)月，必要時(shí)還需局部放療,MYCN擴(kuò)增支持NB診斷，NB的惡性進(jìn)展和轉(zhuǎn)移有關(guān).MDM4基因擴(kuò)增檢測(cè)探針NB的特異性化療靶標(biāo)，MDM4擴(kuò)增，導(dǎo)致對(duì)化療不敏感.MLL基因缺失檢測(cè)探針在原發(fā)NB中出現(xiàn)，在未出現(xiàn)MYCN擴(kuò)增的NB惡性進(jìn)展過(guò)程中，出現(xiàn)腫瘤抑制基因MLL失活，和NB的惡進(jìn)展有關(guān). page28FISH技術(shù)在NB診斷中的應(yīng)用，使疾病的診斷從肉眼,到細(xì)胞學(xué),再到基因異常（分子水平）不斷完善.各種檢測(cè)方法的有效結(jié)合,能更好的提高敏感性和特異性,診斷結(jié)果更靠,對(duì)NB臨床診斷、預(yù)后判斷和指導(dǎo)治療都重要意義.page29謝謝Cancer Res 2008;68:(8).April 15,2008CHD5是1p36區(qū)上的一種蛋白,CHD5通過(guò)p19ARF/p53信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞的增值、衰老和凋亡,是一種很強(qiáng)的腫瘤抑制基因,NB細(xì)胞系CHD5啟動(dòng)子發(fā)生甲基化,導(dǎo)致CHD5表達(dá)缺乏或低表達(dá),導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞惡性增殖.研究表明,CHD5基因的甲基化狀態(tài)與腫瘤的無(wú)事件生存率和總體生存率有關(guān).均質(zhì)染色區(qū)（Homogeneously staining regions,HSR）均質(zhì)染色區(qū)擴(kuò)增是指擴(kuò)