1、乙肝病毒DNA的實驗室檢測乙肝病毒DNA的實驗室檢測熒光定量PCR技術(shù)熒光定量PCR技術(shù)熒光定量PCR技術(shù)Polymerase chain reaction(PCR)，聚合酶鏈式反應，是一種DNA的快速擴增技術(shù)。PCR技術(shù)通過兩個短的稱為引物的DNA小片段和一種耐熱酶（TaqDNA聚合酶）的作用，經(jīng)過高溫變性、低溫退火、適溫延伸三個步驟在3個小時內(nèi)反復循環(huán)25-30次，把特定的DNA片段擴增1000萬倍。 每個PCR體系含4種主要成分：含有待擴增序列的DNA模板、引物、TaqDNA聚合酶、脫氧核糖核酸三磷酸（dNTP）熒光定量PCR技術(shù)Polymerase chain reac 實時熒光定量P

2、CR技術(shù)，是指在反應體系中加入熒光標記，利用熒光信號積累實時檢測整個PCR過程，通過標準曲線對PCR終產(chǎn)物的分析，最終實現(xiàn)對未知的起始模版進行定量分析的一種技術(shù)，是迄今對已知基因序列的核酸測定中最靈敏的方法。熒光定量PCR技術(shù) 實時熒光定量PCR技術(shù)，是指在反應體系中加入熒光標PCR 反應過程5533d.NTPsTaq 酶Primers5353535353535353反應組分變 性535353535353PCR 反應過程5533d.NTPsTaq 酶Pri延 伸53535353353TaqTaq55重 復退 火延 伸535353533535353535355335353循環(huán)24個拷貝循環(huán)38個

3、拷貝53535353535353535353533553535353535353535533535熒光定量PCR原理插入染料法 SYBR Green I雜交探針法(最常用) TaqMan熒光定量PCR原理插入染料法TaqMan探針5533d.NTPsTaq酶Primers5353535353535353反應體系變 性535353535353Taql53RQProbe53RQTaqMan探針5533d.NTPsTaq酶Prim535353RQ退 火531. 鏈取代Taq3QR5533QTaqR52. 水 解3. 聚 合53QTaqR354. 檢測熒光533QTaqR5l535353RQ退 火53

4、1. 鏈取代T乙肝病毒的感染乙肝病毒的感染乙肝病毒的感染 （一） 乙型肝炎病毒結(jié)構(gòu)及特點HBsAg：是HBV感染的主要標志HBsAb：保護性抗體HBcAg：僅存于感染的肝細胞核內(nèi)，一般不存在于血循環(huán)中HBcAb: 非保護性抗體，HBcAb-IgM提示HBV處于復制狀態(tài)HBeAg：HBV復制及強感染性的指標HBeAb：有一定的保護作用，預后良好乙肝病毒的感染 （一） 乙型肝炎病毒結(jié)構(gòu)及乙肝病毒的感染（二） HBV-DNA與“兩對半”1. “兩對半” ：機體的免疫反應狀態(tài)；2. “攜帶者”、“大三陽”、“小三陽”等免疫學指標不能 反應體內(nèi)病毒復制水平與感染程度。FQ-PCR：檢測的是HBV本身的遺

5、傳物質(zhì)DNA，是 病毒存在和復制的最可靠、最直接的指標。HBsAg()HBV-DNA() HBeAg ()HBV-DNA()3. 血清學指標()不能排除HBV感染。乙肝病毒的感染（二） HBV-DNA與“兩對半”1. “乙肝病毒的感染陽性標本HBV DNA檢出率90左右 HBeAg與HBV DNA有著良好的相關(guān)性4. 也可能出現(xiàn)HBsAg()，HBV-DNA()。乙肝病毒的感染陽性標本HBV DNA檢出率90左右4. 也乙肝病毒的感染HBV DNAHBV DNA貫穿感染者的終生，是評價病毒復制的金標準ALT正常增高或者波動正常增高或者波動免疫耐受期免疫清除期非活動或低（非）復制期再活動期肝組織

6、學無明顯異常, 或輕度炎癥纖維化中度或嚴重炎癥、纖維化快速進展無炎癥或僅有輕度炎癥中度或嚴重炎癥、肝纖維化臨床診斷慢性HBV攜帶者HBeAg陽性慢性乙型肝炎乙型肝炎肝硬化非活動性HBsAg攜帶者HBeAg陰性慢性乙型肝炎乙型肝炎肝硬化乙肝病毒的感染HBV DNAALT正常增高或者波動正常增高或?qū)崟r熒光定量PCR技術(shù)，是指在反應體系中加入熒光標記，利用熒光信號積累實時檢測整個PCR過程，通過標準曲線對PCR終產(chǎn)物的分析，最終實現(xiàn)對未知的起始模版進行定量分析的一種技術(shù)，是迄今對已知基因序列的核酸測定中最靈敏的方法。血清學指標()不能排除HBV感染。HBV DNA是目前判斷乙肝抗病毒藥物療效最敏感的

7、指標中度或嚴重炎癥、肝纖維化非活動性HBsAg攜帶者每個PCR體系含4種主要成分：含有待擴增序列的DNA模板、引物、TaqDNA聚合酶、脫氧核糖核酸三磷酸（dNTP）也不是所有“小三陽”的病人HBV都無復制?！皟蓪Π搿?：機體的免疫反應狀態(tài)；HBV DNA檢測的臨床意義一般不存在于血循環(huán)中HBV DNA是患者具有傳染性的標志血清學指標()不能排除HBV感染。實時熒光定量PCR技術(shù)，是指在反應體系中加入熒光標記，利用熒光信號積累實時檢測整個PCR過程，通過標準曲線對PCR終產(chǎn)物的分析，最終實現(xiàn)對未知的起始模版進行定量分析的一種技術(shù)，是迄今對已知基因序列的核酸測定中最靈敏的方法。每個PCR體系含4

8、種主要成分：含有待擴增序列的DNA模板、引物、TaqDNA聚合酶、脫氧核糖核酸三磷酸（dNTP）每個PCR體系含4種主要成分：含有待擴增序列的DNA模板、引物、TaqDNA聚合酶、脫氧核糖核酸三磷酸（dNTP）乙肝病毒的感染慢性HBV感染分期及相關(guān)實驗室檢測指標 魯鳳民，莊輝，乙型肝炎實驗室診斷研究進展 實時熒光定量PCR技術(shù)，是指在反應體系中加入熒光標記，利用熒HBV-DNA與臨床HBV-DNA與臨床HBV DNA檢測的臨床意義HBV DNA是HBV存在最直接的依據(jù)HBV DNA是HBV復制的標志HBV DNA是患者具有傳染性的標志HBV DNA對乙肝兩對半起補充作用HBV DNA是目前判斷

9、乙肝抗病毒藥物療效最敏感的指標HBV DNA可檢測出隱匿性慢性乙型肝炎HBV DNA檢測的臨床意義HBV DNA是HBV存在最直接（二） HBV-DNA與“兩對半”Polymerase chain reaction(PCR)，聚合酶鏈式反應，是一種DNA的快速擴增技術(shù)?！皵y帶者”、“大三陽”、“小三陽”等免疫學指標不能 反應體內(nèi)病毒復制水平與感染程度。（二） HBV-DNA與“兩對半”HBcAb: 非保護性抗體，HBcAb-IgM血清學指標()不能排除HBV感染。每個PCR體系含4種主要成分：含有待擴增序列的DNA模板、引物、TaqDNA聚合酶、脫氧核糖核酸三磷酸（dNTP）也不是所有“小三陽

10、”的病人HBV都無復制。每個PCR體系含4種主要成分：含有待擴增序列的DNA模板、引物、TaqDNA聚合酶、脫氧核糖核酸三磷酸（dNTP）HBV DNA是患者具有傳染性的標志HBV DNA是目前判斷乙肝抗病毒藥物療效最敏感的指標非活動性HBsAg攜帶者中度或嚴重炎癥、肝纖維化實時熒光定量PCR技術(shù)，是指在反應體系中加入熒光標記，利用熒光信號積累實時檢測整個PCR過程，通過標準曲線對PCR終產(chǎn)物的分析，最終實現(xiàn)對未知的起始模版進行定量分析的一種技術(shù)，是迄今對已知基因序列的核酸測定中最靈敏的方法。提示HBV處于復制狀態(tài)HBV DNA是HBV存在最直接的依據(jù)HBV DNA檢測的臨床意義PCR所用引物

11、相應的DNA序列發(fā)生突變，此引物與突變DNA不能配對結(jié)合。PCR檢測“窗口期”核酸檢測縮短的“窗口期”的天數(shù)HBV566-15HCV7041-60HIV2210-15有利于獻血員窗口期病毒核酸的篩查和早期診斷提供直接證據(jù)縮短“窗口期”HBV DNA檢測的臨床意義（二） HBV-DNA與“兩對半”PCR檢測“窗口期”核 調(diào)查表明并不是所有“大三陽”的病人都處于HBV復制期，具有傳染性；也不是所有“小三陽”的病人HBV都無復制。因此，要準確知道HBV是否處于復制狀態(tài)，最準確的方法還是通過檢測HBV DNA來決定。HBV DNA檢測的臨床意義 調(diào)查表明并不是所有“大三陽”的病人都處于HBV復制期，乙肝病毒DNA的實驗室檢測課件乙肝病毒DNA的實驗