1、流式細(xì)胞術(shù)在臨床血液學(xué)與醫(yī)學(xué)科研中的應(yīng)用陳軍浩南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬南京鼓樓醫(yī)院1流式細(xì)胞儀基本工作原理光路系統(tǒng)液路系統(tǒng)電路系統(tǒng)2流式細(xì)胞儀光路圖3外周血FSC-SSC點圖4熒光信號（FL1、FL2、FL3）5CD8-CD28+CD8-CD28-CD8+CD28+CD8+CD28-FL1-FL2點圖7紅系成熟過程抗原表達(dá)8T系成熟過程抗原表達(dá)10粒系成熟過程抗原表達(dá)11單系成熟過程抗原表達(dá)12白血病細(xì)胞系列不保真性抗原跨系表達(dá)抗原表達(dá)不同步抗原表達(dá)過高、過低表達(dá)異常蛋白KORSA3544(CD66c)14CD19白血病細(xì)胞伴CD33表達(dá)15AML-M0/M1有低的SSC和FSC。在CD45SSC圖

2、上出現(xiàn)在原始細(xì)胞位置上，至少表達(dá)一個特異性標(biāo)志如CD13或CD33，但MPO比CD13與CD33更靈敏。也可表達(dá)CD7或CD4。HLA-DR、CD34陽性，有些研究表明CD7與CD34共表達(dá)在AML且預(yù)后差。流式上M1與M0相似不易區(qū)分，M1一般CD13、CD33，但CD34表達(dá)可少于M0，可能表達(dá)部分CD15。1718AML-M2M2與M1的主要區(qū)別是成熟度增加，原始細(xì)胞減少，CD15表達(dá)較M1顯著，CD34弱于M1。CD45-SSC圖顯示從髓系blast區(qū)至成熟骨髓細(xì)胞區(qū)的連續(xù)細(xì)胞帶，CD45SSC圖有助于確定blasts比例。1920AML-M3高顆粒性，表現(xiàn)為較高的SSC，多數(shù)情況HL

3、A-DR陰性或表達(dá)很少，CD34少于M2、一般CD13弱于CD33，大多表達(dá)CD117。M3v低顆粒性，表現(xiàn)為較低的SSC。2122AML-M4/M5兩型表型相似，但M4較M5表達(dá)更多的CD34（），CD45-SSC圖上，不成熟細(xì)胞出現(xiàn)在單核區(qū)，重要的表型為CD13、CD33、HLA-DR、CD14和CD15，CD33可表達(dá)強(qiáng)于CD13。2425AML-M6特征不明顯，HLA-DR，CD34、CD13、CD33、CD19、CD22、CD5、CD7等均陰性，CD45SSC圖顯示主要為CD45陰性區(qū)域為紅系成份，高表達(dá)CD71。2728AML-M7巨核細(xì)胞白血病，在AML中少于1。一般CD61（G

4、pa）和/或CD41（Gpb-a）陽性，特別而注意由于血小板粘附在blasts上造成的假陽性，2930B-ALL31B-ALL32淋巴細(xì)胞增生性疾病33漿細(xì)胞白血病34漿細(xì)胞白血病35T-細(xì)胞白血病36T-細(xì)胞白血病胞漿CD3陽性37慢性淋巴細(xì)胞白血病38套細(xì)胞淋巴瘤39邊緣帶B細(xì)胞淋巴瘤4041吞噬、加工、遞呈抗原42細(xì)胞吞噬功能檢測DEX （ Dextrans，右旋糖苷）。37，DEX-FITC與活細(xì)胞共孵育10min。洗去細(xì)胞外多余的DEX-FITC。流式細(xì)胞儀檢測FL1熒光強(qiáng)度的變化。43細(xì)胞吞噬功能檢測44細(xì)胞吞噬功能檢測的意義單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)是機(jī)體的最初防御系統(tǒng)，有清除或吞噬異物的

5、能力。本試驗可評價此系統(tǒng)的功能。癌癥患者細(xì)胞吞噬功能減低。研究免疫抑制藥物對細(xì)胞的作用。45呼吸爆發(fā)ConAAAPAFIL-8fMLP酪氨酸激酶表面受體G蛋白NADPHoxidaseO2-O2-46中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)肝素抗凝血。調(diào)理后的細(xì)菌為刺激劑；PMA為強(qiáng)刺激劑；fMLP為弱刺激劑。37，刺激后細(xì)胞與二氫羅丹明（DHR）123孵育。流式細(xì)胞儀檢測FL1熒光強(qiáng)度。47中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)48呼吸爆發(fā)的意義慢性肉芽腫癥（chronicgranulomatous disease,CGD），患者的中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞吞噬細(xì)菌后不能產(chǎn)后呼吸爆發(fā)，不能殺滅攝入的致病菌。超氧陰離子可造成正常組織損傷。如類

6、風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。49APC與T細(xì)胞的作用50移植前后CD3陽性T細(xì)胞CD4/CD8細(xì)胞的表達(dá)51移植前后CD3陽性T細(xì)胞CD8/CD28的表達(dá)52移植前后CD4陽性細(xì)胞CD45RA/CD45RO的表達(dá)53人淋巴細(xì)胞CD154的表達(dá)54Th 1/Th2細(xì)胞檢測（三色法） 正常人 MS患者55Th1/Th2細(xì)胞檢測（四色法）56特異性抗原激活淋巴細(xì)胞57移植后免疫檢測CD25較基礎(chǔ)值高出10%，表明即將或已經(jīng)發(fā)生排斥。HLA-DR增加10%，且不伴有CD25增加，提示巨細(xì)胞病毒感染。CD4/CD8小于0.2必須停用免疫抑制劑。58捕獲微球細(xì)胞因子檢測抗體流式細(xì)胞術(shù)檢測可溶性抗原59M:1-6分別代表：

7、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、TNF-a、INF-60流式細(xì)胞術(shù)CBA可溶性細(xì)胞因子檢測，自上而下依次為：IL-2，IL-4，IL-6，IL-10， TNF-a ，IFN-v61MHC四聚體模式圖每條MHC接有一個生物素鏈親和素結(jié)合四個生物素微球蛋白維持MHC正確構(gòu)象肽提供特異性結(jié)合四聚體較單體與CTL結(jié)合穩(wěn)定62Basic Pentamer Staining ProtocolRed cell lysing solution - 5 minsMHC Pentamer(e.g. R-PE)anti-CD8 mAb(e.g. FITC)30 - 45(temp dependent)2

8、x washes+CD8Pentamer2063MHC四聚體技術(shù)的意義四聚體復(fù)合物法具有精確的肽特異性。陽性細(xì)胞數(shù)量與CTL功能密切相關(guān)。分選出正染組細(xì)胞擴(kuò)增，其陽性率由4%上升為90%；負(fù)染組仍為陰性。HBV肝內(nèi)出現(xiàn)大量非HBV特異性淋巴細(xì)胞浸潤。免疫接種效果監(jiān)視。64效應(yīng)細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷作用預(yù)先用CFSE染色K562靶細(xì)胞（發(fā)綠色熒光）。效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞相互作用。用碘化吡啶（PI）染色混合的細(xì)胞?；罴?xì)胞拒染PI。死細(xì)胞膜透性增加，PI進(jìn)入胞內(nèi)與DNA著色，呈紅色。65效應(yīng)細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷檢測66細(xì)胞DNA含量分析碘化吡啶與DNA結(jié)合發(fā)出紅色熒光。熒光強(qiáng)度與DNA含量正比。S期細(xì)胞DNA

9、正在合成。G0/G1期細(xì)胞DNA為G2/M期的一半。異倍體細(xì)胞出現(xiàn)提示惡性細(xì)胞。67流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞DNA含量68BrdU摻入實驗BrdU是類似于胸腺嘧啶脫氧核苷，在細(xì)胞增殖時可摻入DNA鏈中。用酸/堿/酶使DNA鏈解開。熒光素標(biāo)記的抗BrdU單抗孵育。加入PI。流式細(xì)胞儀檢測。69BrdU摻入實驗70CFSE觀察細(xì)胞增殖CFSE (Carboxyfluorescein Succinimidyl ester) 是脂溶性染料，可以被細(xì)胞膜攝取。在488nm激發(fā)波長，發(fā)出綠色熒光。細(xì)胞有絲分裂后，染料平均分配到兩個子代細(xì)胞中。流式細(xì)胞儀檢測，熒光強(qiáng)度下降。71CFSE標(biāo)記的ECV304細(xì)胞共聚焦

10、顯微鏡72熒光染料CFSE作為細(xì)胞標(biāo)記73T細(xì)胞CFSE染色后PMA刺激74多參數(shù)CFSE染色B細(xì)胞增殖75流式細(xì)胞術(shù)計數(shù)淋巴細(xì)胞亞群76單個核細(xì)胞誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞77單個核細(xì)胞誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞78外周血中DC1、DC2檢測DC1增強(qiáng)免疫應(yīng)答能力。DC2主要參與免疫調(diào)理。外周血中DC的確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)為：Lin-（CD3、CD14、CD20、CD19、CD56、CD16）、HLA-DR+DC1為髓樣DC，表達(dá)CD11c。DC2為淋巴樣DC，表達(dá)CD123。79外周血中DC1、DC2檢測80HBV患者DC1、DC2變化81間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志82研究間質(zhì)干細(xì)胞的意義具有很強(qiáng)的自我更新能力、多向分化潛能，還具

11、有相當(dāng)強(qiáng)的可塑性。 支持、改善造血微環(huán)境。免疫調(diào)節(jié)，誘導(dǎo)免疫耐受。基因治療載體細(xì)胞。作為研究細(xì)胞增殖分化的細(xì)胞模型巨大的臨床應(yīng)用前景83凋亡檢測Fas(CD95)/FasL檢測。Bcl-2、COX-2、CX43等檢測。磷脂酰絲氨酸 (PS)在細(xì)胞外膜上的檢測。線粒體膜電位變化的檢測。TUNEL檢測。 DNA Ladder 檢測。84流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞DNA含量85Annexin-V/PI檢測細(xì)胞凋亡86JC-1染色線粒體膜電位877-AAD染色檢測細(xì)胞凋亡88研究化療藥物協(xié)同作用89胞漿鈣離子檢測鈣離子是將信號由胞膜轉(zhuǎn)入胞漿必需的。胞漿鈣離子增高，表示細(xì)胞對刺激產(chǎn)生了應(yīng)答。胞漿鈣離子可以是胞外

12、進(jìn)入的，也可以是內(nèi)部釋放的。流式細(xì)胞儀結(jié)合熒光物質(zhì)可以觀察此現(xiàn)象。如fluo-3-AM。90細(xì)胞胞漿鈣離子測定91CpG-ODN的免疫刺激作用CpG基序（motif）或者稱為免疫刺激序列（immunostimulatory aequences,ISS）是指非甲基化胞嘧定鳥嘌呤（CpG）兩側(cè)具有特定堿基的雙脫氧核苷酸序列。 來源于細(xì)菌DNA，也可人工合成，高效、安全。通過TLR-9 刺激免疫細(xì)胞，發(fā)揮作用。靶細(xì)胞為DC2和B淋巴細(xì)胞。92實驗方法CpG2006、2216由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，全硫代化修飾。對照組為含10%FCS的RPMI1640培養(yǎng)外周血PBMC，細(xì)胞量107，37、5%CO2、48小時。實驗組加入CpG2006或CpG2216，終濃度均為1umol/mL，余同上。93對照組淋巴細(xì)胞CD69表達(dá)94CpG2006誘導(dǎo)細(xì)胞CD69表達(dá)95CpG2216誘導(dǎo)細(xì)胞CD69表達(dá)96CpG-ODN誘導(dǎo)T、B淋巴細(xì)胞CD69表達(dá)CD69表達(dá)率（%） T淋巴細(xì)胞 B淋巴細(xì)胞97CpG誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞CD80與CD86表達(dá)98CpG誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞CD80與CD86表達(dá)CD80 CD86圖CD80CD