1、回顧轉(zhuǎn)基因的整個實驗操作流程參考論文：農(nóng)桿菌介導(dǎo)的LFY基因過量表達載體轉(zhuǎn)化百合的研究 華農(nóng)中國是百合種類分布最多的國家，百合開花時間上,不同品種差異較大,大多數(shù)品種從種子到開花需要2-3年。過長的營養(yǎng)生長階段己經(jīng)成為其商業(yè)生產(chǎn)的阻礙,且傳統(tǒng)的日照,溫度等花期調(diào)控手段存在費時費力,效果不顯著的現(xiàn)象。擬南芥LFY基因參與花分生組織和花器官起始以及花序形態(tài)構(gòu)成。但是LFY基因?qū)τ谥参镉蔂I養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)化的作用在百合中還未見報道。研究意義基本流程基于以上研究結(jié)果我們構(gòu)建了擬南芥組成型啟動子CaMV35S啟動的LFY基因過量表達載體，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化到百合中。通過潮霉素抗性篩選,PCR檢測獲

2、得了轉(zhuǎn)化植株,并研究了 基因?qū)ζ湫螒B(tài)發(fā)育過程的影響進行了觀測統(tǒng)計和數(shù)據(jù)分析,以期為百合形態(tài)和花期調(diào)控進一步研究打下基礎(chǔ)。 LFY基因的克隆在已報道的LFY序列基礎(chǔ)上以擬南芥cDNA 為模板,設(shè)計特異引物擴增1200bp的LFYcDNA全長序列,引物序列如下:LFY-F:AGATCTTATGGATCCTGAAGGTTTCACGAGTG (下劃線為 Bgl /限制性內(nèi)切酶位點)LFY-R: GGTGACCCTAGAAACGCAAGTCGTCGCCGC (下劃線為Bst E限制性內(nèi)切酶位點)。1.1 PCR產(chǎn)物檢測擴增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,PCR產(chǎn)物的電泳圖見(圖3-4)。電泳結(jié)果表明,D

3、NA標(biāo)準(zhǔn)分子量條帶相比較,擴增產(chǎn)物的長度與大小與預(yù)期的相吻合,且條帶明亮,沒有引物二聚體。初步確定這個擴增產(chǎn)物為LFY基因片段。1.2 PCR產(chǎn)物回收、連接克隆載體用瓊脂糖凝膠回收試劑盒進行純化,然后將回收的目的片段連接到pGEM-T-easy載體上,連接程序1.3 藍白斑篩選克隆載體將連接后的產(chǎn)物用熱激法轉(zhuǎn)化感受態(tài)TOP10細胞中,加入150ulLB液體培養(yǎng)基,置于搖床上,37C,165rpm培養(yǎng)2h取培養(yǎng)好的菌液,加入4uL IPTG (200mg /L)和 16 uL X-gal (50 mg /L),混勻后均勻涂布在含氨芐(100mg /L)抗生素的LB平板上,37C恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)

4、14h,進行藍白斑篩選。1.4 PCR檢測克隆載體從平板上隨機挑選分隔良好的白色菌落,置于含氨芐(l00mg r)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中,37C, 165 r/min搖菌1214 h,用質(zhì)粒微量提取試劑盒提取質(zhì)粒,對質(zhì)粒用取Bgl /和Bst E酶切進行鑒定,片段符合預(yù)期,證明目的片段己經(jīng)連接到了載體上,得到重組質(zhì)粒LFY-T。1.5 克隆LFY測序質(zhì)粒送樣測序,將測序結(jié)果與Genebank上登錄的擬南芥因序列比對,發(fā)現(xiàn)核苷酸序列有三個堿基不同,但氨基酸序列完全一致(圖3-2),說明該獲得的基因全長序列可以用于表達載體的構(gòu)建。 2. CAMV 35S啟動的基因植物表達載體構(gòu)建 CAMV 35

5、S組成型啟動子和擬南芥基因融合表達載體構(gòu)建如下:將LFY基因片段、pCAMBIA1301分別經(jīng)Bgl /和Bst E酶切處理,酶切后片段回收連接植物表達載體pCAMBIA1301相應(yīng)位點并對重組質(zhì)粒進行Bgl /和Bst E酶切鑒定片段都與預(yù)期的大小符合,證明目的片段己經(jīng)連接到了載體上,得到植物表達載體35S:LFY。2.1 表達載體圖譜介紹35S啟動子啟動的基因過量表達載體p35S: :LFY(如圖3-3)2.2 表達載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌將因過量表達載體p35S: :LFY經(jīng)凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105后,挑取單克隆,搖菌獲得轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌 液,每瓶菌液中取lul,經(jīng)菌液PCR檢測證明LFY基因

6、過量表達載體p35S: :LFY已成功導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA105。2.3 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的篩選 CaMV35S啟動的LFY基因過量表達載體是潮霉素抗性的,所以在轉(zhuǎn)化前需要對所轉(zhuǎn)的百合品種先進行抗性濃度的篩選,確定合適的篩選濃度,以MS+6-BA2. 0mg /L+NAA0.2 mg/L為基本培養(yǎng)基,潮霉素濃度使用了 0, 20,25, 30, 40,50,60,70,80,90mg /L。本實驗重復(fù)三次。2.4 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的篩選結(jié)果在添加不同濃度潮霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)2個月后,觀察統(tǒng)計結(jié)果,結(jié)果表明:隨著潮霉素濃度的增加外植體的成活率逐漸降低,當(dāng)潮霉素濃度為20 mg /L時,鱗片全部褐死,故潮霉素

7、篩選濃度確定為20 mg/L(表4-1)。 表達載體轉(zhuǎn)化百合3.1 預(yù)培養(yǎng)以亞洲百合精粹培養(yǎng)三個月的初代無菌苗小鱗片為材料,用手術(shù)刀切掉邊緣,并對其背面進行劃傷,在光照條件下預(yù)培養(yǎng)3天,用于轉(zhuǎn)化。3.2 農(nóng)桿菌的活化與培養(yǎng)挑取攜帶目的基因的根癌農(nóng)桿菌單菌落EHA105接種于含相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中,28C 220r/ min振蕩培養(yǎng)過夜,取200 uL該菌液接種到20mL液體LB培養(yǎng)基中相同條件下培養(yǎng)到生長旺盛對數(shù)期,OD=0. 8左右時,4C, 5000r/min,離心 l0min,用附加 20mg/L AS (aceto-syringone,乙醜丁香酮)和 MES (2-嗎啉乙磺酸;

8、2-(4Morpholino)ethanesulfonic acid)的液體MS培養(yǎng)基重懸沉淀,稀釋侵染液OD600值至0.8, 28C 220 r/min振蕩培養(yǎng)2h,以備侵染材料。3.3 侵染和共培養(yǎng)用上述活化好的菌液侵染外植體8-10min,晃動菌液,使外植體和農(nóng)桿菌充分接觸。用無菌吸水紙紙吸干表面菌液,轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)培養(yǎng)基MS+6-BA2.0mg/l+NAA0. 2mg /l+AS20mg /L,黑暗條件下共培養(yǎng) 3d。3.4 篩選培養(yǎng)共培養(yǎng)3天后,將鱗片用含有300 mg /L- Carb的無菌水沖洗脫菌,再用無菌濾紙吸干表面液體,將外植體轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)(MS+6BA2.0rng/L+NA

9、A0.2mg/L+Hyg20mg/L+Carb500mg /L),在25C條件下培養(yǎng),每兩周轉(zhuǎn)接一次新鮮的培養(yǎng)基,篩選潮霉素抗性芽。接種外植體300個3.4 篩選培養(yǎng)結(jié)果每兩周換一次篩選培養(yǎng)基,外植體在兩周后會有不定芽突起,四周后會有抗性芽產(chǎn)生(如圖4-ld)。八周后鱗莖膨大(如圖4-le),八周后芽伸長(如圖4-If,g),隨后,鱗莖仍會出現(xiàn)膨大,芽伸長,但是生長速率下降(如圖4-lh,i)。3.5 抗性植株的PCR檢測取抗性植株和未轉(zhuǎn)化植株的幼嫩葉片為材料,釆用CTAB 法提取基因組DNA根據(jù)載體上LFY基因序列,設(shè)計合成下列引物:LFY-F: AGATCTTATGGATCCTGAAGGT

10、TTCACGAGTGLFY-R-. GGTGACCCTAGAAACGCAAGTCGTCGCCGC以提取的基因組DNA為模板,進行PCR檢測。在20株百合潮霉素抗性植株隨機挑選10株以葉片中提取的DNA為模板進行PCR擴增,抗性植株的PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果顯示,在1289bp處獲得陽性條帶,而未轉(zhuǎn)化植株沒有獲得條帶(圖4-2),初步證明了所獲得植株為LFY轉(zhuǎn)基因植株。3.6抗性植株的表型分析對抗性植株和未轉(zhuǎn)化對照植株在不同生長時期的形態(tài)變化進行了觀測統(tǒng)計。分別在30d, 45d, 60d, 75d, 90d,對植株的鱗莖直徑和株高進行了統(tǒng)計。相對于對照植株,抗性植株在生長的各階段均表現(xiàn)出鱗莖直徑增大,株系矮化的現(xiàn)象(圖4-3,圖4-4,圖4-5),且這種現(xiàn)象隨著植株的生長愈加明顯?？剐灾仓甑谋硇头治?. 結(jié)果轉(zhuǎn)LFY基因百合植株表現(xiàn)出鱗莖直徑增大,株高減小即矮化的現(xiàn)象。相似的表型曾在LFY轉(zhuǎn)基因雜交山楊和轉(zhuǎn)基因蘋果中有報道。而植株矮化與營養(yǎng)生長階段縮短與提前開花有密切關(guān)系。已有報道證明,赤霉素表達途徑調(diào)控能促進草本植物和木本植物的植株矮化進而提早開花時間。因此,我們推測LFY基因的過量表達促進了亞洲百合精粹從營養(yǎng)生長階段向生殖生長階段的轉(zhuǎn)變。然而