1、凝固酶陰性葡萄球菌致病性分子標志物的建立與應用姜美娟中國人民解放軍第401醫(yī)院 凝固酶陰性葡萄球菌1凝固酶陰性葡萄球菌凝固酶陰性葡萄球菌11、立題依據(jù)凝固酶陰性葡萄球菌（CoNS）廣泛存在于人體皮膚、黏膜等組織表面，常在血液、痰液、尿液、深靜脈置管等各種標本中檢出。 文獻報道，1995-1996年美國48個醫(yī)學中心2596份血標本中， CoNS的分離率達32.2%。 盡管血液等無菌體液培養(yǎng)出CoNS臨床意義較大，但據(jù)報道單次血培養(yǎng)CoNS污染的可能性仍高達85%。第一部分 研究背景和意義凝固酶陰性葡萄球菌21、立題依據(jù)凝固酶陰性葡萄球菌（CoNS）廣泛存在于人體皮膚近年來由于介入性診療操作、免

2、疫抑制劑及廣譜抗生素的廣泛使用，CoNS已成為院內(nèi)感染的重要病原菌，而且耐藥菌株比金黃色葡萄球菌更為多見。 葉聯(lián)華等報道人工瓣膜術后心內(nèi)膜炎中，約有40%-50%由凝固酶陰性葡萄球菌引起； 2009年中國CHINET細菌耐藥監(jiān)測結果MRCoNS檢出率平均為71.7%,大于MRSA的52.7%。研究背景和意義凝固酶陰性葡萄球菌3近年來由于介入性診療操作、免疫抑制劑及廣譜抗生素的廣泛使用，CoNS 作為皮膚黏膜定植菌，在越來越多的標本中被分離出來，常常引起臨床困惑。其是否能作為感染的病原菌是臨床關心的問題。有鑒于此，實驗室建立對CoNS污染菌和致病菌界定的方法十分必要，是臨床明確診斷和制定合理治療

3、方案的重要前提 。研究背景和意義凝固酶陰性葡萄球菌4CoNS 作為皮膚黏膜定植菌，在越來越多的標本中被分離出來，CoNS致病物質(zhì)在 CoNS 感染的發(fā)病過程中，細菌先黏附繼而形成難以清除的生物膜是其最為重要的致病機制 ；其中CoNS產(chǎn)生的多糖胞間黏附素（polysacchatide intercellular adhesion，PIA）是細菌生物膜形成聚集階段所必需的物質(zhì)，在感染過程中起重要的作用，是鑒定其致病性的物質(zhì)基礎。 Heilmann 等發(fā)現(xiàn) ica 操縱子對合成 PIA 以及在細菌形成成熟的生物膜中起到非常重要的作用。 研究背景和意義凝固酶陰性葡萄球菌5CoNS致病物質(zhì)在 CoNS

4、感染的發(fā)病過程中，細菌先黏附繼ica 基因結構ica 基因座定位于細菌染色體，全長 3.4 kb，包括 icaR 調(diào)節(jié)基因及串聯(lián)存在的 icaA、icaD、icaB 和 icaC 結構基因。 其中，icaADBC 4 個基因構成一個操縱子，可以通過檢測 icaADBC 基因來反映ica 操縱子的存在。 icaB 不直接參與胞間黏附素的合成,因為重組icaADC 就能使細胞積聚； icaA 單獨呈現(xiàn)低的N-乙酰葡糖胺轉移酶活性； icaC涉及到把不斷合成的多糖物質(zhì)轉運至細胞表面； 生物膜的形成要求icaD編碼的產(chǎn)物具有最佳活性。 因此,我們選擇了icaD 作為本試驗的目的基因片段。研究背景和意義

5、凝固酶陰性葡萄球菌6ica 基因結構ica 基因座定位于細菌染色體，全長 3.4獲得CoNS特異的致病性分子標志物；確立敏感、準確、快速的醫(yī)院感染相關性CoNS特異基因診斷方法；能夠準確鑒定致病性與非致病性CoNS。研究背景和意義 2、實驗目的 凝固酶陰性葡萄球菌7獲得CoNS特異的致病性分子標志物；研究背景和意義 2、實驗 研究CoNS的生物標志物對該菌在醫(yī)院獲得性感染中的臨床微生物學診斷與鑒定，追蹤傳染源，探索其在醫(yī)院感染中的確切作用和地位、傳播與感染規(guī)律，從而對控制傳播途徑、建立準確有效的防治措施具有重要實際意義和經(jīng)濟價值。研究背景和意義 3、臨床意義凝固酶陰性葡萄球菌8 研究CoNS的

6、生物標志物對該菌在醫(yī)院獲得性陰性對照：表皮葡萄球菌ATCC12228，購自中國藥品鑒定所，經(jīng)基因組測序證明其ica操縱子缺失 ；陽性對照：表皮葡萄球菌1-97-337，瑞金醫(yī)院倪語星教授惠贈，含有完整ica操縱子；待測樣本：自2006年1月至2007年9月，收集我院臨床各科室共114例疑是感染性標本。 第二部分 材料和方法1、研究對象凝固酶陰性葡萄球菌9陰性對照：表皮葡萄球菌ATCC12228，購自中國藥品鑒定所2、主要試劑培養(yǎng)基： 哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基、 剛果紅瓊脂 培養(yǎng)基、 LB肉湯增菌液。引物： SodA引物（ 5-CCITAYICITAYGAYGCIYTIGARCC-3 及 5-ARRT

7、ARTAIGCRTGYTCCCAIACRTC-3）； icaD引物（5-AGGCAATA TCCAACGGTAA-3及 5-GTCACGACCTTTCTTATATT-3）； 16S rDNA 引物（5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3及 5-CCGTCAATTCCATTTRAG TTT-3）。 材料和方法凝固酶陰性葡萄球菌102、主要試劑培養(yǎng)基： 哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基、 剛果紅瓊脂 3、主要儀器設備PCR儀：PTC100 PCR儀，美國MJ Research Inc.；恒壓恒流電泳儀、電泳槽：DF-C型，北京東方特力科貿(mào)中心；凝膠成像系統(tǒng)：GDS8000 ，美國UVP Inc.； 核

8、酸/蛋白定量儀：DU640，美國Beckman；酶標儀：美國雷杜，深圳組裝；ATB Expression：法國bioMrieux Inc；生物安全柜：BSC-1500 B2，濟南鑫貝西生物技術有限公司；全自動快速微生物培養(yǎng)檢測系統(tǒng)：BacT/ALERT 3D 60，法國bioMrieux Inc；材料和方法凝固酶陰性葡萄球菌113、主要儀器設備PCR儀：PTC100 PCR儀，美國MJ 4、實驗設計及方法標本采集陰、陽性對照菌種鑒定PIA檢測PCR擴增icaD基因sodA基因16SrDNA序列生物膜形成實驗DNA測序、生物信息學分析確定特征片段臨床驗證比較分析材料和方法凝固酶陰性葡萄球菌124

9、、實驗設計及方法標本采集陰、陽性對照菌種鑒定PIA檢測PC圖2.1： 部分樣品剛果紅試驗結果34 1、剛果紅試驗第三部分 結果和討論凝固酶陰性葡萄球菌13圖2.1： 部分樣品剛果紅試驗結果34 1、剛果紅試驗第三部表2.1: 114例CoNS的菌種組成及剛果紅試驗結果菌 種例數(shù)所占比例（）剛果紅試驗陽性剛果紅試驗各菌種陽性率（）表皮葡萄球菌4741.21838.3溶血葡萄球菌4337.736.98人葡萄球菌119.6519.09木糖葡萄球菌32.630沃氏葡萄球菌21.750頭狀葡萄球菌32.63133.3中間葡萄球菌10.861100山羊葡萄球菌21.750緩慢葡萄球菌合計21141.751

10、00024結果和討論凝固酶陰性葡萄球菌14表2.1: 114例CoNS的菌種組成及剛果紅試驗結果菌剛果紅試驗通過培養(yǎng)48h后菌落的顏色變化來反映 CoNS 表達多糖胞間黏附素的情況，進而間接地反映其致病性。114例樣品中剛果紅試驗陽性率21.1%，由于CoNS分泌的PIA在培養(yǎng)過程中可以丟失，使陽性結果偏低；另外，其方法學本身易于受多種因素影響，比如：蔗糖的濃度、氯化鈉和瓊脂的濃度、氣體條件等，干擾了實驗結果的正確性，不能滿足臨床要求。 結果和討論凝固酶陰性葡萄球菌15剛果紅試驗通過培養(yǎng)48h后菌落的顏色變化來反映 CoNS 表2、ica D基因片段的擴增 a b c d e f g20001

11、000500250(bp)圖2.2 ：部分樣品的icaD基因片段的 PCR 擴增結果結果和討論凝固酶陰性葡萄球菌162、ica D基因片段的擴增 a b 表2.2: 114例CoNS不同菌種icaD片段PCR擴增的結果 菌 種例數(shù)所占比例（） icaD片段PCR陽性結果 PCR實驗各菌種陽性率（）表皮葡萄球菌4741.22042.6溶血葡萄球菌4337.7818.6人葡萄球菌119.65218.2木糖葡萄球菌32.630沃氏葡萄球菌21.750頭狀葡萄球菌32.6266.7中間葡萄球菌10.861100山羊葡萄球菌21.750緩慢葡萄球菌合計21141.75100033結果和討論凝固酶陰性葡萄

12、球菌17表2.2: 114例CoNS不同菌種icaD片段PCR擴增的通過設計icaD基因的特異性引物，對臨床分離的114 株CoNS進行PCR 循環(huán)擴增，29%（33/114）的菌株可以檢測到357bp 的icaD 基因產(chǎn)物； 表明大部分 CoNS 不表達胞外多糖，無致病性，或者臨床分離的絕大部分 CoNS 可能是低毒性，源于正常菌群的污染。采用 PCR 技術對 ica 操縱子結構基因片段進行擴增，可以準確、快速地鑒定CoNS中致病性與非致病性的葡萄球菌，從而對臨床凝固酶陰性葡萄球菌的正確診斷和合理治療提供實驗室依據(jù)，有重要的臨床意義。 結果和討論凝固酶陰性葡萄球菌18通過設計icaD基因的特

13、異性引物，對臨床分離的114 株Co圖2.3 : 部分樣品的定性黏附性實驗結果 3、體外黏附性實驗 結果和討論凝固酶陰性葡萄球菌19圖2.3 : 部分樣品的定性黏附性實驗結果 3、體外黏 表2.4 : 9例icaD（ + ）菌株半定量黏附性實驗結果實驗分類實驗例數(shù)黏附實驗陽性黏附實驗陰性ica D PCR（），剛果紅（）660ica D PCR（），剛果紅（）321合計981 結果和討論凝固酶陰性葡萄球菌20 表2.4 : 9例icaD（ + ）菌株半定量黏附性實驗通過體外半定量黏附實驗測得88.9%（8/9）icaD（ + ）菌株是粘附株?？梢娨园攵筐じ皆囼灲Y果作為生物膜形成能力的判定標準

14、，ica 操縱子的存在與CoNS粘附及其生物膜形成密切相關。體外黏附性實驗用光吸收原理檢測生物膜成分，但生物膜本身的結構會受到破壞；且由于方法比較復雜，需要嚴格控制實驗條件才能獲得較好的重復性，不適合臨床常規(guī)應用。 結果和討論凝固酶陰性葡萄球菌21通過體外半定量黏附實驗測得88.9%（8/9）icaD（ +4、16S rDNA及sodA基因片段擴增 a b c d e 20001000500100(bp)圖2.5：部分樣品的16S rDNA片段 PCR擴增結果 結果和討論凝固酶陰性葡萄球菌224、16S rDNA及sodA基因片段擴增 a 圖2.6： 部分樣品的sodA 片段PCR 擴增結果

15、a b c d e 20001000500250(bp) 結果和討論凝固酶陰性葡萄球菌23 圖2.6： 部分樣品的sodA 片段PCR 擴增結果 圖7： 部分樣品sodA PCR擴增產(chǎn)物的測序圖譜 結果和討論凝固酶陰性葡萄球菌24圖7： 部分樣品sodA PCR擴增產(chǎn)物的測序圖譜 結果和討 37例CoNS樣品進行了16S rDNA基因及sodA基因片段的PCR擴增，電泳檢測結果顯示全部樣品均能準確地擴增出相應的片段，其片段大小分別為16S rDNA 926bp及sodA 482bp，且均為單一條帶；序列測定表明所有樣品16S rDNA 及sod A PCR產(chǎn)物序列均相同，未發(fā)現(xiàn)與感染相關的特異

16、性分子序列。 結果和討論凝固酶陰性葡萄球菌25 37例CoNS樣品進行了16S rDNA基因及sodA基因ica操縱子可出現(xiàn)在多種CoNS中，臨床實驗室建立并常規(guī)進行CoNS致病性分子標志物的檢測方法是有意義、有必要的；通過本實驗我們確立了的敏感、準確、快速的醫(yī)院感染相關性CoNS基因診斷新方法，即ica D基因擴增方法； 第四部分 結論凝固酶陰性葡萄球菌26ica操縱子可出現(xiàn)在多種CoNS中，臨床實驗室建立并常規(guī)進行結論本研究首次報道了除表皮葡萄球菌以外的其他種的凝固酶陰性葡萄球菌產(chǎn)生多糖胞間粘附因子的情況；表皮葡萄球菌在臨床CoNS中檢出最多，是攜帶icaD操縱子的主要菌種，其致病性應引起足夠重