1、胎盤貼壁細胞的生物學(xué)特性【關(guān)鍵詞】胎盤；貼壁細胞；干細胞Bilgialharateristisfplaentaderivedadherentells【Abstrat】AI:Tislateandulturehuanplaentaderivedadherentells(hPDA)invitrandstudythEirbilgialharateristisinvlvingrphlgy,phentypeanddifferentiatin.ETHDS:nnulearellsereharvestedafterplaentatissueasdigestedbyllagenaseIV,seededandult

2、uredinlgluseDEntaining100L/LFBS.Theirsurfaearkerseredetetedbyflytetry;thegrthurveasade;ellsf3passagesereinduedtdifferentiateintsteblastsithvitain,dexaethasneandsdiuglyerphsphate,andtheinduedellserebservedinthehangefatrixineralizatinithalizarinredstaining;ellsf3passagesereinduedtdifferentiateintlipyt

3、esithdexaethasneandinsulin,andtheinduedellserebservedithilredstaining.RESULTS:Byday7-14,afefadherentellserebservedandexpandedthesaeasfibrblasts,andadherentellserepsitivefrD29,D44andD105,butnegativefrD34,D45,D19.After10dayindutin,alizarinredstainingshedthealiuineralizatinandafter7d,ilredstainingrevea

4、ledtheappearaneffatdrps.NLUSIN:ThehPDAasnfiredthavethestegeniandadipgeniptentials,indiatingthattheyuldberegardedasanalternativesurefsteells.【Keyrds】plaenta;adherentells;steells【摘要】目的：通過體外別離和培養(yǎng)胎盤貼壁細胞，以研究其形態(tài)、表型和分化特點.方法：采用IV型膠原酶消化人胎盤組織，獲得單個核細胞，接種于100L/LFBS低糖DE培養(yǎng)基中，貼壁后常規(guī)換液、傳代，流式細胞儀檢測其外表標(biāo)志，繪制生長曲線.采用甘油磷酸鈉

5、、維生素、地塞米松結(jié)合誘導(dǎo)，使胎盤貼壁細胞分化為成骨細胞，誘導(dǎo)后10d行茜素紅染色；采用地塞米松、胰島素誘導(dǎo)，使胎盤貼壁細胞分化為脂肪細胞，油紅染色鑒定.結(jié)果：培養(yǎng)714d后有少量貼壁細胞生長，逐漸呈成纖維細胞狀，表達D29，D44和D105，不表達D34，D45，D19；在成骨誘導(dǎo)10d后細胞茜素紅染色可見鈣鹽沉積，成脂肪誘導(dǎo)7d后油紅染色見脂肪滴形成.結(jié)論：通過不同方式誘導(dǎo)培養(yǎng)，胎盤貼壁細胞可分化為成骨細胞及脂肪細胞，提示胎盤貼壁細胞可能是新的干細胞來源.【關(guān)鍵詞】胎盤；貼壁細胞；干細胞0引言間充質(zhì)干細胞arrstralell,S主要來源于骨髓，可以分化為多種組織細胞：成骨、軟骨、脂肪、神

6、經(jīng)細胞等，但隨著年齡增長或合并感染、腫瘤等疾病時骨髓干細胞的分化才能明顯下降，因此尋找新的干細胞成為當(dāng)務(wù)之急.近幾年來有學(xué)者發(fā)現(xiàn)胎盤組織中存在S.為進一步證實這一發(fā)現(xiàn)，我們從胎盤中提取貼壁細胞，觀察其生物學(xué)特性，以討論其是否具有干細胞特性.1材料和方法1.1材料足月剖宮產(chǎn)的胎盤產(chǎn)婦同意，低糖DEGib公司，新生牛血清FBS，Gib公司，IV型膠原酶Siga公司，胰蛋白酶Siga公司，鼠抗人單克隆抗體D19，D44，D45，D105，D34，D29晶美公司，茜素紅Siga，油紅Siga，倒置顯微鏡lypas，2培養(yǎng)箱Juan.1.2方法1.2.1胎盤貼壁細胞的別離和培養(yǎng)取足月剖宮產(chǎn)胎盤，剪取胎兒

7、側(cè)胎盤組織，PBS反復(fù)沖洗，剪成碎塊，以1g/LIV型膠原酶37消化30in，取上清液，以800r/in離心5in，沉淀物重復(fù)消化，搜集每次離心后的細胞沉淀，PBS沖洗2遍，以1107/L的密度接種于100L/LFBSDE培養(yǎng)基中，貼壁后35d換液1次，取傳3代以上細胞備用.1.2.2胎盤貼壁細胞的表型測定取第3代細胞，以2.5g/L胰蛋白酶消化3in，100L/LFBS終止消化，PBS沖洗2遍，調(diào)整細胞數(shù)為1104/L，分別參加鼠抗人單克隆抗體D19,D44,D45,D105,D34，流式細胞儀檢測細胞表型.1.2.3生長曲線的繪制取第3代細胞，以2107/L的密度接種于12孔板中，每日取3

8、復(fù)孔，臺盼藍染色計數(shù)活細胞，連續(xù)培養(yǎng)計數(shù)7d，計算平均值，繪制生長曲線.1.2.4細胞周期測定取第3代細胞，以2.5g/L胰蛋白酶消化3in，10l/LFBS終止消化，PBS沖洗2遍，調(diào)整細胞數(shù)為1106/L，流式細胞儀檢測細胞周期.1.2.5細胞誘導(dǎo)分化及染色取第3代胎盤細胞，以2.5g/L胰蛋白酶消化3in,10l/LFBS終止消化，800r/in離心5in，PBS沖洗3遍，分為4組分別以1105/L細胞數(shù)接種于6孔板中，1組參加成骨誘導(dǎo)劑20l/L甘油磷酸鈉、50g/L維生素，10l/L地塞米松，100L/L新生牛血清DE培養(yǎng)基，2組參加脂肪誘導(dǎo)劑10l/L地塞米松、10g/L胰島素、1

9、00L/L新生牛血清DE培養(yǎng)基，3,4組為對照組，采用100L/L新生牛血清DE培養(yǎng)基培養(yǎng)，置37，50L/L2孵箱培養(yǎng)，每35日換液1次.取培養(yǎng)10d后的1，3組細胞，倒掉培養(yǎng)液，多聚甲醛固定30in，PBS沖洗3遍，茜素紅染色8h，顯微鏡下觀察陽性結(jié)果.取培養(yǎng)7d后的2，4組細胞，多聚甲醛固定后油紅染色.2結(jié)果2.1胎盤細胞的原代培養(yǎng)消化胎盤組織獲得少量的單個核細胞，約714d后貼壁，從不規(guī)那么形，逐漸變?yōu)樗笮?，呈漩渦狀生長，約4k后長滿瓶底，胞體呈細長，形態(tài)類似成纖維細胞圖2，1k左右傳代1次，可穩(wěn)定傳至10代.流式細胞儀檢測顯示低表達D29，高表達D44和D105，不表達D34，D45

10、和D19.細胞的對數(shù)生長期約在第24日，其倍增時間為39h圖1.流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)G0/G1，S，G2/期的比例分別為20.15%,72.54%和6.89%.圖1胎盤貼壁細胞生長曲線略2.2胎盤細胞的誘導(dǎo)分化成骨誘導(dǎo)組細胞在誘導(dǎo)10d時可見細胞呈漩渦狀重疊生長，并聚集成團，茜素紅染色可見多個散在分布大孝形態(tài)各異的不透明棕紅色鈣化結(jié)節(jié).對照組少見鈣化結(jié)節(jié)圖3.成脂肪誘導(dǎo)組細胞在誘導(dǎo)7d時油紅染色可見細胞中出現(xiàn)多個染色深紅的脂肪滴，而對照組中那么偶見脂肪滴圖4.A：培養(yǎng)10d；B：培養(yǎng)28d.圖2胎盤原代細胞100略A：誘導(dǎo)組;B：對照組.圖3成骨細胞茜素紅染色100略A：誘導(dǎo)組；B：對照組.圖4

11、成脂細胞油紅染色100略3討論早在2000年即有學(xué)者從凍存的胎盤組織中別離培養(yǎng)出貼壁細胞1，但胎盤間充質(zhì)干細胞S的研究尚處于起步階段.我們從形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)及分化才能等方面加以研究進一步證實胎盤貼壁細胞的生物學(xué)特性.一般認(rèn)為大多數(shù)S培養(yǎng)時貼壁，呈成纖維細胞狀，因此采用貼壁法獲得S的研究較多2.胎盤是實體組織，富含血管和間充質(zhì)成分，我們采用酶消化法，獲取細胞沉淀進展培養(yǎng)，與骨髓貼壁細胞相比擬，其貼壁時間較長12k，骨髓為72h3，并且胎盤貼壁細胞需28d左右才能鋪滿瓶底.骨髓貼壁細胞大多最初為梭形，7d左右形成小集落，其后迅速生長，變?yōu)榫坏拈L梭形3，與胎盤貼壁細胞相似.另外我們的實驗檢測到的胎盤

12、貼壁細胞的倍增時間為39h，文獻中為37h4；我們檢測細胞周期顯示細胞大局部處于分裂期，而以往的報道發(fā)現(xiàn)細胞大局部處于靜息期4，因此胎盤貼壁細胞的特性尚需進一步研究.目前對于胎盤貼壁細胞的免疫學(xué)特點尚無統(tǒng)一的認(rèn)識，我們的研究發(fā)現(xiàn)胎盤貼壁細胞的表型與骨髓S相似5-6，表達D29,D44和D105，不表達D34,D45,D19,D44,D29均為黏附分子，是纖連蛋白和透明質(zhì)酸鹽的受體，在基質(zhì)細胞中表達較多，這樣的結(jié)果使我們推測培養(yǎng)的胎盤貼壁細胞中可能包含大量的能表達基質(zhì)細胞標(biāo)志的細胞，即S，但僅憑細胞形態(tài)和少量的外表標(biāo)志尚不能完全說明貼壁細胞即為S，S的最重要特性應(yīng)該是多向分化潛能.假如胎盤貼壁細

13、胞中含有S，理論上講S來源于中胚層，具有向中胚層組織及神經(jīng)外胚層組織分化的才能7-8.我們的實驗證明甘油磷酸鈉和低濃度的地塞米松結(jié)合誘導(dǎo)后細胞中鈣鹽沉積，茜素紅染色顯示產(chǎn)生大量鈣化結(jié)節(jié)，說明其有成骨才能，只有干細胞才具有這種才能.在誘導(dǎo)體系中維生素可以促進體外培養(yǎng)細胞合成膠原，形成鈣化，能調(diào)節(jié)ATP及ALP活性，并影響其合成，甘油磷酸鈉可以提供磷離子作為ALP的底物，地塞米松可以增強ALP活性.而ALP可以破壞鈣化抑制劑，啟動鈣化8形成鈣鹽，茜素紅特異性結(jié)合鈣劑，陽性表現(xiàn)為棕紅色，鈣的含量愈高染色愈深，是鑒定成骨細胞特性的特異性指標(biāo).我們的實驗由于條件限制，只是初步觀察胎盤貼壁細胞的特點，證明

14、其具有干細胞特性，但尚有許多問題如培養(yǎng)的條件、促進生長的因子、傳代后是否逐漸衰老、誘導(dǎo)后移植的效果等等，需更深化的研究.我們的研究提示胎盤貼壁細胞的別離培養(yǎng)具有潛在的臨床應(yīng)用價值.【參考文獻】1JarsakJ,SithT,HaynesrthS,etal.preliinaryharaterizatinfthesurfaestainingfplaentalderivedadherentells:Aptentialnesurefstrafrubililrdbld(UB)expansin.ASHeatl,2000:1-5.2薜群，苗宗寧，曲靜，等.胎盤間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)細胞誘導(dǎo)的實驗研究J.江蘇醫(yī)藥雜

15、志,2022,3011:817-819.3康非吾,吳正華.人骨髓間充質(zhì)干細胞的別離培養(yǎng)及向成骨細胞定向分化的實驗研究J.口腔頜面外科雜志,2022,12(4):307-310.4何津,張毅,江小霞,等.人胎盤貼壁細胞的別離培養(yǎng)及造血相關(guān)因子表達J.中華血液學(xué)雜志，2022,2412:652-654.5GuX,angY,angYH,etal.Experientalstudyftheislatin,ultureandinhndrgenidifferentiatinfhuanbneesenhyalsteellJ.hinJStatl,2022,38:63-66.6張文元，楊亞冬，賀晨,等.骨髓間充質(zhì)干細胞別離培養(yǎng)及向成骨細胞表型的誘導(dǎo)分化J.浙江實用醫(yī)學(xué),2022,9(6):393-395.7DrudiS,kinr