1、PAGE PAGE 32Evaluation Warning: The document was created with Spire.Doc for .NET.實驗十 病毒的形態(tài)學診斷、培養(yǎng)方法和血清學試驗目 的（一）觀察察病毒包包涵體，并并掌握其其診斷意意義。（二）掌握握病毒的的形態(tài)并并了解病病毒包膜膜的獲得得。（三）了解解病毒培培養(yǎng)的三三種方法法。（四）掌握握病毒學學中主要要血清學學反應的的原理（五）熟悉悉病毒血血凝抑制制試驗的的測定過過程內(nèi) 容（一）病毒毒的形態(tài)態(tài)學診斷斷1. 病毒毒的電鏡鏡照片（示示教）2. 狂犬犬病毒包包涵體（示示教）3. 麻疹疹病毒包包涵體（示示教）（二）病毒毒的

2、培養(yǎng)養(yǎng)法（錄錄像） 1. 病毒毒的動物物接種法法 2. 病毒毒雞胚培培養(yǎng)法 3. 病毒毒的組織織培養(yǎng)法法 （三）血凝抑制試驗（操作）病毒的形態(tài)態(tài)學診斷斷病毒形態(tài)態(tài)學研究究方法可可分為兩兩種：一一種是應應用電子子顯微鏡鏡技術，觀觀察其大大小，形形態(tài)及排排列特征征，以幫幫助診斷斷；另一一種是應應用光學學顯微鏡鏡通過涂涂片染色色或切片片染色，觀觀察包涵涵體。病病毒感染染細胞所所產(chǎn)生的的包涵體體，其特特征基本本是固定定的，故故對病毒毒性疾病病的診斷斷具有一一定價值值。【方法】（一）病毒毒的電鏡鏡照片（示示教）觀察腺病病毒、皰皰疹病毒毒的電鏡鏡照片，注注意其形形態(tài)結(jié)構(gòu)構(gòu)、大小小、排列列、及其其包膜的的形

3、成。（二）狂狂犬病病病毒內(nèi)基基（Neegrii）包涵涵體（示示教）用高倍鏡鏡或油鏡鏡觀察經(jīng)經(jīng)HE（蘇蘇木紫-伊紅染染色）染染色的死死于狂犬犬病的犬犬腦組織織切片，注注意包涵涵體在細細胞內(nèi)的的形態(tài)、位位置及染染色性。（三）麻麻疹病毒毒包涵體體（示教教）用高倍鏡鏡或油鏡鏡觀察經(jīng)經(jīng)麻疹病病毒培養(yǎng)養(yǎng)后，HHE染色色的人胚胚或羊膜膜細胞標標本片，注注意包涵涵體在細細胞內(nèi)的的位置、形形態(tài)、染染色性以以及細胞胞融合情情況。病毒動物接接種法實驗動物物在病毒毒學研究究中有四四方面用用途：分離鑒鑒定病毒毒，如乙乙腦病毒毒；連續(xù)傳傳代通過過，以減減弱有毒毒株對人人的致病病力，如如狂犬病病病毒；制備抗抗血清；病毒致致

4、病機理理的研究究。常用的實實驗動物物有小白白鼠、地地鼠、豚豚鼠、家家兔、綿綿羊、雞雞、猴等等。在病病毒學研研究中，動動物接種種時為避避免動物物本身可可能帶有有病毒，多多采用實實驗室自自己繁殖殖的動物物。首先先根據(jù)研研究目的的選擇動動物種類類，對病病毒致病病機制的的研究，則則選擇愈愈接近人人類的高高等動物物（例如如靈長類類）研究究結(jié)果愈愈有價值值；其次次要注意意動物的的年齡、性性別和接接種的途途徑等各各種因素素，一般般年幼的的動物比比成年動動物對病病毒的敏敏感性高高。至于于接種的的途徑應應根據(jù)病病毒的嗜嗜性決定定，例如如腦炎病病毒以腦腦內(nèi)注射射最敏感感。（一）小小白鼠尾尾靜脈接接種（錄錄像）【材

5、料】1. 動動物：小小白鼠2. 病病毒懸液液3. 碘碘酒、酒酒精、二二甲苯、無無菌0.25mml注射射器、44號針頭頭及小鋁鋁匣【方法】1. 將將小白鼠鼠固定在在小鋁匣匣內(nèi)，露露出尾部部，用碘碘酒消毒毒尾部，然然后用酒酒精棉球球連續(xù)擦擦尾部皮皮膚（必必要時用用二甲苯苯擦）使使血管擴擴張。2. 尾尾背和左左右兩側(cè)側(cè)三根血血管皆為為靜脈，可可選一根根擴張較較好的靜靜脈作接接種用。左左手拇指指捏住尾尾部的遠遠端，向向下彎445，右手手持注射射器，于于彎處進進針靜脈脈，推液液0.11毫升。注意：推推注時遇遇阻力且且皮下隆隆起發(fā)白白時，表表示針頭頭不在血血管內(nèi)應應拔出重重新進針針；如針針頭在血血管內(nèi)，推

6、推注時不不感阻力力，且可可看到血血管中血血液由于于注入液液體而后后退。接種后逐逐日觀察察動物發(fā)發(fā)病情況況。（二）小白白鼠鼻內(nèi)內(nèi)接種（錄錄像）【材料】小白鼠、流流感病毒毒鼠肺適適應株病病毒懸液液、無菌菌小試管管、無菌菌毛細管管、麻醉醉用乙醚醚、棉球球及小玻玻瓶?！痉椒ā?. 首首先將沾沾有乙醚醚的棉球球放入一一清潔小小玻瓶內(nèi)內(nèi)。左手手握小瓶瓶，右手手抓住小小白鼠，將將其頭部部塞入瓶瓶口，進進行全身身麻醉。注注意麻醉醉深度，不不宜太淺淺或太深深，太深深時易遭遭致麻醉醉死亡或或非特異異性吸入入性肺炎炎，太淺淺則易在在滴種時時打噴嚏嚏。2. 用用無菌毛毛細吸管管吸取病病毒懸液液少許，連連同毛細細吸管插

7、插在無菌菌試管中中備用。3. 用用左手將將小白鼠鼠握在手手掌中，大大拇指及及食指抓抓住小白白鼠耳部部使其頭頭部朝前前并呈仰仰臥位置置，另一一手取事事先吸有有病毒懸懸液的吸吸管，慢慢慢滴出出一點于于滴管口口而不使使其自然然掉落，呈呈懸滴狀狀。將懸懸滴靠近近動物鼻鼻尖，動動物在呼呼吸時自自然吸入入，一般般為0.030.005毫升升，不宜宜過多。4. 小小白鼠慢慢慢蘇醒醒，在飼飼養(yǎng)盒中中逐日開開始發(fā)病病，發(fā)病病的癥狀狀常為毛毛聳、咳咳嗽、不不食、甚甚至死亡亡。解剖剖尸體可可觀察到到肺炎或或血性病病灶。（三）小小白鼠腦腦內(nèi)接種種（錄像像）【材料】腦炎病毒（小小白鼠腦腦脊髓炎炎病毒）懸懸液。腦腦組織先先

8、用無菌菌生理鹽鹽水洗去去血液，再再加100脫脂脂奶鹽水水研磨成成101懸液液，然后后用30000轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/分離離心沉淀淀30分分鐘，吸吸取上清清液供接接種用。小白鼠：33周齡，體體重68克。無菌0.225毫升升注射器器及針頭頭（4號號）、煮煮針鍋、碘碘酊、棉棉簽?！痉椒ā?. 以以無菌00.255毫升注注射器抽抽取腦炎炎病毒懸懸液0.1毫升升，去除除注射器器內(nèi)的氣氣泡。2. 取取出小白白鼠，左左手將小小白鼠固固定，固固定時用用大拇指指和食指指捏住小小白鼠的的頭部，左左手手掌掌輕輕按按住小白白鼠的體體部。3. 右右手以棉棉簽蘸以以碘酒，消消毒小白白鼠顳部部皮毛（不不碰到眼眼）。4. 右右手拿注注射器

9、在在小白鼠鼠顳部（眼眼與耳根根連線的的中點略略偏耳朵朵的方向向）刺入入，進入入顱腔，進進針23毫米米，不要要插得太太深，注注射量為為0.00200.033毫升。5. 注注射完畢畢，將用用過得注注射器放放入煮針針鍋內(nèi)煮煮沸消毒毒。動物物一般在在344天后開開始發(fā)病病，食欲欲減退，活活動遲鈍鈍，毛聳聳，震顫顫，慢慢慢發(fā)展為為麻痹，癱癱瘓而死死亡。本法適用用于一些些腦炎病病毒的分分離培養(yǎng)養(yǎng)。病毒雞胚培培養(yǎng)法雞胚培養(yǎng)養(yǎng)法常用用于痘類類病毒、粘粘病毒和和皰疹病病毒的分分離、鑒鑒定、制制備抗原原、生產(chǎn)產(chǎn)疫苗以以及研究究病毒性性質(zhì)等。雞胚和實實驗動物物一樣，為為一整體體動物，有有神經(jīng)血血管的分分布及臟臟器的

10、構(gòu)構(gòu)造；雞雞胚的組組織分化化程度低低，病毒毒易于繁繁殖，感感染了病病毒的膜膜結(jié)構(gòu)和和液體中中，含有有大量病病毒；雞雞胚來源源充足，操操作簡單單、通常常本身是是無菌的的，對接接種的病病毒不產(chǎn)產(chǎn)生抗體體為其優(yōu)優(yōu)點，但但除產(chǎn)生生痘皰的的病毒及及引起雞雞胚死亡亡的病毒毒外，通通常不產(chǎn)產(chǎn)生特異異性的感感染指征征，必須須利用第第二個試試驗系統(tǒng)統(tǒng)來測定定病毒的的增殖。常用的雞雞胚接種種方法有有四種，即即絨毛尿尿囊膜上上接種法法、羊膜膜腔接種種法、尿尿囊接種種法及卵卵黃囊接接種法。根根據(jù)不同同病毒和和不同目目的采用用合適的的接種方方法。（一）尿囊囊腔接種種法（錄錄像）【材料】副流感病病毒1003稀釋釋液，11

11、0112日齡齡雞胚、無無菌1毫毫升注射射器及77號針頭頭、電動動磨蛋器器、檢蛋蛋燈、彎彎頭小鑷鑷子、蛋蛋架、碘碘酒棉球球、膠布布、大頭頭針、無無菌試管管、無菌菌毛細吸吸管?！痉椒ā?. 選選用100122日齡雞雞胚，在在照蛋燈燈上照視視觀察雞雞胚是否否存活，根根據(jù)如下下：小血管管是否清清晰；胚胎是是否活動動，觀察察小雞的的眼睛黑黑點是否否移動；蛋白一一邊和胎胎盤一邊邊是否界界限分明明，蛋白白一邊較較亮，胎胎盤一邊邊暗紅色色，如果果胎盤一一邊發(fā)黑黑或蒼白白都表示示胚蛋已已死亡。用鉛筆標標明天然然氣室，雞雞胚及大大血管位位置，然然后在絨絨毛尿囊囊膜發(fā)育育區(qū)避開開大血管管的地方方作一記記號，定定為注

12、射射入口。絨絨毛尿囊囊膜區(qū)血血管豐富富，在照照視時呈呈現(xiàn)紅色色，幾乎乎占據(jù)雞雞蛋的二二分之一一。2. 用用碘酒消消毒注射射入口和和天然氣氣室端的的蛋殼，再再用電動動磨蛋器器于注射射入口和和天然氣氣室端的的蛋殼上上磨一小小孔，勿勿傷及卵卵膜。3用大大頭針通通過火焰焰消毒后后刺穿氣氣室端所所開小孔孔的卵膜膜，這樣樣可避免免在注射射時液體體回流出出來。4將雞雞胚橫臥臥于蛋架架上，用用無菌11毫升注注射器抽抽取病毒毒液體，針針頭于卵卵殼成330交角，由由注射小小孔刺入入0.551.0厘米米，注射射0.110.2毫升升（圖110-11）。5注射射完結(jié)用用膠布封封口。封封口前膠膠布用碘碘酒消毒毒，并通通過

13、火焰焰燒去余余碘。用用過的注注射器用用煮沸法法消毒，雞雞胚放入入3537培養(yǎng)。6注射射后次日日，逐日日觀察雞雞胚生活活情況，孵孵育488722小時后后移入44冰箱。注注意雞胚胚必須直直立，令令氣室端端朝上。7收獲獲尿囊液液之前取取出雞胚胚，用碘碘酒消毒毒氣室端端，并用用鑷子擊擊破氣室室端卵殼殼，沿氣氣室邊緣緣小心打打開一大大缺口，然然后用小小鑷子撕撕去卵膜膜及撕破破絨毛尿尿囊膜，最最后用毛毛細管吸吸取尿囊囊液，一一般可吸吸得45毫升升。8滴定定尿囊液液的病毒毒血凝效效價。尿囊接種法法適用于于某些呼呼吸道病病毒，如如流感病病毒、副副流感病病毒、新新城雞瘟瘟病毒等等的培養(yǎng)養(yǎng)，惟分分離培養(yǎng)養(yǎng)不如羊羊

14、膜腔接接種法陽陽性率高高。羊水卵白羊水卵白氣室氣室卵黃囊尿囊液卵黃囊尿囊液圖 10-1 雞胚尿囊腔接種法圖 10-1 雞胚尿囊腔接種法（二）絨毛毛尿囊膜膜上接種種法（錄錄像）【材料】牛痘苗病毒毒103稀釋釋液、110113日齡齡雞胚、橡橡皮乳頭頭、眼科科鑷子或或小剪刀刀、無菌菌培養(yǎng)皿皿、無菌菌生理鹽鹽水，其其余同尿尿囊腔接接種法?！痉椒ā?選用110113日齡齡雞胚，在在照蛋燈燈上照視視觀察是是否活胚胚蛋，用用鉛筆劃劃下絨毛毛尿囊膜膜發(fā)育的的界限。2將胚蛋蛋橫臥于于蛋座上上，使其其絨毛尿尿囊膜部部位朝上上，用碘碘酒消毒毒絨毛尿尿囊膜部部位和天天然氣室室端的中中心部，待待干后即即用磨蛋蛋器輕輕輕

15、在絨毛毛尿囊膜膜中心部部磨一三三角形窗窗口（每每邊一厘厘米許），磨磨破卵殼殼而不使使卵膜破破裂，同同時用磨磨蛋器于于氣室端端開一小小孔。注注意：已已磨好之之雞胚必必須于112小小時內(nèi)接接種，否否則絨毛毛尿囊膜膜易與卵卵殼粘著著。3用分離離針或大大頭針通通過火焰焰消毒，穿穿通天然然氣室端端所鋸小小孔；并并用分離離針或大大頭針輕輕輕劃破破卵殼，露露出三角角形卵膜膜，最好好將分離離針或大大頭針330角度自自上往下下壓迫卵卵膜一個個小口，這這樣不致致?lián)p傷絨絨毛尿囊囊膜。4立即用用橡皮乳乳頭在天天然氣室室一端小小孔吸氣氣233次，目目的將天天然氣室室的空氣氣吸去，而而上面所所開的洞洞口進入入空氣，形形成

16、一個個人工氣氣室，可可在照蛋蛋燈上照照視一下下，看天天然氣室室是否消消失，如如未消失失則尚需需再吸氣氣數(shù)次（圖圖10-2）。5用小鑷鑷子通過過火焰滅滅菌，稍稍待冷卻卻后將三三角形窗窗口的卵卵膜撕去去、暫時時蓋以無無菌培養(yǎng)養(yǎng)皿防止止污染，然然后用消消毒注射射器吸取取牛痘苗苗懸液（11033稀釋液液，內(nèi)加加適量的的鏈霉素素及青霉霉素），揭揭去培養(yǎng)養(yǎng)皿，于于窗口滴滴入0.100.2毫毫升病毒毒液，注注畢后窗窗口用膠膠布封口口，封口口前膠布布用碘酒酒消毒，并并通過火火焰，燒燒去余碘碘。用過過的注射射器煮沸沸消毒。6孵育于于37溫箱，每每日觀察察生活情情況，接接種1003稀釋釋的牛痘痘苗后的的雞胚一一般

17、不死死亡，但但也可能能在3天天之后發(fā)發(fā)生死亡亡，如發(fā)發(fā)現(xiàn)死亡亡則立即即放入普普通冰箱箱，如不不死亡則則培養(yǎng)445日日后放入入普通冰冰箱，等等待觀察察檢查。7將感染染病毒的的雞胚自自冰箱中中取出，用用碘酒消消毒人工工氣室面面，然后后用鑷子子撕去膠膠布并將將卵殼的的三角形形窗口擴擴大，以以便剪取取絨毛膜膜，此時時在明亮亮處可清清楚地看看到牛痘痘斑，呈呈白色點點狀，有有時融合合成一堆堆或一片片。8左手用用小鑷子子鑷起絨絨毛尿囊囊膜，右右手用小小剪順卵卵殼四周周剪下絨絨毛尿囊囊膜放入入無菌培培養(yǎng)皿內(nèi)內(nèi)，并用用無菌生生理鹽水水洗滌112次次，再將將膜張開開，膜上上牛痘斑斑就看得得更為清清楚。絨毛尿囊膜膜

18、上接種種法，除除適用于于天花，牛牛痘等病病毒外，尚尚適用于于單純皰皰疹病毒毒和其它它一些病病毒，但但其它一一些病毒毒不如天天花、牛牛痘、單單皰疹病病毒那樣樣具有明明顯的病病斑。絨毛尿囊膜絨毛尿囊膜羊水羊水卵白卵白卵黃囊卵黃囊尿囊液尿囊液圖10-2 雞胚絨毛尿囊膜上接種圖10-2 雞胚絨毛尿囊膜上接種（三）羊膜膜腔接種種法（錄錄像）【材料】副流感病毒毒103稀釋釋液、99100日齡雞雞胚、滅滅菌液體體石蠟、其其余同尿尿囊腔接接種法。【方法】1所用雞雞胚在使使用前一一天，將將雞胚直直立卵盤盤培養(yǎng)，使使其胚胎胎向上，便便于操作作。 22接種種前檢查查雞胚生生活情況況，并用用鉛筆畫畫出天然然氣室和和胚

19、胎的的位置，然然后用磨磨蛋器沿沿天然氣氣室的邊邊緣和胚胚胎位置置近處，鋸鋸一方形形小窗（每每邊約11厘米許許，如圖圖10-3）。3用小小鑷子挑挑去方形形卵殼和和撕去卵卵膜，再再用無菌菌吸管，吸吸取石蠟蠟油少許許，滴入入2滴，石石蠟油在在氣室面面的卵膜膜上很快快散開，使使膜透明明，這樣樣在雞蛋蛋照明燈燈或檢蛋蛋燈上，可可清楚地地觀察到到整個雞雞胚。4用無無菌1毫毫升注射射器抽取取少許流流感病毒毒液體，將將雞蛋直直立于照照明燈或或檢蛋燈燈上，針針頭自窗窗口對著著雞胚直直下，穿穿過絨毛毛尿囊膜膜，羊膜膜腔、推推動注射射器，注注入0.100.2毫毫升，針針頭刺入入時注意意勿傷及及雞胚本本身，最最好從小

20、小雞的頸頸部空隙隙中插入入。5注射射完畢后后，用膠膠布封口口（膠布布先經(jīng)碘碘酒消毒毒和通過過火焰燒燒去余碘碘處理）。用用過的注注射器煮煮沸消毒毒處理。雞雞胚放入入3537培養(yǎng)448772小時時。6自注注射后次次日起逐逐日檢查查雞胚的的生活情情況，22日以內(nèi)內(nèi)死亡者者多為非非特異性性損傷而而致死；2日后后死亡者者視為特特異性死死亡，流流感或副副流感病病毒1003稀釋釋注射時時，一般般不引起起死亡。收收獲病毒毒之前將將雞胚移移入普通通冰箱118224小時時，將雞雞胚凍死死，以減減少收獲獲時的出出血。7冰箱箱取出雞雞胚，碘碘酒消毒毒雞蛋氣氣室端，撕撕去膠布布并將蛋蛋殼窗口口擴大，用用小鑷子子撕破卵卵

21、膜及絨絨毛尿囊囊膜，然然后用毛毛細管吸吸出尿囊囊液棄去去，尿囊囊液吸完完后，左左手持鑷鑷子鑷住住羊膜腔腔，右手手以毛細細吸管插插入羊膜膜腔吸取取羊水，一一般羊水水可吸出出一毫升升左右。8滴定定羊水的的病毒血血凝效價價。羊膜腔接接種方法法適用于于一些呼呼吸道病病毒，如如流感病病毒、副副流感病病毒及流流行性腮腮腺炎病病毒等的的分離。 卵黃囊卵黃囊氣室卵白氣室卵白羊水羊水尿囊液尿囊液圖 10-3圖 10-3羊膜腔接種法四、病毒細細胞培養(yǎng)養(yǎng)法及病病變觀察察（錄像像）細胞培養(yǎng)法法是目前前培養(yǎng)病病毒應用用最廣的的一種培培養(yǎng)方法法，其優(yōu)優(yōu)點是（11）經(jīng)濟濟適用，結(jié)結(jié)果正確確且敏感感；（22）較實實驗動物物易

22、于控控制。細細胞培養(yǎng)養(yǎng)法多應應用于病病毒的分分離培養(yǎng)養(yǎng)，進行行血清中中和試驗驗及制造造疫苗和和抗原等等方面。很多組織細細胞，包包括雞胚胚、鼠胚胚、各種種動物的的腎組織織細胞，人人胚羊膜膜組織細細胞或流流產(chǎn)胎兒兒組織細細胞（應應在死后后6小時時內(nèi)采取取，因時時間過長長，組織織細胞生生長成功功率下降降）等均均可作細細胞培養(yǎng)養(yǎng)的來源源。細胞的選擇擇主要依依據(jù)組織織細胞對對病毒的的敏感性性。能引引起病變變的組織織細胞，往往往取自自病毒的的自然宿宿主，特特別是引引起疾病病的宿主主的某些些臟器組組織細胞胞。人類類病毒，用用人或猴猴的組織織細胞較較敏感，但但這不是是絕對的的，如地地鼠腎細細胞較人人腎細胞胞對

23、流行行性乙型型腦炎病病毒敏感感。原代細胞培培養(yǎng)法【材料】910日日齡雞胚胚、Haankss氏溶液液、0.25胰酶溶溶液、無無菌小剪剪、鑷子子、無菌菌培養(yǎng)皿皿、毛細細吸管、吸吸管、沉沉淀管、無無菌細胞胞培養(yǎng)管管（抗生生素空瓶瓶）、1100毫毫升無菌菌玻璃瓶瓶或三角角燒瓶、備備有四層層紗布的的玻璃漏漏斗?！痉椒ā?用碘酒酒消毒雞雞胚蛋氣氣室外殼殼，并將將它直立立于蛋架架上，以以鑷子將將雞胚取取出放入入無菌培培養(yǎng)皿內(nèi)內(nèi)，去頭頭爪及內(nèi)內(nèi)臟。2用小剪剪在培養(yǎng)養(yǎng)皿內(nèi)將將胚胎剪剪成小塊塊（45毫米米3），加加Hannks氏氏溶液（約約10毫毫升）沖沖洗，靜靜置12分鐘鐘后，用用毛細吸吸管吸取取液體。依依同法

24、再再洗滌22次，將將血球充充分洗去去。3用鑷子子將組織織塊放入入無菌玻玻璃瓶或或三角燒燒瓶內(nèi)，加加入100155毫升00.255胰酶酶溶液，37水浴20分鐘，中間搖動幾次。由于胰酶的作用可使大量細胞游離，液體變混。經(jīng)四層紗布過濾后的細胞懸液，低速離心沉淀（1000轉(zhuǎn)/分以內(nèi)）5分鐘，吸取上清液，沉淀物加入適量營養(yǎng)液，用白細胞計數(shù)的方法進行計數(shù)，使成每毫升含5080萬細胞懸液以作單層細胞培養(yǎng)。4每一細細胞培養(yǎng)養(yǎng)管，注注入細胞胞懸液11毫升，蓋蓋好瓶塞塞，并將將瓶略加加搖動，橫橫臥于有有槽木架架上，使使細胞均均勻平鋪鋪于管壁壁。置337溫箱孵孵育，一一般4小小時，細細胞附著著于管壁壁，488小時可

25、可長成單單層，此此時即可可調(diào)換營營養(yǎng)液，接接種病毒毒。傳代細胞培培養(yǎng)法從人及動物物組織，特特別是腫腫瘤組織織，經(jīng)過過多次傳傳代可建建立傳代代細胞系系。這種種細胞能能無限地地傳代，但但并不是是所有的的組織細細胞都能能建立傳傳代細胞胞。有一一些傳代代細胞對對病毒敏敏感范圍圍較廣，曾曾被利用用作病毒毒的分離離和鑒定定。如HHeLaa細胞，HHep2細胞胞及KBB細胞。HHeLaa細胞對對脊髓灰灰質(zhì)炎三三型病毒毒，腺病病毒及大大多數(shù)實實驗室適適應的EECHOO病毒都都敏感。HHep2細胞胞也曾用用來分離離脊髓灰灰質(zhì)炎病病毒、柯柯薩奇AA組病毒毒、腺病病毒、RRS病毒毒。HeLa細細胞來自自子宮頸頸癌，

26、HHep2細胞胞來自喉喉癌，而而KB細細胞來自自上腭癌癌。由于于傳代細細胞有致致腫瘤作作用，目目前僅用用做病毒毒的分離離鑒定及及一些病病毒學的的研究而而不能用用于疫苗苗的生產(chǎn)產(chǎn)?！静牧稀繂螌蛹毎嗯囵B(yǎng)瓶，營營養(yǎng)液，00.255胰蛋蛋白酶溶溶液，無無菌吸管管，無菌菌細胞瓶瓶?！痉椒ā?將成片片細胞的的生長液液倒掉，用用Hannks液液洗一次次。2加入適適量的00.255胰蛋蛋白酶，37孵育1分鐘。3將細胞胞瓶倒放放，細胞胞在上，胰胰酶在下下，繼續(xù)續(xù)孵育3375110分鐘鐘。4將胰蛋蛋白酶倒倒掉，再再加入原原量的生生長液，用用10毫毫升吸管管吹打分分散細胞胞。5用生長長液按原原量34倍稀稀釋，即即

27、一瓶細細胞能傳傳344瓶。細胞培養(yǎng)接接種病毒毒的方法法及病變變觀察（示示教）【材料】單層細胞培培養(yǎng)管、營營養(yǎng)液、HHankks溶液液、無菌菌毛細滴滴管和腺腺病毒稀稀釋液?！痉椒ā?取已長長成單層層細胞的的培養(yǎng)瓶瓶二只，用用無菌毛毛細滴管管吸去管管中液體體，用HHankks溶液液洗二次次。2用無菌菌的1毫毫升吸管管吸稀釋釋的腺病病毒液00.1毫毫升加入入一只單單層細胞胞培養(yǎng)瓶瓶中，另另一只加加0.11毫升營營養(yǎng)液不不接種病病毒作為為對照，細細胞瓶放放平，使使其接觸觸整個細細胞層，置置37作用11小時，使使病毒吸吸附到細細胞上。3取出單單層細胞胞瓶，每每只中加加入營養(yǎng)養(yǎng)液0.9毫升升，蓋緊緊后置3

28、37孵箱中中培養(yǎng)112天天。4取出細細胞在低低倍顯微微鏡下觀觀察，注注意種毒毒與對照照二管的的細胞形形態(tài)，排排列等。注：為方便便保存，此此處觀察察的細胞胞已經(jīng)過過固定和和染色。五、血凝抑抑制試驗驗血凝抑制制試驗系系利用血血凝素特特異性抗抗體與病病毒表面面相應血血凝素相相互作用用，使病病毒血凝凝現(xiàn)象抑抑制的試試驗。血凝抑制制試驗適適用于具具有血凝凝素的病病毒，試試驗必須須預先滴滴定病毒毒的血凝凝效價，然然后采用用一定量量的病毒毒，通常常是加入入4個血血凝單位位的病毒毒，在與與血凝滴滴定試驗驗相同的的反應條條件下來來進行測測定。（一）血血凝效價價的滴定定【材料】收獲的尿尿囊液（病病毒懸液液）、33

29、2孔有有機玻璃璃板。00.2 mll移液器器、移液液頭、小小試管一一支、00.5雞紅細細胞懸液液、生理理鹽水【方法】按下表進進行，其其操作程程序為：1將有有機玻璃璃板孔從從1110號進進行編號號，從第第一孔起起直至第第10孔孔，每孔孔加生理理鹽水00.2ml。2將尿尿囊液在在試管中中作15稀釋釋，即吸吸取0.8mll生理鹽鹽水，加加入0.2mll尿囊液液。然后后吸取115稀釋釋的尿囊囊液0.2 mml加入入到第11孔，混混勻后（吹吹吸3次次），從從中吸出出0.22 mll移入第第2孔，如如此對倍倍稀釋直直至第99孔，于于第9孔孔中吸出出0.22 mll，棄入入消毒缸缸內(nèi)。第第10孔孔不加尿尿囊

30、液作作為對照照。3自第第10孔孔起，反反方向每每孔補充充生理鹽鹽水0.2 mml。自第10孔孔起，反反方向每每孔加入入0.55 雞雞紅血球球0.44 mll，搖勻勻后放室室溫靜止止45分鐘，觀觀察結(jié)果果，并確確定血（球球）凝（集集）效價價。號鹽m液l*稀 000000086液l 水0 紅 m.*為155稀釋尿尿囊液結(jié)果觀察察：凡出出現(xiàn)凝集集者，紅紅細胞平平鋪孔底底，呈倒倒張的傘傘狀，邊邊緣有卷卷起的趨趨向。凝凝集特別別顯著者者為，次次之為，凝凝集清楚楚可見者者為，稍呈呈凝集者者為；陰性者者血球沉沉于孔底底中心，呈呈鈕扣狀狀。血凝效價價：指呈呈現(xiàn)凝集時時病毒的的最高稀稀釋度。此此時的稀稀釋度即即

31、為1個個血凝單單位。若若1個血血凝單位位為16400，則44個血凝凝單位為為11600。（二）血血凝抑制制試驗【材料】4個血凝凝單位的的病毒液液，15稀釋釋的抗血血清，332孔有有機玻璃璃板，00.2 ml移移液器，移移液頭，00.5雞紅細細胞懸液液，生理理鹽水【方法】按下表進進行，其其操作程程序為：1將有有機玻璃璃板孔從從1110號進進行編號號，從第第一孔起起直至第第9孔，每每孔加生生理鹽水水0.2ml，第第10孔孔加0.4mll。2于第第1孔和和第8孔孔中各加加入15稀釋釋血清00.2mml。將將第1孔孔混勻后后從中吸吸出0.2mll移入第第2孔，如如此作對對倍稀釋釋直至第第7孔，于于第7

32、孔孔中吸出出0.22ml棄棄入消毒毒缸內(nèi)。第第8孔為為血清對對照。3于第第1至第第7孔中中各加入入0.22ml 4個血血凝單位位的病毒毒液，第第9孔亦亦加入00.2mml病毒毒液作病病毒對照照。4稍加加振搖后后，每孔孔加入00.5雞紅細細胞0.4mll，室溫溫靜置445分鐘鐘，觀察察結(jié)果。胞鹽m清m* 2*稀 20血 位 m. 紅 懸m.*為155稀釋的的抗血清清結(jié)果： 胞 孔血血球沉于于孔底中中心，呈呈鈕扣狀狀，表明明紅細胞胞無自凝凝現(xiàn)象；病毒對對照孔，呈呈現(xiàn)凝凝集，表表明病毒毒血凝功功能正常常；血清清對照孔孔，血球球沉于孔孔底中心心，呈鈕鈕扣狀，表表明血清清中無凝凝集因子子；測定定孔中，如

33、如血球沉沉于孔底底中心，呈呈鈕扣狀狀，表明明血清中中有相應應的血凝凝抑制抗抗體，為為陽性孔孔；反之之凝集者者為陰性性孔。血凝抑制效效價：呈呈完全血血凝抑制制時的最最高血清清稀釋度度。附錄：附錄：1雞胚的的準備和和發(fā)育過過程病毒的雞雞胚培養(yǎng)養(yǎng)，多采采用來亨亨雞卵，其其優(yōu)點為為卵殼色色白而薄薄，易于于照視，如如不能得得到，一一般家雞雞卵也可可應用。孵孵育溫度度通常在在3839之間，相相對濕度度4060。孵育育455天后即即可在檢檢蛋燈上上檢查雞雞胚受精精與否及及發(fā)育情情況。未未受精之之雞蛋于于4日后后僅見模模糊卵黃黃黑影，無無雞胚跡跡象?；罨畹碾u胚胚于4日日后即可可見清晰晰之血管管小網(wǎng)，中中有剛剛

34、剛發(fā)育之之胚胎，自自455天以后后逐日檢檢查胚胎胎生活情情況，逐逐日增大大之雞胚胚則可見見到清楚楚之絨毛毛尿囊膜膜上的血血管及活活動之胚胚胎。受精卵在在通過輸輸卵管時時，已開開始分裂裂，當產(chǎn)產(chǎn)卵時已已在卵黃黃中形成成細胞，名名為胚點點，在適適宜溫度度下即能能繼續(xù)分分裂發(fā)育育，形成成中、外外、內(nèi)三三胚層，逐逐步發(fā)育育成各種種器官。雞胚的最最外層為為石灰質(zhì)質(zhì)之卵殼殼，上有有細孔以以行氣體體交換，下下層為殼殼膜，很很容易與與孵殼分分開，殼殼膜的功功能是使使氣體分分子和液液體分子子在內(nèi)外外兩方面面進行交交換，因因此在孵孵育雞胚胚時需要要一定的的濕度和和氣流，如如果濕度度太低，雞雞胚就容容易脫水水，引起

35、起雞胚死死亡，氣氣流同樣樣是重要要的，孵孵育時如如空氣不不流通，亦亦可造成成雞胚的的死亡。因因此殼和和殼膜不不是簡單單的覆蓋蓋，而是是本身具具有維持持內(nèi)部生生命的功功能。氣氣室的功功能是呼呼吸和調(diào)調(diào)節(jié)壓力力，殼膜膜之下為為血管豐豐富的絨絨毛尿囊囊膜，外外為絨毛毛膜，系系外胚層層形成，內(nèi)內(nèi)為尿囊囊膜，由由內(nèi)胚層層形成，兩兩膜結(jié)合合之間為為中胚層層，因此此絨毛尿尿囊膜是是尿囊膜膜在生長長發(fā)育過過程中與與絨毛膜膜相連而而成，血血管較多多，起著著胚胎呼呼吸器官官的功能能，氧氣氣的交換換是在膜膜的血管管內(nèi)通過過卵殼孔孔而進行行的。雞雞胚孵育育至第33天即出出現(xiàn)尿囊囊，為直直腸腹側(cè)側(cè)部分的的膨出物物，尿囊

36、囊腔是胚胚胎的排排泄器官官，內(nèi)含含尿囊液液，初為為透明液液體，是是單純生生理鹽水水溶液，以以后尿囊囊液中尿尿酸鹽迅迅速增加加，胚胎胎發(fā)育到到第122133天，尿尿囊液開開始變得得渾濁，若若將其冷冷卻即可可見有沉沉淀物形形成，主主要是尿尿酸鹽類類。因此此，在制制備流感感病毒抗抗原時，通通常用鹽鹽水將尿尿液加以以稀釋后后放4備用，這這樣可減減少尿酸酸鹽的沉沉淀，尿尿液量在在雞胚發(fā)發(fā)育的第第11至至13天天最高，平平均為666.5毫升升。羊膜為胚胚胎最內(nèi)內(nèi)層包被被，系由由外胚層層組成，羊羊膜腔盛盛有羊水水，胎體體浸泡于于其中，羊羊水在起起初是單單純的生生理鹽水水，后來來則蛋白白質(zhì)含量量增加，羊羊水量

37、平平均為11毫升左左右。卵黃囊附附著于胚胚胎，卵卵黃囊膜膜系由內(nèi)內(nèi)胚層的的細胞組組成，對對培養(yǎng)病病毒有重重要作用用，內(nèi)包包有卵黃黃，為胚胚胎之養(yǎng)養(yǎng)料，卵卵白位于于卵之銳銳端，為為胚胎發(fā)發(fā)育晚期期之養(yǎng)料料。2Haankss溶液配配制，先先配成下下列甲、乙乙兩種原原液。原液甲：NaaCl1600克 KCCl8克 加入8800毫毫升雙蒸蒸水MggSO447H2O2克MggCl22H2O2克CaaCl22 2.88克溶于于1000毫升雙雙蒸水將上述二二溶液混混合后加加雙蒸水水至10000毫毫升，加加2毫升升氯仿作作為防腐腐劑，保保存于44冰箱。原液乙：Naa2HPOO412HH2O3044克KHH2P

38、O41.22克 加入入8000毫升雙雙蒸水葡萄萄糖20克克04酚酚紅液 1000毫升加入雙蒸蒸水使成成10000毫升升，加入入2毫升升氯仿作作為防腐腐劑，保保存于44冰箱，使使用前按按以下比比例配成成。原液甲1份原液乙1份雙蒸水18份份以9磅100分鐘滅滅菌，此此溶液存存于4冰箱，可可使用11個月。3營養(yǎng)養(yǎng)液的配配制Hankks液10000毫升升水解乳白白蛋白5克配制成00.5之水解解乳白蛋蛋白溶液液，分裝裝小瓶以以9磅100分鐘滅滅菌，使使用前再再加入55100無菌菌牛血清清，并調(diào)調(diào)整pHH（用NNaHCCO3溶液校校正）。40.25胰蛋白白酶溶液液配制胰酶2.55克Hankks使用用液10

39、000毫升升青霉素10毫毫升（最最終濃度度1000單位/毫升）鏈霉素10毫毫升（最最終濃度度1000單位/毫升）加胰酶和和抗生素素于Haankss液中，震震蕩使其其溶解，加加壓過濾濾除菌，分分裝，20低溫備備用，一一瓶最好好用一次次，不宜宜反復凍凍融。3流感病病毒的分分離和鑒鑒定過程程：【材料】患者早期期漱口液液（用大大管肉湯湯收集）、9910日日齡雞胚胚、1毫毫升注射射器及針針頭（116號）、抗抗生素（每每毫升含含青霉素素2萬單單位及22萬微克克鏈霉素素）、無無菌小試試管、吸吸管、00.5雞紅細細胞、已已知各型型流感免免疫血清清?！痉椒ā?病人人急性期期的漱口口液 （抗抗生素處處理） 活雞胚胚培養(yǎng)（羊羊膜腔接接種） 孵孵育355