1、第九章 高效液相色譜法 High Performance Liquid Chromatography (HPLC)第一節(jié) 概述一、高效液相色譜法的發(fā)展早期液相色譜，分析時間仍然很長!當(dāng)加壓增加流速(真空或空氣泵)時，柱效下降了。減小填充物的粒徑（310 m ）! 直到60年代末70年代初，由于在高壓下操作的液壓設(shè)備、高效固定相以及高靈敏檢測器的出現(xiàn)及發(fā)展，才徹底解決了分析時間及柱效的問題。即所謂的高效液相色譜技術(shù)才真正得到廣泛應(yīng)用。HPLC與LC比，具有高效、高靈敏度、高速的特點。二、HPLC與GC的比較GCHPLC應(yīng)用范圍永久氣體、低分子量、低沸點、低極性、熱穩(wěn)定的物質(zhì)（僅占有機物總數(shù)的20

2、%） 樣品制成溶液，可以測定高沸點、高分子量、極性強、具有生物活性、熱穩(wěn)定性差化合物（約占有機物總數(shù)80%） 分離機制樣品與固定相之間的選擇作用，流動相起運載作用，對組分作用小。 樣品、流動相和固定相三者之間的選擇性作用完成分離。流動相除起運載作用外，還與組分作用，并與固定相對組分產(chǎn)生競爭作用。操作溫度需將樣品氣化，高溫操作室溫下操作三、分類（依分離機理不同）類型主要分離機理主要分析對象或應(yīng)用領(lǐng)域吸附色譜吸附能異構(gòu)體分離、族分離，制備分配色譜分配作用各種有機化合物的分離、分析與制備凝膠色譜溶質(zhì)分子大小高分子分離，分子量及其分布的測定離子交換色譜庫侖力無機離子、有機離子分析離子排斥色譜Donna

3、n膜平衡有機酸、氨基酸、醇、醛分析離子對色譜疏水分配作用離子性物質(zhì)分析疏水作用色譜疏水分配作用蛋白質(zhì)分離與純化手性色譜立體效應(yīng)手性異構(gòu)體分離，藥物純化親和色譜生化特異親和力蛋白、酶、抗體分離，生物和醫(yī)藥分析第二節(jié) 高效液相色譜儀 儀器框架結(jié)構(gòu)及工作流程輸液系統(tǒng)進樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理及控制系統(tǒng)廢液收集一、輸液系統(tǒng)1.作用：提供純凈的、連續(xù)的、穩(wěn)定的流動相2.組成（1)貯液系統(tǒng)流動相在線脫氣裝置貯液瓶：裝有流動相0.45um不銹鋼過濾器(2)高壓泵：往復(fù)式恒流柱塞泵梯度洗脫裝置高壓梯度洗脫低壓梯度洗脫輔助設(shè)置：管道過濾器、脈動陰尼器、壓力傳感器、流量測量裝置等。(3)其它（1）流動相有機

4、溶劑：如乙腈、甲醇等水 溶 液：緩 沖 液：如一定pH、一定鹽濃度的檸檬酸鉀緩沖鹽溶液等。混合溶液：注：與GC載氣不同，HPLC流動相對組分有作用力，與固定相對組分競爭作用。改變流動相的性質(zhì)和組成，是提高色譜系統(tǒng)分離度和分析速度的重要手段。主洗脫劑：決定分離情況。極性調(diào)節(jié)劑：調(diào)節(jié)試樣的保留時間。（2）高壓輸液泵作用：將流動相以穩(wěn)定的流速或壓力輸送到色譜系統(tǒng)。活塞型往復(fù)泵使用最廣泛的一種恒流泵（3）脫氣裝置為什么流動相要脫氣氣泡進入檢測器色譜圖會出現(xiàn)尖銳的噪音峰。小氣泡慢慢聚集成大氣泡，進入流路或色譜柱會使流動相的流速變慢或流速不穩(wěn)，使基線起伏。氣泡進入色譜柱，排出氣泡很費時間。熒光檢測中，溶解

5、氧會使熒光淬滅。溶解氣體可能引起某些樣品的氧化。使溶液的pH值發(fā)生變化。脫氣方法離線脫氣在線脫氣超聲波振蕩脫氣加熱回流脫氣真空脫氣在線真空脫氣惰性氣體鼓泡吹掃脫氣（4）梯度洗脫裝置梯度洗脫：分離過程中按一定程序連續(xù)改變流動相的配比和極性以提高分離效果（類似GC中的程序升溫）。相同不同GC-程序升溫目的相同：提高分離效果。改變柱溫HPLC-梯度洗脫改變流動相的組成或濃度 為使保留值相差很大的多種成分在合理的時間內(nèi)全部洗脫并達(dá)到相互分離。為什么要進行梯度洗脫？等度，流動相：80%乙腈水溶液等度，流動相：100%乙腈色譜柱：Diamosil C18(2)，250*4.6mm，5m 流速：1.0ml/

6、min 檢測器：UV254nm梯度：0-5min,乙腈由70%升到90%， 5-10min乙腈由90%上升到100%， 10-18min，乙腈100%1.鄰苯二甲酸二甲酯（DMP） 2.鄰苯二甲酸二乙酯（DEP） 3.鄰苯二甲酸二正丙酯（DPrP） 4.鄰苯二甲酸丁基芐基酯（BBP） 5.鄰苯二甲酸正丁酯（DBP） 6.鄰苯二甲酸二戊酯（DPP） 7.鄰苯二甲酸二環(huán)已酯（DCHP） 8.鄰苯二甲酸二已酯（DHP） 9.鄰苯二甲酸（2-乙基已基）酯（DEHP）二、進樣器1.作用：將樣品準(zhǔn)確送入色譜柱進行分離。2.進樣方式：手動進樣 自動進樣3.常用：六通閥進樣采樣位置進樣位置柱入口柱入口泵泵出口

7、孔出口孔三、色譜分離系統(tǒng)（一）作用：分離（二）組成：柱箱色譜柱色譜柱管固定相（三）色譜柱1. 色譜柱的構(gòu)成色譜柱管：內(nèi)部拋光的直型不銹鋼管。標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)徑4.6或3.9mm，柱長1530cm。色譜填料（固定相）：粒度510m的球形顆粒，填充在色譜柱管內(nèi)。發(fā)展趨勢是減小填料粒度(35m)和柱徑和柱長以提高柱效。（四）固定相=基質(zhì)+功能層1.基質(zhì)（載體或擔(dān)體）：表面多孔球形顆粒。（1）作用：功能層的載體。對分離不起明顯作用。（2）常用：硅膠和有機高分子聚合物微球。硅膠：應(yīng)用最廣泛的一種多孔活性物質(zhì)（1）優(yōu)點：機械強度高，不溶脹，不收縮適用溶劑極性范圍寬比表面積大，柱效高（2）缺點表面有過多的疏水基和硅醇

8、基，引起蛋白質(zhì)不可逆吸附。只能在pH2-7.5范圍內(nèi)使用。2.功能層 通過化學(xué)或物理的方法固定在基質(zhì)表面的、對樣品分子的保留起實質(zhì)作用的有機分子或功能團。四、檢測器作用：依樣品組分與流動相某物化性質(zhì)的不動，感受至樣品組分的進入，并依據(jù)組分的濃度變化或質(zhì)量變化產(chǎn)生電信號，放大后送給記錄儀。分類：依應(yīng)用范圍不同通用型專用型紫外可見光檢測器熒光檢測器示差折光檢測器電導(dǎo)檢測器1.紫外-可見光檢測器（UV-VIS）（1）原理：朗伯-比爾定律（2）結(jié)構(gòu)及工作過程光源（氘燈）單色器石英窗接色譜柱廢液微量吸收池光電倍增管通常其光程為20mm, 體積約為110 L。（3）應(yīng)用：可吸收紫外-可見光化合物（共軛結(jié)構(gòu)

9、）（4）特點靈敏度高（10-610-9 g/ml），線性范圍寬?？捎糜谔荻认疵?。不能測對紫外-可見光無吸收的物質(zhì)。流動相選擇有限制。（流動相截止波長必須小于檢測波長）常選max做測量波長（靈敏度高），但為了選擇性或其它目的而選吸收稍弱的波長。光電二極管陣列檢測器（Photo-diode-arry detector PDAD)2.熒光檢測器 (Fluorescence detector；FD)（1）原理：F=KC（2）結(jié)構(gòu)及工作過程（3）應(yīng)用:熒光物質(zhì)(特別是芳香族化合物、生化物質(zhì)，如有機胺、維生素、激素、酶等)（4）特點靈敏度高。比紫外-可見檢測法高2-3個數(shù)量級。選擇性好。所需樣品量很少，特

10、適合于藥物和生化樣品的分析。干擾多：溶劑純度、pH、檢測溫度、實驗材料、器皿等3.示差折光檢測器（Differential refractometers,RI)（1）原理：（2）結(jié)構(gòu)及工作過程（3）應(yīng)用:所有物質(zhì)。對于無紫外吸收的物質(zhì)（如高分子化合物、糖類、脂肪烷烴）比較適合。凝膠色譜中必備檢測器，在制備色譜中常使用。（4）特點：通用型靈敏度低，比其他檢測方法低1-3個數(shù)量級，不宜做痕量分析。對溫度及流速敏感，不能用于梯度洗脫。各種檢測器比較UVFluRI應(yīng)用共軛結(jié)構(gòu)物質(zhì)環(huán)狀共軛結(jié)構(gòu)物質(zhì)通用梯度洗脫是是否線性范圍1034103104檢出限(g/mL)10-1010-12 -1110-7溫度穩(wěn)定

11、性好好差流動相選擇截止波長小于測量波長不產(chǎn)生熒光無要求UVFluRI主要特點對流速和溫度變化敏感；池體積可制作得很??；對溶質(zhì)的響應(yīng)變化大。 選擇性和靈敏度高；易受背景熒光、消光、溫度、pH和溶劑的影響。 可檢測所有物質(zhì)；不適合微量分析；對溫度變化敏感 第三節(jié) 液相色譜分離模式一、液-固吸附色譜（ Liquid-Solid Adsorption Chromatography LSAC）1.原理madadmnMXnMX+不同組分吸附系數(shù)（Ka）不同極性非極性：如活性碳高分子多孔微球：苯乙烯和二乙烯基苯交聯(lián)而成。酸性：如硅膠、硅酸鎂等。適于分離堿性組分，如脂肪胺，芳香胺等堿性：如氧化鋁、氧化鎂、聚酰

12、胺等。適分離酸性組分，如酚、羧等。2.固定相：固體吸附劑（活性硅膠、氧化鋁、活性炭、聚乙烯、聚酰胺等）。較常使用的是510m的活性硅膠吸附劑。3.流動相非極性與極性溶劑的一元或多元溶劑（如二氯甲烷/甲醇、乙酸乙酯/乙腈）。常用弱極性有機溶劑，如正構(gòu)烷烴（己烷、戊烷、庚烷等）做流動相。4.應(yīng)用范圍：同分異構(gòu)體和族分離。如農(nóng)藥異構(gòu)體分離、石油中烷、烯、芳烴的分離。二、液-液分配色譜(LLPC)(Liquid-Liquid Partition Chromatography)1.原理：基于樣品分子在流動相和固定相間的溶解度不同（分配作用）而實現(xiàn)分離的液相色譜分離模式。正相分配色譜：固定相極性流動相極性

13、反相分配色譜：固定相極性流動相極性固定液流動相適用范圍洗脫順序正相極性非極性主體為正已烷/庚烷分離極性較強的水溶性樣品非極性組分先洗脫出來反相非極性極性主體為水/甲醇/乙腈分離脂溶性樣品極性組分先流出來2.分類4.固定相基質(zhì)：固定液3.流動相：與固定相不互溶，且極性差異越大越好。注：由于液相色譜中，流動相參與選擇作用，流動相極性的微小變化，都會使組分的保留值出現(xiàn)較大的差異。因此，液相色譜中，只需幾種不同極性的固定液即可。如， 氧二丙腈（ODPN），聚乙二醇（PEG），十八烷（ODS）和角鯊?fù)楣潭ㄒ旱?。極性鍵合固定相：鍵合在載體表面的功能分子是具有二醇基、醚基、氰基、氨基等極性基團的有機分子。非

14、極性鍵合固定相：鍵合在載體表面的功能分子是烷基、苯基等非極性有機分子。如最常用的ODS（Octa Decyltrichloro Silane）柱或C18柱就是最典型的代表，它是將十八烷基三氯硅烷通過化學(xué)反應(yīng)與硅膠表面的硅羥基結(jié)合，在硅膠表面形成化學(xué)鍵合態(tài)的十八烷基，其極性很小。固定液易流失化學(xué)鍵合相色譜三、離子交換色譜(Ion-Exchange Chromatography IEC)1.原理：組分在固定相上發(fā)生的反復(fù)離子交換反應(yīng)；交換系數(shù)大，保留時間長；一般，離子電荷數(shù)越多，水合離子半徑越小，交換系數(shù)越大，保留時間越長。2.固定相：離子交換劑，常用有樹脂和硅膠陽離子交換劑陰離子交換劑強酸性：-

15、SO3H弱酸性：-COOH強堿性：-NR3弱堿性：- NH23.流動相：一定pH值的緩沖鹽溶液。固定相陽離子交換劑陰離子交換劑流動相酸性緩沖鹽溶液堿性緩沖鹽溶液（1）加入有機溶劑提高組分的溶解度，且能改變選擇性。（2）pH：升高陽離子交換過程樣品離子的保留值下降陰離子交換過程樣品離子的保留值上升（3）離子強度（鹽濃度）：升高，降低組分的保留值。4.應(yīng)用范圍：凡在溶劑中能電離的物質(zhì)。如：有機酸、氨基酸、肽類、核酸、蛋白質(zhì)等。3.流動相（續(xù)）四、體積排阻色譜（凝膠色譜法、空間排阻色譜法）(Size Exclusion Chromatography SEC)1.原理：以多孔性物質(zhì)作固定相，樣品分子受固定相孔徑大小的影響而達(dá)到分離的一種液相色譜分離模式。2.固定相：化學(xué)惰性的多孔性材料，如聚苯乙烯凝膠、親水凝膠、無機多孔材料等。類型材料特點流動相軟質(zhì)葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠溶脹、不適于HPLC，用于低壓色譜，分離小