1、miRNA研究的新思路GeneCopoeiaTM 4006 020 200唐珍潔GeneCopoeia公司介紹日本Riken： 2004年1月-4月，為Riken提供1600個(gè)人類基因克隆構(gòu)建。Roche： 2006年4月-2007年3月，合作完成13000個(gè)人類基因克隆的無細(xì)胞體系蛋白表達(dá)。NCBI ： 2009年成為NCBI推薦克隆供應(yīng)商。中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院：2006年5月至今，慢病毒載體和哺乳動(dòng)物載體干細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)克隆構(gòu)建，華南地區(qū)特種疾病相關(guān)胚胎干細(xì)胞庫的建立。上海生化所：2007年4月-2007年10月， 300多個(gè)人類激酶組shRNA表達(dá)克隆構(gòu)建與確證。美國NI

2、H（美國國家衛(wèi)生研究院）：2007年7月-2008年1月，3000個(gè)斑馬魚克隆構(gòu)建。美國Novartis（美國諾華制藥）：2009年10月，美國諾華制藥簽約長(zhǎng)期基因克隆供應(yīng)商。提綱miRNA的研究最新進(jìn)展miRNA的文獻(xiàn)計(jì)量分析miRNA研究的思路miRNA研究進(jìn)展-表達(dá)調(diào)節(jié)miRNA研究進(jìn)展-功能探討miRNA的文獻(xiàn)計(jì)量分析miRNA的文獻(xiàn)計(jì)量分析-詞頻分析miRNA的檢測(cè)方法NothernblotMicroarrayQuantitative Real-time PCR新一代測(cè)序qPCR的方法Loop反轉(zhuǎn)錄法Poly A 加尾法 1次RT可檢測(cè)所有miRNA 通用性高； 適合miRNA的高通

3、量檢測(cè) 經(jīng)濟(jì)、方便 每次RT只能檢測(cè)1個(gè)miRNA 特異性高 多個(gè)樣本中檢測(cè)同一miRNA 價(jià)格較高miRNA qPCR 驗(yàn)證引物數(shù)據(jù)庫人、小鼠、大鼠miRNA的Q-PCR引物都通過嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證/product/search/index.php?prt=22輸入miRNA name、Acc No或Sequence等即可獲得驗(yàn)證結(jié)果miRNA qPCR Detection kits Sensitivity以不同量（5g、1g、200ng、20ng、2ng、100pg）的人腦總RNA為模板檢測(cè)hsa-miR-124的表達(dá)量，結(jié)果顯示模板在5g100pg的總RNA范圍內(nèi)都能得到良好的線性擴(kuò)增miR

4、NA表達(dá)量的高通量篩選高通量檢測(cè)，不適合少量miRNA一般都為預(yù)制，做個(gè)性化芯片較難難區(qū)分高度類似結(jié)構(gòu)的miRNA為半定量檢測(cè),檢測(cè)動(dòng)力學(xué)范圍相對(duì)較窄假陰性、假陽性困擾Polay A 加尾法實(shí)現(xiàn)了高通量檢測(cè)，定制靈活A(yù)rray plate 采用了Ready-to-go 包裝形式，使用簡(jiǎn)便利用了qPCR 檢測(cè)的特異性及其靈敏度檢測(cè)動(dòng)力學(xué)范圍可達(dá)7個(gè)數(shù)量級(jí)使用方式多樣，可直接定購也可有交公司完成miRNA chipmiRNA qPCR ArraymiRNA Q-PCR Array Reproducility R2Test-1Test-2Test-3Test-4Test-11.0000 0.9922

5、 0.9939 0.9933 Test-20.9922 1.0000 0.9925 0.9928 Test-30.9939 0.9925 1.0000 0.9917 Test-40.9933 0.9928 0.9917 1.0000 All-in-OneTM miRNA qPCR Array 案例Differential expression of miRNAs in CRCmiRNA Bioinfo analysis內(nèi)容：1：miRNA序列及同源性分析2：miRNA靶標(biāo)的計(jì)算機(jī)分析相關(guān)數(shù)據(jù)庫： miRBase： microrna.sanger.ac.uk PICTAR: TARGERSCAN

6、: miRNA function analysis功能獲得研究：把miRNA導(dǎo)入到細(xì)胞，進(jìn)行研究 miRNA mimics miRNA expression clones功能缺失研究：抑制miRNA的表達(dá) miRNA 抑制劑 miRNA抑制劑表達(dá)克隆miRNA的靶標(biāo)確證miRNA過表達(dá)試驗(yàn)-miRNA表達(dá)克隆miRNA表達(dá)框已完全測(cè)序確證 基于慢病毒載體系統(tǒng)的表達(dá)克隆可轉(zhuǎn)染未分化細(xì)胞和難轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，獲得與普通分化細(xì)胞類似的轉(zhuǎn)染效率 通過應(yīng)用eGFP可以監(jiān)測(cè)病毒和質(zhì)粒載體的轉(zhuǎn)染效率使用案例-miRNA前體表達(dá)克隆 miRNA抑制表達(dá)試驗(yàn)-Mechanism of miRNA inhibitor

7、cloneAnalysis of the sub-cellular localization of TuD RNAsY4 scRNA: cytoplasmic RNA; ACA1 snoRNA: nucleolar RNA Un: untransduced cells；N: nucleus; C: cytoplasm5p: TuD-miR140-5p-transduced cells; 3p: TuD-miR140-3p-transduced cellsmiRNA靶標(biāo)確證-靶標(biāo)確證克隆構(gòu)建的載體為含雙熒光報(bào)告基因；螢火蟲熒光素酶 （hLuc）同miRNA靶標(biāo)融合表達(dá)，用于監(jiān)控miRNA對(duì)靶標(biāo)的

8、作用效果；海腎熒光素酶（hRLuc），可作為內(nèi)參進(jìn)行轉(zhuǎn)染和表達(dá)效率檢測(cè)miRNA靶標(biāo)確證-單個(gè)靶標(biāo)鑒定microRNAhLucTranslationLightNo Light使用案例- miRNA UTR target clone miRNA靶標(biāo)確證-高通量篩選利用miRNA表達(dá)克隆和抑制克隆，結(jié)合免疫共沉淀進(jìn)行高通量miRNA靶標(biāo)確證miRNA靶標(biāo)確證-高通量篩選miRNA expression clone trasfectionmiRNA inhibition clone trasfection細(xì)胞裂解免疫共沉淀提取復(fù)合物中的RNA進(jìn)行定量PCR檢測(cè)或者測(cè)序捕獲復(fù)合物miRNA作用機(jī)制研究

9、-Knockdown experimentTransfection or viral deliveryshRNA or siRNAqRT-PCRqRT-PCR arrayWestern blotmiRNA作用機(jī)制研究- shRNA expression cloneRNA Polymerase III expression Pol III promoters (e.g. U6, H1) guaranteed knockdown even in difficult-to-transfect cellsmiRNA作用機(jī)制研究-Over-expression experimentCloningTran

10、sfection AnalysisTranscriptional assayWestern blot Localization（fusion tags）Expression SystemmiRNA作用機(jī)制研究- ORF克隆表達(dá)載體原核表達(dá)載體哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體慢病毒表達(dá)載體其他表達(dá)載體酵母/昆蟲/無細(xì)胞miRNA Delivery病毒包裝慢病毒（Lentivirus）穩(wěn)定轉(zhuǎn)染慢病毒顆粒侵染案例 慢病毒進(jìn)入細(xì)胞后，病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)入細(xì)胞核，并且穩(wěn)定地插入到宿主基因組慢病毒包裝試劑盒的應(yīng)用GeneCopoeiaTM提供的產(chǎn)品和服務(wù)表達(dá)譜分析慢病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)功能研究作用機(jī)理 All-in-One miRNA qPCR Primer Array All-in-One miRNA qPCR 檢測(cè)試劑盒 All-in-One miRNA Q-PCR 檢測(cè)驗(yàn)證引物 miRNA q