1、關于免疫組化及特殊染色第1頁，共78頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四第一節(jié) 免疫組織化學 技術概述第2頁，共78頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四（一）發(fā)展簡史 1941年Coons首先用熒光素標記抗體檢測肺組織內的肺炎雙球菌獲得成功。 60年代Nakane建立酶標抗體技術運用鐵蛋白標記Ab技術70 、80年代多位科學家改良上述技術，建立辣根過氧化物酶-抗過氧化物酶（PAP）技術,抗生物素生物素（ABC）法使免疫組織化學進入了應用階段。 第3頁，共78頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四2000年以后各種免疫組化技術更加成熟,使免疫組化技術成為當今生物醫(yī)學中

2、形態(tài)、功能代謝綜合研究的一項有力工具。其應用范圍深達醫(yī)學各個學科，是目前生命科學工作者應該掌握的基本技術之一。第4頁，共78頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四定義:是應用免疫學基本原理抗原抗體反應，即抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色來確定組織細胞內抗原（多肽和蛋白質），對其進行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學技術(immunohistochemistry)或免疫細胞化學技術(immunocytochemistry)。 將試劑抗原或試劑抗體用可以微量檢測的標記物進行標記，在與標本中的相應抗體或抗原反應后，可以不必測

3、定抗原抗體復合物本身，而測定復合物中的標記物，通過標記物的放大作用，進一步提高了免疫技術的敏感性。（二）免疫組織化學的原理第5頁，共78頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四抗原是指能夠刺激機體產生（特異性）免疫應答，并能與免疫應答產物抗體和致敏淋巴細胞在體內外結合，發(fā)生免疫效應（特異性反應）的物質?？乖幕咎匦杂袃煞N，一是誘導免疫應答的能力，也就是免疫原性，二是與免疫應答的產物發(fā)生反應，也就是抗原性 第6頁，共78頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四病原微生物 在醫(yī)療中將病原微生物制成疫苗進行預防接種，可以提高人的免疫力。 嗜異性抗原 一類與種屬特異性無關的、存在于人以及

4、某些動物、植物、微生物的性質相同的抗原。 腫瘤抗原 由物理的、化學的因素或某些病毒誘發(fā)的實驗動物腫瘤，其細胞中或細胞表面均出現(xiàn)特異性抗原，稱為腫瘤特異性抗原。已證實在某些人類腫瘤中心存在著與病毒密切相關的抗原。 同種異體抗原動物免疫血清與人類有關的抗原 第7頁，共78頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四抗體（antibody）指機體的免疫系統(tǒng)在抗原刺激下，由B淋巴細胞或記憶細胞增殖分化成的漿細胞所產生的、可與相應抗原發(fā)生特異性結合的免疫球蛋白。 第8頁，共78頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四世界著名抗體公司 Santa公司、Abcam公司、Abgent公司、Protei

5、ntech Group、Cell Signaling Technology（CST）、羅氏公司（Roche）第9頁，共78頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四 它借助于熒光素、酶等標記抗體與組織切片或細胞涂片中相關抗原相結合，由于熒光素所發(fā)熒光可用熒光顯微鏡檢出，而酶可經一定的顯色處理，呈現(xiàn)醒目的陽性色彩，從而可準確定位欲測定的抗原物質。 標記物第10頁，共78頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四熒光素、酶標記抗 體抗 原熒光陽性色彩顯微鏡觀察組織抗原抗體 酶熒光素第11頁，共78頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四第12頁，共78頁，2022年，5月20日，9點

6、49分，星期四 三大系統(tǒng) 本技術是應用免疫學原理來識別待測抗原，再通過酶和底物的作用外加顯色劑，將上述反應顯示出來。第13頁，共78頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四免疫組織化學識別系統(tǒng)聯(lián)結系統(tǒng)顯示系統(tǒng)第14頁，共78頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四識別系統(tǒng)是指特異性抗體識別組織或細胞中的靶抗原?？乖贵w的特異性結合是本技術的基本依據。第15頁，共78頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四聯(lián)結系統(tǒng)由聯(lián)結抗體構成。它的作用是聯(lián)接識別系統(tǒng)和顯示系統(tǒng)。 第16頁，共78頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四顯示系統(tǒng)的目的是使抗原抗體間的特異性結合變?yōu)槿庋劭梢?/p>

7、。因此顯示系統(tǒng)由標記酶，底物和顯色劑組成，以在靶抗原存在位點上形成有色沉淀。第17頁，共78頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四特點： 特異性強靈敏度高定位準確和簡便快速等優(yōu)點又能夠將形態(tài)、功能及代謝的研究有機結合起來。第18頁，共78頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四IHC方法1 過去用過的方法ABC法，SP法。三步法，使用生物素2 目前最常用的方法二步法： EnliVision顯色系統(tǒng)（即用型非生物素免疫組化EnliVisionTM plus檢測試劑盒 ）將多個抗鼠和抗兔的IgG分子二抗與辣根過氧化物酶通過一個多聚葡聚糖骨架聯(lián)接成一個大分子多聚體（polymer），直

8、接放大信號40-50倍。敏感、省時、方便、背景低（避免了內源性生物素干擾）。第19頁，共78頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四3 最新一代的免疫組化 Novolink Polymer法：使用小分子聚合物（減少細胞薄膜硬脂的阻礙，比傳統(tǒng)中的大分子聚合物染色更顯著），信號放大更強，還可以檢測到組織中低濃度的抗原。 IHC方法第20頁，共78頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四 EnliVision法的工作程序： 切片，烤片，脫蠟水化（使用防脫片處理的玻片：多聚賴氨酸，APES）H2O2處理（阻斷內源性過氧化物酶），蒸餾水漂洗組織切片的預處理（枸櫞酸鈉緩沖液中熱修復，酶消化暴露

9、出抗原決定簇），TBS漂洗內源性過氧化物酶的阻斷一抗孵育，TBS漂洗二抗孵育，TBS漂洗DAB顯色，蒸餾水中止反應蘇木素復染及封片 IHC技術的基本操作流程第21頁，共78頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四切片烤片脫蠟水化H2O2處理熱修復一抗二抗Enlivision試劑DAB顯色蘇木素復染第22頁，共78頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四IHC染色結果的判讀原則第23頁，共78頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四玻片干燥造成的“邊緣效應”假陽性未阻止內源性過氧化物酶阻止內源性過氧化物酶后I. 注意影響IHC結果判讀的因素第24頁，共78頁，2022年，5月2

10、0日，9點49分，星期四酒精固定福爾馬林固定胰腺，insulin平滑肌肉瘤，SMA氣泡影響抗體抗體反應冰凍切片石蠟切片結腸，CEA假陰性：注意內對照第25頁，共78頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四假陰性蛋白酶處理后蛋白酶未處理皮膚，IV膠原甲狀旁腺，PTH微波未處理微波處理后第26頁，共78頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四II. 染色的特異性判定第27頁，共78頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四第28頁，共78頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四第29頁，共78頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四第30頁，共78頁，2022年，5月2

11、0日，9點49分，星期四Fujita Health University School of MedicineMitochondoriaApicalmembraneBasolateral membranePlasma Membrane+PERGolgiPlasma membranePER + GolgiGolgiapparatusEndocrinegranuleEndocrine granuleLysosomeCytosolNucleusCytoskeleton amylase lysozome PAcP S-100 NSE prefixation diffusion artifact CEA

12、 EMA ALPCD10 cytochrome P-450 immunogloblin AFP HCG factor -RA prolactin in activated pituicyte SC EGFRE-cad Leu 4 HLA-DR CEA, EMA, SC, CA19-9 in cancer cell Leu 1 LCA PALP in seminoma cellCerb-B2 SC, AFP EMA, immunoglobulin in special conditions chromogranin A serotonin Peptide hormone DNA polymera

13、se S-100 (occasional) estrogen receptor keratin in carcinoid, mesothelioma vimentin keratin in adenocarcinoma hepatocyte actin keratin vimentin GFAP tubulin 各抗原在細胞內的顯色方式第31頁，共78頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四細胞膜陽性細胞粘附分子： E-cadherin、CD31、CD56等交聯(lián)膜蛋白分子：catenin、dystrophin 等細胞表面受體：EGFR、c-erbB2、c-kit/CD117（酪氨酸激酶受

14、體）等絕大多數(shù)白細胞抗原: LCA、CD20、CD2、CD5等表面或跨膜蛋白：Villin、BerEP4、EMA、 CEA、CA125、EBV-LMP1等第32頁，共78頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四細胞核陽性細胞周期素蛋白：cyclins、cyclin 依賴激酶(cdk)、cdk 抑制劑 (如 p16)等細胞增殖相關蛋白：Ki67、PCNA轉錄因子：MyoD1、myogenin、TTF-1、CDX2、PAX5腫瘤抑制基因：如 p53、p63、Rb、WT1基因錯配產物：如 MLH1、MSH2第33頁，共78頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四細胞核酶：如 TdT類固醇

15、激素受體：如 ER、PR、AR細胞核鈣結合蛋白：如 S100蛋白、calretinin定位細胞核的病毒：如 CMV、HBcAg（核+核周）NeuN：neuronal nuclei，表達于成熟的神經元第34頁，共78頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四細胞漿內顆粒狀陽性-定位于細胞器溶酶體顆粒：如 lysozyme、CD68、myeloperoxidase黑色素小體和前黑色素小體：如 HMB45、Melan-A細胞毒顆粒：如TIA-1、granzyme B線粒體: 如抗線粒體抗體, HEP-PAR1神經內分泌顆粒：各種激素（如PTH、 ACTH、insulin）、CgA、SynW-P

16、小體: F-VIII相關抗原分泌顆粒：如BRST-2、surfactant、PSA細胞內微生物：如弓形蟲第35頁，共78頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四細胞漿纖維狀陽性-中間絲或微絲中間絲;CK;Vimentin;DesminGFAP（glial fibrillary acidic protein，膠質纖維酸性蛋白 ）NF（Neurofilament，神經元胞漿節(jié)細胞神經瘤，副節(jié)瘤/嗜鉻細胞瘤，神經母細胞瘤）Nestin：巢蛋白，神經前體細胞第36頁，共78頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四彌漫或片狀的細胞漿陽性蛋白分布在細胞內液、大量的微囊及內質網中如:myoglo

17、bin、hemoglobin、albumin、AFP、 NSE、cytoplasmic Ig、CD3病毒顆粒/蛋白如:HBsAg（常在核旁著色）從細胞間液吸收的蛋白如: Ig、 albumin第37頁，共78頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四 分化差惡性腫瘤的診斷和鑒別診斷； 證實內分泌腫瘤和神經內分泌腫瘤； 應用腫瘤胚胎性抗原診斷某些腫瘤，如癌胚抗原（CEA）對胃腸道癌、甲胎蛋白（AFP）對肝癌和卵巢內胚竇癌診斷有幫助； （三）免疫組化的應用第38頁，共78頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四 有時可幫助確定腫瘤的良惡性，如應用免疫球蛋白輕鏈和來鑒別濾泡性惡性淋巴瘤和濾

18、泡性反應性增生； 研究某些癌癥與病毒的關系，如肝癌與乙型肝炎病毒、鼻咽癌與EB病毒、宮頸癌與乳頭狀瘤病毒等的關系；第39頁，共78頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四 為腫瘤治療的選擇提供依據，如乳腺癌檢測雌、孕激素受體（ER、PR）呈陽性時，應用他莫昔芬（三苯氧胺）治療可預期獲得較好的療效； 檢測癌基因和抑癌基因蛋白產物（如c-erbB2，p53）、增生活性抗原（如Ki-67，PCNA）用來估計腫瘤的預后。 第40頁，共78頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四 免疫組化在臨床診斷中 應用病例示范（Case 1）臨床病史資料：48歲，男性，胃活檢標本取自胃大彎部位。H&E染

19、色切片描述腫瘤細胞顯示在間質中呈癌巢樣，鄰近的腺體腸上皮化生，間質中的不規(guī)則的巢狀結構待診斷.第41頁，共78頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四H&E染色 第42頁，共78頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四 首先選擇Cytokeratin單克隆廣譜角蛋白抗體在細胞巢中呈強陽性染色，證明是上皮來源性的腫瘤，在圖片頂部是非腫瘤性的腺上皮陽性，腫瘤性的腺體在底部。第43頁，共78頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四 腫瘤細胞再進一步進行cytokeratin 7 /cytokeratin 20染色，染色證實在腫瘤細胞中同時缺少cytokeratin 7 /cytok

20、eratin 20的表達。在這張圖片中腸上皮細胞cytokeratin 20陽性與鄰近的腫瘤細胞陰性形成明顯的對照。cytokeratin 7 and 20在臨床中使用中，如果同時都不表達，特異性地表示腫瘤細胞為來源于一些上皮的腫瘤（subset of epithelial tumors），包括腎細胞癌，前列腺癌、肝細胞癌和神經內分泌腫瘤等。第44頁，共78頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四 Synaptophysin 測定Synaptophysin所有腫瘤細胞中都顯示出較強的陽性表達，而在腫瘤細胞中包繞的腸腺體呈陰性診斷:神經內分泌癌第45頁，共78頁，2022年，5月20日，9

21、點49分，星期四 Ki-67 測定:Ki-67 在腫瘤細胞呈現(xiàn)非常低的表達，Ki-67 染色同樣證實為腫瘤細胞增殖率低，腸腺上皮中Ki-67 高表達，可能是胃小凹腺體，與高細胞增殖率的腺上皮相比Ki-67在腫瘤細胞中缺少胞核表達。這些Ki-67 標記陰性的腫瘤細胞是低分級的神經內分泌癌細胞，第46頁，共78頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四第二節(jié) 免疫組織化學染色前的基本技術(一) 樣品的取材 組織標本包括石蠟切片（病理切片和組織芯片）和冰凍切片。細胞標本后者包括組織印片和細胞涂片。第47頁，共78頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四 其中石蠟切片是制作組織標本最常用、最

22、基本的方法，對于組織形態(tài)保存好，且能作連續(xù)切片，有利于各種染色對照觀察；還能長期存檔，供回顧性研究.第48頁，共78頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四 樣品制備的第一步就是取材，取材的好壞關系到實驗的結果。所以必須做好準備工作。 現(xiàn)將組織取材的原則和具體要求分述如下： 1 刀剪銳利、潔凈。 2 快速、準確、盡量保持生活狀態(tài)， 力爭1分鐘之內放入固定液，最遲不能超 過3分鐘。 第49頁，共78頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四3 一刀切取，切取應在蠟版或濾紙上進 行，避免拉鋸、牽拉或擠壓等動作。4 低溫操作，防止自溶現(xiàn)象，通常以 0-4的低溫條件下操作為佳。第50頁，共7

23、8頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四5、樣品大小適當，光鏡樣品一般在1.0cm以內，免疫組織化學樣品大約在：2cm1.5cm0.3cm厚度控制在0.3cm。電鏡樣品規(guī)格要求切成0.5-1.0cm共3小塊。 對病理組織取材還應做到以下幾點： 取材部位必須是主要病變區(qū)； 必須取病灶與正常組織的交界區(qū)； 必要時取遠離病灶的正常組織做對照。 第51頁，共78頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四細胞標本的取材印片法:常用于活檢標本沉淀法:主要用于胸水、腹水、尿液等穿刺抽吸法：常用于淋巴結、軟組織、 腎、肝、肺等組織。第52頁，共78頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四注意

24、事項：細胞經離心后細胞粘附性較差，標記過程中容易脫片，載玻片應涂粘附劑細胞總數(shù)應以105個為宜，并集中在直徑0.6-1.0cm的圓圈內。富于粘液的標本，未經處理不宜作免疫組化標記。第53頁，共78頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四（二）、組織固定 2、免疫組化標本固定時，好的固定劑應 滿足哪些要求？ 1、目的:固有形態(tài)和結構、抗原完整性第54頁，共78頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四能快速固定抗原；防止抗原物質擴散；固定后的抗原能被抗體識別， 不影響抗原抗體反應。第55頁，共78頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四甲醛固定液：分類較多，最常用的4%多聚甲醛固

25、定液，對于冰凍切片，甲醛固定有時比冰凍丙酮好；主要特點：組織穿透性好，收縮性小但對于不同的組織和抗原，可選用不同的固定液。有時候商品化的抗體會有比較適合而推薦的固定液，請于購置前注意說明書。3、各種固定液：第56頁，共78頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四 Bouin,S固定液：飽和苦味酸750ml，甲醛250ml，冰醋酸50ml，其對組織的穿透力較強，固定較好，結構完整，但因偏酸，對抗原有一定損害，且組織收縮明顯，不適于組織標本的長期保存。 PLP液：即高碘酸鈉-賴氨酸-多聚甲醛，適于固定石蠟切片。適于富含糖類組織，對超微結構及許多抗原的抗原性保存較好。第57頁，共78頁，202

26、2年，5月20日，9點49分，星期四（三）、組織脫水浸蠟及包埋脫水透明等過程需在4或室溫下進行，避免組織抗原的損失；為使組織充分脫水、透明和浸蠟，組織塊的厚度以1.0-1.5mm為宜;浸蠟及包埋過程中,石蠟溫度應保持在60或60以下,用熔點低的石蠟包埋;制備蠟塊在較低的溫度進行,故試劑處理時應適當延長,否則會給切片帶來困難第58頁，共78頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四常用的包埋法石蠟包埋冰凍干燥包埋塑料包埋第59頁，共78頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四（四）組織切片中載玻片的處理 抗原修復過程中，由于高溫、高壓、輻射等諸多因素的影響，極易造成脫片。為保證試驗的正

27、常進行，可選用Poly-L-Lysine 、ZLI-9001 APESZLI-9003 HistogripTM或ZLI-9005 等幾種試劑，對已常規(guī)清洗的載玻片進行處理。具體方法如下： 第60頁，共78頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四Poly-L-Lysine：將洗凈、干燥的載玻片放入以1:10比例去離子水稀釋的多聚賴氨酸溶液中，浸泡5分鐘，60oC烤箱烘烤一小時或室溫過夜干燥。裝盒備用。試驗中使用的器具均為非玻璃制品。 第61頁，共78頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四（五）抗原修復 抗原修復是指石蠟、冰凍、火棉膠、塑料切片免疫組織化學（IHC）前用胰蛋白酶、尿素

28、、表面活性劑、微波緩沖液和金屬鹽等，使被掩蓋的抗原決定簇或變性的抗原重新暴露或抗原性得到一定程度的恢復過程。 第62頁，共78頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四石蠟切片為什么要做抗原修復？有那些方法？ 石蠟切片標本均用甲醛固定，使得細胞內抗原形成醛鍵、羧甲鍵而被封閉了部分抗原決定簇,同時蛋白之間發(fā)生交聯(lián)而使抗原決定簇隱蔽.所以要求在進行IHC染色時,需要先進行抗原修復或暴露,即將固定時分子之間所形成的交聯(lián)破壞，而恢復抗原的原有空間形態(tài)。第63頁，共78頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四 常用的抗原修復方法有微波修復法，高壓加熱法，酶消化法，水煮加熱法等，常用的修復液是p

29、H6.0的0.01mol/L的檸檬酸鹽緩沖液。第64頁，共78頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四抗原修復方法一、熱修復 1、微波爐加熱法 將玻片分別插入抗原修復盒中，以保證各部位的玻片受熱均勻。 在抗原修復盒中加入抗原修復液，蓋上帶有小孔的蓋子。 將塑料盒置于微波爐中央，加熱 2x5min 。兩次加熱之間，加入 50ml 蒸餾水。 加熱過程中，組織標本不可干燥。 第65頁，共78頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四第二次處理后，將微波爐中的修復盒移至室溫冷卻 15-20 分鐘。 不要打開蓋子！ 蒸餾水沖洗。 阻斷內源性過氧化物酶并置于蒸餾水中。 用 TBS 或 PBS 液

30、沖洗。 進行免疫組化染色。 第66頁，共78頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四 在壓力鍋中放入 1500-3000ml 抗原修復緩沖液加熱到沸騰，不加閥，玻片插入切片架并放入沸騰的修復緩沖液中。后加閥，使之加壓2分鐘。后將壓力鍋置于流水槽或繼續(xù)冷卻 20 分鐘（減壓）。取出切片，蒸餾水沖洗，移至 TBS 或 PBS 液中，以避免組織干燥。 以下同微波爐修復法 。 2、壓力鍋法第67頁，共78頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四 抗原修復的方法選擇，關系到組織抗原能否暴露充分，這對免疫組化染色效果有很大影響。因此應當根據不同的抗原特點，采用不同的修復方法。對某些細胞內抗原（

31、如Fas、Bax、F等）和細胞間質抗原（如Laminin、CoIV等）則需要用酶消化法處理切片。 二、酶消化方法第68頁，共78頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四1、胰蛋白酶處理： A 滴加一滴胰蛋白酶工作液于組織上。 B 室溫 37 孵育 20-40 分鐘，孵育時間的長短依福爾馬林固定時間及所測抗原情況而定。 C 蒸餾水沖洗，終止反應。 D 阻斷內源性過氧化物酶。 E 免疫組化染色。 第69頁，共78頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四2、胃蛋白酶處理 A 滴加胃蛋白酶工作液于組織上。 B 最佳消化時間取決于福爾馬林的固定時間， 37 預熱。一般消化 10 分鐘，長至 30 分鐘。 C 以下同胰蛋白酶處理方法 3 ,4,5 。 注：過度消化將導致組織結構的丟失，并引起組織脫片第70頁，共78頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四三、綜合方法 微波爐加胰酶修復法： 將組織切片置于盛有 50ml 修復液的塑料盒中，封口膜封口后加熱 5 分鐘。 冷卻后打開，將切片置于 37 預熱的蒸餾水中，胰蛋白酶消化。 室溫胰蛋白酶處理 30 秒鐘。 蒸餾水沖洗。 阻斷內源性過氧化物酶，置蒸餾水中。 免疫組化染色。第71