分子生物學(xué)基本實驗操作周正峰09.7.19周正峰克隆操作HEADLINEPCR技術(shù)實驗中一些好的習(xí)慣1234核酸抽提克隆操作HEADLINEPCR技術(shù)實驗中一些好的習(xí)慣1核酸抽提

1.1總RNA抽提

1.1.1原理

利用強(qiáng)變性劑異硫氰酸胍迅速裂解組織（或細(xì)胞），促使核蛋白與核酸的解離，并迅速抑制細(xì)胞內(nèi)的RNA酶；經(jīng)酸性苯酚-氯仿抽提，異丙醇沉淀可獲得完整的RNA。

1核酸抽提1.1總RNA抽提1.1.1原理1.1.2相關(guān)器皿的處理

1.1.2.1塑料制品的處理已經(jīng)標(biāo)明RNase-Free的塑料制品，如果沒有開封使用過，可以直接使用。對于國產(chǎn)塑料制品，都必須處理方可使用，步驟如下：

1）在玻璃燒杯中注入雙蒸水，加入DEPC使其終濃度為0.1%，磁力攪拌0.5小時；2）用1）浸泡需要處理的塑料制品，在通風(fēng)櫥中處理過夜；3）棄將DEPC水，用鋁箔封住處理過的塑料制品，高溫高壓滅菌至少30min；5）100℃烤至干燥，置于干凈處備用。槍頭必須在無菌操作臺中，用鑷子裝入槍頭盒。1.1.2相關(guān)器皿的處理1.1.2.1塑料制品的處理1.1.2.2玻璃和金屬制品的處理用去離子清洗干凈，用錫箔紙包好，然后至烘箱中250℃烘烤3小時以上或者180℃烘烤8小時以上。

1.1.2.3電泳槽的處理用于RNA電泳的電泳槽應(yīng)用去污劑洗干凈，再用水沖洗，用乙醇干燥，然后灌滿3%的H2O2溶液，于室溫放置10分鐘，最后用0.1%DEPC水徹底沖洗電泳槽。1.1.2.2玻璃和金屬制品的處理用去離子1.1.2.2其他RNA酶很難被滅活，實驗過程中要時刻注意防止RNA酶污染。實驗操作者的手也是RNA酶最主要的潛在污染源之一，因此，在實驗準(zhǔn)備和RNA抽提過程中，都應(yīng)戴手套，并盡可能勤換手套。實驗室RNA相關(guān)實驗用的儀器及試劑應(yīng)該專用，包括移液器、玻璃器皿、塑料制品和電泳槽等，并存放在指定地點。1.1.2.2其他RNA酶很難被滅活，實驗過1.1.3總RNA抽提步驟勻漿相分離溶解沉淀洗滌質(zhì)量檢測1.1.3總RNA抽提步驟勻漿相分離溶解沉淀洗1.1.3.1勻漿勻漿米粒大小的組織加入100微升Trizol，冰上充分研磨至看不見塊狀的組織，再補(bǔ)加900ulTrizol至1ml（適用肝、腎等組織）懸浮細(xì)胞貼壁細(xì)胞細(xì)胞液氮研磨棒組織傾去培養(yǎng)基，按10cmdish/ml的比例直接將Trizol加入到培養(yǎng)皿中消化、裂解細(xì)胞，用RNAsefree的槍頭吹打數(shù)次，將樣品轉(zhuǎn)入無RNA酶的EP管中用液氮預(yù)冷研缽，將綠豆大小的組織直接置于液氮中敲碎，并迅速研磨至粉末狀，小心轉(zhuǎn)移至1mlTrizol中。在研磨的過程中，應(yīng)不斷補(bǔ)加液氮，直至樣品成粉末狀（適用于心、胃、主動脈等組織）4℃2000g離心5分鐘收集細(xì)胞，用Trizol重懸、裂解，每1mlTrizol可裂解5-10*106個細(xì)胞

1.1.3.1勻漿勻漿米粒大小的組織加入100微升Triz1.1.3.2相分離（1）勻漿好的組織，室溫下靜置5-10min以充分裂解，4℃、16000rpm離心10min，取800微升上清液轉(zhuǎn)入一個無RNA酶的EP管中；若為細(xì)胞樣本，可以省略此步，直接進(jìn)行下一步操作；（2）按照1mlTrizol加入200μl氯仿，用手劇烈振蕩混勻15-30S后室溫靜置10-15min，直至出現(xiàn)較為明顯的分層；（3）4℃，16000r/min離心15min，小心吸取上層水相于一新管。*千萬不可吸取到中間界面，一般吸取300微升上清，所得RNA產(chǎn)量足以進(jìn)行一般的后續(xù)實驗，過多上清很容易造成DNA污染；1.1.3.2相分離（1）勻漿好的組織，室溫下靜置5-11.1.3.3RNA沉淀(4)加入等體積異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置10min；(5)4℃，12000rpm離心10min，棄上清，此時可見RNA沉淀于管底。在離心之前，RNA沉淀是不可見的，常常在離心管的邊緣或者底部形成凝膠狀小球；（6）加入1ml75%DEPC-乙醇，懸浮沉淀；

*此步一定要將RNA沉淀懸浮起來，才能保證殘留的鹽被洗去（7）4℃，12000rpm離心5min，棄上清，室溫晾干，或者真空干燥5~10min，視沉淀量的多少加入DEPC-ddH2O溶解RNA，可用槍吹打數(shù)下以助RNA溶解；

*沉淀不要過于干燥，否則將會大大降低RNA的溶解度；1.1.3.4RNA洗滌、溶解1.1.3.3RNA沉淀(4)加入等體積異丙醇，輕輕混1.1.3.5RNA質(zhì)量檢測（1）完整性：可以用普通瓊脂糖凝膠電泳分析RNA的質(zhì)量。電泳所用的緩沖液必須是新配置的。如果電泳可見28S和18S兩條主要條帶，以及5S的帶，并且28S的亮度在18S的兩倍以上，認(rèn)為RNA的質(zhì)量很好。*RNA上樣量應(yīng)控制在300-400ng左右，過多或過少都影響電泳效果1.1.3.5RNA質(zhì)量檢測（1）完整性：可以用普通瓊脂1.1.3.5RNA質(zhì)量檢測（2）純度和產(chǎn)量分析：計算A260/A280的比值R來判定RNA的純度：用DEPC-ddH2O溶解RNA，1.6<R<1.8，認(rèn)為RNA的質(zhì)量較好；R<1.6時，溶液中蛋白或者時其他有機(jī)物的污染比較明顯；

R>1.8時，說明RNA降解比較明顯。根據(jù)1A260單鏈RNA=40ng/ul計算RNA產(chǎn)量。1.1.3.5RNA質(zhì)量檢測（2）純度和產(chǎn)量分析：計算A1.1.3.6RNA樣本的保存將質(zhì)檢過關(guān)的RNA標(biāo)本編號，貼標(biāo)簽，置于-80℃保存。做好RNA標(biāo)本的貯存登記、RNA提取實驗記錄、RNA質(zhì)量鑒定記錄等，并由專人統(tǒng)一保管。1.1.3.6RNA樣本的保存將質(zhì)檢過關(guān)的RNA標(biāo)本編分子生物學(xué)基本實驗操作課件1.2基因組DNA的抽提1.2.1原理酚-氯仿法提取DNA原理為在EDTA（螯合二價陽離子以抑制DNase）存在的情況下，用蛋白酶K消化真核細(xì)胞或組織，用去污劑SDS溶解細(xì)胞膜并使蛋白質(zhì)變性，通過酚－氯仿法去除蛋白質(zhì)，而保留DNA于水相溶液，最后通過無水乙醇和高鹽溶液沉淀基因組DNA。

1.2基因組DNA的抽提1.2.1原理酚-氯1.2.2基因組DNA的抽提步驟勻漿相分離溶解沉淀洗滌質(zhì)量檢測1.2.2基因組DNA的抽提步驟勻漿相分離溶解沉1.2.2

基因組DNA的抽提步驟勻漿綠豆大小的組織加入100微升裂解液，充分研磨至看不見塊狀的組織，再補(bǔ)加900ul裂解液至1ml（適用肝、腎等組織），55℃裂解過夜懸浮細(xì)胞貼壁細(xì)胞細(xì)胞液氮研磨棒組織傾去培養(yǎng)基除，PBS洗滌細(xì)胞1-2次，按10cmdish/ml的比例直接將裂解液加入到培養(yǎng)皿中消化細(xì)胞，用槍頭吹落細(xì)胞，轉(zhuǎn)入EP管中55℃裂解過夜取黃豆大小的組織于盛有液氮的研缽內(nèi)迅速研磨至粉末狀。在研磨的過程中，不斷補(bǔ)加液氮，直至樣品成粉末狀（適用于心、胃等組織），將其小心轉(zhuǎn)入裝有1ml裂解液的EP管中，55℃裂解過夜；4℃2000g離心5分鐘收集細(xì)胞，PBS重懸浮洗滌細(xì)胞，按照1-5*107的比例加入裂解液，懸浮細(xì)胞，55℃裂解過夜；1.2.2基因組DNA的抽提步驟勻漿綠豆大小的組織加入101.2.2基因組DNA抽提步驟（2）勻漿裂解過夜的樣本應(yīng)清亮透明。加入等體積Tris-飽和酚，輕輕顛倒，充分混

勻形成乳濁液，此步將離心管置于旋轉(zhuǎn)器上，慢慢混勻10-30min；（3）室溫，12000rpm，離心10min，取上清；（4）加入等體積的酚-氯仿，輕輕顛倒混勻；（5）室溫，12000rpm，離心15min，小心取出上清；1.2.2基因組DNA抽提步驟（2）勻漿裂解過夜的樣本應(yīng)清亮1.2.2基因組DNA抽提步驟（6）加入1/10體積的3M醋酸鈉(pH5.2)和2.5倍體積的預(yù)冷無水乙醇，混勻，此時可見絮狀沉淀析出，置-80℃冰箱30min；（7）12000rpm離心15min，小心傾去上清；（8）加入1ml70%乙醇，懸浮沉淀；（9）4℃，12000rpm離心5min，棄上清，室溫晾干5-10min，視沉淀量的多少加入滅菌雙蒸水溶解DNA沉淀。1.2.2基因組DNA抽提步驟（6）加入1/10體積的3M醋1.2.3DNA質(zhì)量檢測一般將DNA樣品稀釋50-100倍（使OD260值位于0.1~1.0之間），檢測樣品的OD260，OD280，計算其比值R來衡量樣品的純度。一般R≈1.8，DNA質(zhì)量較好；R＞2.0,表明RNA污染明顯；R＜1.7，表明蛋白質(zhì)、酚等污染較為明顯。根據(jù)1A260雙鏈DNA=50ng/ul，計算DNA產(chǎn)量。質(zhì)檢過關(guān)的DNA，若短期內(nèi)需要進(jìn)行下一步實驗，可以暫存區(qū)-20℃，長期保存則應(yīng)置于-80℃。做好樣本貯存登記、具體的實驗記錄、質(zhì)量鑒定記錄等，并由專人統(tǒng)一保管。1.2.4DNA保存1.2.3DNA質(zhì)量檢測一般將DNA樣品稀釋50-1001.3

質(zhì)粒DNA的抽提1.3.1

原理將大腸桿菌懸液暴露于高pH的強(qiáng)陰離子洗滌劑中，細(xì)胞壁破裂，染色體DNA及蛋白質(zhì)變性，將質(zhì)粒DNA釋放到上清中。在裂解過程中，細(xì)菌蛋白質(zhì)、破裂的細(xì)胞壁和變性的染色體DNA會相互纏繞成大型復(fù)合物，被SDS所包圍，當(dāng)用鉀離子取代鈉離子時，這些復(fù)合物會從溶液中進(jìn)一步有效地沉淀下來，通過離心去除，利用異丙醇沉淀從上清中獲得質(zhì)粒DNA。

1.3質(zhì)粒DNA的抽提1.3.1原理將大腸桿菌懸液暴1.3.2質(zhì)粒DNA的抽提步驟菌夜重懸裂解沉淀，洗滌，溶解質(zhì)粒復(fù)性，蛋白沉淀氯仿抽提質(zhì)量檢測1.3.2質(zhì)粒DNA的抽提步驟菌夜重懸裂解沉淀，洗滌，溶1.3.2質(zhì)粒DNA抽提步驟1、取2ml過夜培養(yǎng)的菌夜于EP管中，4℃，離心收集菌沉淀；2、將細(xì)菌沉淀重懸于200μl預(yù)冷的溶液Ⅰ中，劇烈振蕩，使菌體分散混勻；

*一定要使細(xì)菌分散均勻3、加200μl新鮮配制的溶液Ⅱ，輕輕顛倒數(shù)次混勻（不可劇烈振蕩），并將離心管置冰上2-3min，使細(xì)胞壁充分裂解（離心管中菌液逐漸變得透明且粘稠）；

*此步時間不宜過長，混勻不能劇烈，否則基因組DNA斷裂，造成污染4、加入200μl預(yù)冷的溶液Ⅲ，將管溫和顛倒數(shù)次混勻，見白色絮狀沉淀，可在冰上放置3-5min；1.3.2質(zhì)粒DNA抽提步驟1、取2ml過夜培養(yǎng)的菌夜于E1.3.2質(zhì)粒DNA抽提步驟6、加入500μl的氯仿，混勻，4℃，12000rpm離心10min；

7、小心移去上請，加入等體積預(yù)冷的異丙醇，混勻，室溫放置5min，4℃，12000rpm離心15min，可見質(zhì)粒DNA沉淀；

8、小心棄上清，

1ml預(yù)冷的70%乙醇懸浮沉淀，4℃，12000rpm離心5min，重復(fù)此步一次；9、室溫干燥沉淀5-10min，視沉淀多少加入滅菌ddH2O溶解沉淀1.3.2質(zhì)粒DNA抽提步驟6、加入500μl的氯仿，混勻1.3.3質(zhì)粒DNA的質(zhì)量簽定一般將質(zhì)粒DNA樣品稀釋100倍，檢測樣品的OD260和OD280，計算其比值R來衡量樣品的純度。一般認(rèn)為R≈1.8,DNA質(zhì)量較好；R＞2.0，表明RNA污染明顯；R＜1.7，表明蛋白質(zhì)、酚等污染較為明顯。根據(jù)1A260雙鏈DNA=50ng/ul，計算質(zhì)粒DNA產(chǎn)量。質(zhì)檢過關(guān)的質(zhì)粒，若短期內(nèi)需要進(jìn)行下一步實驗，可以暫存區(qū)-20℃，長期保存則應(yīng)置于-80℃。做好質(zhì)粒樣本貯存登記、具體的實驗記錄、質(zhì)量鑒定記錄等，并由專人統(tǒng)一保管。1.3.4質(zhì)粒DNA的保存1.3.3質(zhì)粒DNA的質(zhì)量簽定一般將質(zhì)粒DNA樣品稀釋102、PCR技術(shù)2.1原理2、PCR技術(shù)2.1原理2.2

實驗室設(shè)置PCR實驗操作要求在三個不同的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行，嚴(yán)格預(yù)防PCR的污染：1、標(biāo)本處理區(qū)，包括擴(kuò)增模版的制備；2、PCR擴(kuò)增區(qū)，包括PCR反應(yīng)液的配置和PCR擴(kuò)增；3、PCR產(chǎn)物分析區(qū)，包括凝膠電泳分析，拍照及膠回收等。各工作區(qū)必須有一定的隔離，各區(qū)實驗器材需專用，并且各區(qū)設(shè)置要有一定的方向性：標(biāo)本制備—PCR擴(kuò)增—產(chǎn)物分析—產(chǎn)物處理。切記PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及產(chǎn)物分析區(qū)的器材不要拿到標(biāo)本處理區(qū)和PCR擴(kuò)增區(qū)。2.2實驗室設(shè)置PCR實驗操作要求在三個不同的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行，2.3PCR體系及相關(guān)參數(shù)的設(shè)置

10×PCRbuffer5μldNTPMix(各2.5mM)4μl引物P1（10mM）1μl引物P2（10mM）1μl模板*Xμl酶（5U/μl）0.5μl滅菌雙蒸水upto50μl

2.3.150μl標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系2.3PCR體系及相關(guān)參數(shù)的設(shè)置2.3.150μlPCR體系及相關(guān)參數(shù)的設(shè)置

50微升標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系中模板推薦使用量

人基因組DNA0.1-1μg大腸桿菌基因組DNA10-100ng質(zhì)粒DNA0.1-10ng2.3.2模板使用量

一般模板復(fù)雜程度越高，所需模板量越多，合適的模板量需要摸索條件PCR體系及相關(guān)參數(shù)的設(shè)置50微升標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系中模2.3.3PCR相關(guān)參數(shù)的設(shè)置

(1)預(yù)變性一般94℃5分鐘；(2)引物退火根據(jù)所設(shè)計的引物來決定，一般為55-70℃；(3)引物延伸一般在72℃進(jìn)行，延伸時間視擴(kuò)增片段長短而定，一般1Kb需延伸1min；(4)循環(huán)中的變性94℃，30秒足以使各種靶DNA序列完全變性；

(5)循環(huán)數(shù)大多數(shù)PCR過程含25-35個循環(huán)，過多易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增；(6)最后延伸在最后一個循環(huán)后，一般設(shè)置一個72℃，5-15min的延伸步驟，使引物延伸完全，并使單鏈產(chǎn)物退火成雙鏈。2.3.3PCR相關(guān)參數(shù)的設(shè)置(1)預(yù)變性2.3.4PCR體系的優(yōu)化

PCR反應(yīng)條件視模板、引物的結(jié)構(gòu)條件不同而各異，在實際操作中需根據(jù)模板來源、目的片段的大小及堿基組成、引物性質(zhì)等的具體情況摸索出最佳反應(yīng)條件。（1）引物退火溫度退火溫度是PCR實驗的一個重要參數(shù)，對PCR的特異性有很大影響。一般根據(jù)所設(shè)計引物退火溫度上下5℃來進(jìn)行梯度實驗，摸索出適合的退火溫度；（2）引物濃度引物的濃度會影響特異性。最佳的引物濃度一般在0.1到0.5μM，較高的引物濃度會導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增；2.3.4PCR體系的優(yōu)化PCR反應(yīng)條件視模板、引物2.3.4PCR體系的優(yōu)化

（3）鎂離子濃度

可以從1mM到3mM，以0.5mM遞增，進(jìn)行鎂離子濃度梯度實驗；（4）循環(huán)參數(shù)在PCR的前5-10個循環(huán)使用嚴(yán)緊的退火溫度，使特異性產(chǎn)物得到優(yōu)先擴(kuò)增，然后在一個較低的退火溫度下反應(yīng)20-30個循環(huán)；也可以使PCR反應(yīng)在一個高的退火溫度下開始，然后每個循環(huán)降低0.5℃到2℃，直到退火溫度低于引物設(shè)計溫度5℃；2.3.4PCR體系的優(yōu)化（3）鎂離子濃度

2.3.4PCR體系的優(yōu)化

（5）熱啟動冰上配制PCR反應(yīng)液，將其置于預(yù)熱的PCR儀上開始反應(yīng)；另外還可利用具有熱啟動功能的DNA聚合酶來實現(xiàn)熱啟動；（6）巢式PCR對于一些較難擴(kuò)增的模板，可以進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，以提高特異性和靈敏度。第一輪是15到20個循環(huán)的標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增，將擴(kuò)增所得產(chǎn)物稀釋100到1000倍做為模板，利用巢式引物進(jìn)行15到25個循環(huán)的第二輪擴(kuò)增。2.3.4PCR體系的優(yōu)化（5）熱啟動2.3.4PCR體系的優(yōu)化

（7）其他對某些結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜的模板，包括高GC含量的模板，需要添加一些促進(jìn)劑以獲得特異性的PCR產(chǎn)物，如甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜堿等可以增強(qiáng)PCR的擴(kuò)增。為獲得最佳結(jié)果，應(yīng)優(yōu)化添加劑的濃度，一般添加劑的濃度為甘油5%-10％，甲酰胺1%-5%或者DMSO2%-10%。

此外有市場化的GCrich的buffer，效果不錯2.3.4PCR體系的優(yōu)化（7）其他一般都采用瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析，初步判斷產(chǎn)物的特異性。PCR產(chǎn)物片段的大小應(yīng)與預(yù)計的一致，最終結(jié)果的確定還需要測序驗證。如果產(chǎn)物特異性好，5微升檢測能看見清晰的帶，可以直接將產(chǎn)物送測序，否則必須割膠回收。

2.3.5PCR產(chǎn)物分析

一般都采用瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析，初步判斷產(chǎn)物的（1）PCR所需要的試劑均應(yīng)在紫外滅菌后的超凈工作臺或負(fù)壓工作臺配制和分裝；（2）不能混用PCR產(chǎn)物分析室的吸頭，吸頭不要長時間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染；（3）在打開PCR反應(yīng)管時應(yīng)避免產(chǎn)物飛濺，如果濺到手套或桌面上，應(yīng)立即更換手套，并用稀酸擦拭桌面；2.3.6PCR實驗操作注意事項PCR的污染非?？膳?，較難消除，尤其是在進(jìn)行大量PCR實驗的時候更容易發(fā)生污染，在實驗操作的時候要嚴(yán)格注意以下幾點：（1）PCR所需要的試劑均應(yīng)在紫外滅菌后的超凈工作臺或負(fù)壓工（4）PCR反應(yīng)較多時，可以將相同組分制備反應(yīng)混合液，然后分裝，這樣既可以避免污染，又可以增加反應(yīng)的精確度；（5）必須設(shè)立陰性對照，尤其是在進(jìn)行菌落或者菌液PCR驗證的時候，如有可能，應(yīng)該也同時建立一個陽性對照，這樣可以驗證PCR反應(yīng)的可靠性；2.3.6PCR實驗操作注意事項（4）PCR反應(yīng)較多時，可以將相同組分制備反應(yīng)混合液，然后分（6）移液器最容易受產(chǎn)物氣溶膠或標(biāo)本DNA的污染，最好使用高壓處理的加樣器，如果不能高溫高壓處理，至少PCR操作過程中的移液器應(yīng)該專用，尤其是PCR產(chǎn)物分析所用的移液器不能拿到標(biāo)本處理區(qū)和PCR擴(kuò)增區(qū)；（7）在優(yōu)化實驗條件之前，應(yīng)該注意所剩的PCR試劑是否足夠完成后續(xù)的實驗，尤其是反應(yīng)buffer和酶，不能在優(yōu)化好條件之后更換試劑，這樣很可能需重新摸索條件。2.3.6PCR實驗操作注意事項2.3.6PCR實驗操作注意事項3克隆

3.1原理

普通DNA聚合酶具有末端轉(zhuǎn)移酶的活性，通常能在PCR產(chǎn)物的3‘端加上A尾單核苷酸，從而實現(xiàn)PCR片斷與一個具有3‘-T突出末端的載體連接；限制性內(nèi)切酶可識別DNA序列的特定位點并切割DNA產(chǎn)生粘性末端，酶切后的DNA片段經(jīng)純化處理后可以與具有相同粘性末端的載體相連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，鋪板培養(yǎng)，篩選陽性克隆。

3克隆3.1原理普通DNA聚合酶具有末端3.2克隆步驟

3.2.1載體和目的片段的酶切

（1）限制性內(nèi)切酶反應(yīng)在滅菌的PCR管中進(jìn)行，20μl體積反應(yīng)體系如下：

DNA0.2-2μg10×酶切buffer2.0μl酶1-2U加ddH2O至20μl

最適酶活溫度，酶切2-3小時，割膠回收目的片段。*載體酶切好之后，為防止酶切不完全形成自連而影響克隆的篩選，通常需要一個去磷酸化的處理，用牛小腸堿性磷酸酶（CIAP）處理載體酶切后的產(chǎn)物。通常1μg量的DNA加入0.5U的CIAP，37℃處理30min，70℃滅活10min，可以防止載體自連。3.2克隆步驟3.2.1載體和目的片段的酶切（1）3.2.1載體和目的片段的酶切

*根據(jù)酶的用量及酶切的難易程度選擇合適的酶切時間，一般酶切2-3小時；為

酶切完全有時也可以酶切過夜，但要注意防止降解；*多種酶消化時若緩沖液條件相同，可將酶同時加入；否則，先做低溫或低鹽

的酶切消化，再做高溫或高鹽的酶切消化；*注意酶的星號活性3.2.1載體和目的片段的酶切*根據(jù)酶的用量及酶切的難3.2克隆步驟

3.2.1載體和目的片段的連接

（1）無菌離心管中加入合適摩爾比的載體和目的片段，通常載體和目標(biāo)片段的摩爾比為1：2-10；（2）加入等體積的SolutionI連接液，混勻，16℃反應(yīng)60分鐘，一般連接體系為10μl；

*連接時間根據(jù)所插入片段的大小以及酶切情況而定。如果目的片段較大，連接則需要較長時間；酶切產(chǎn)生平端，應(yīng)該過夜連接；有些酶雖然酶切產(chǎn)生粘端，但比一般的粘末端連接效率要低得多，也應(yīng)該過夜連接，如NdeI,XhoI。3.2克隆步驟3.2.1載體和目的片段的連接（1）3.2.2連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化（1）于無菌操作臺中，將連接產(chǎn)物加入到100μlDH5α感受態(tài)細(xì)胞（預(yù)先從-80℃冰箱中取出，置冰上溶化），輕輕混勻，冰上放置30分鐘；（2）42℃熱擊60-90秒鐘，迅速于冰中放置3分鐘；*熱擊時間不可超過90秒，且熱擊過程中勿動EP管（3）加入900μl無抗性的LB液體培養(yǎng)基，37℃，180rpm振蕩培養(yǎng)1h；3.2.2連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化（1）于無菌操作臺中，將連接產(chǎn)物加3.2.2連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化（4）將菌液離心，去掉700μl培養(yǎng)基，重新懸浮細(xì)菌，涂布于含有相應(yīng)抗性的平板；（5）涂布好的板先于37℃正置培養(yǎng)一段時間，至板上看不見明顯的菌液，然后37℃倒置過夜培養(yǎng)，形成單菌落；*一般培養(yǎng)時間不能超過16小時，否則會長出小的衛(wèi)星菌落，不宜挑出單克??；3.2.2連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化（4）將菌液離心，去掉700μl培3.2.3陽性克隆的簽定（1）于無菌操作臺中，將板上的單克隆接種到3ml含相應(yīng)抗性的LB培養(yǎng)集中，37℃，220rpm，振蕩培養(yǎng)過夜；（2）菌液PCR驗證初步驗證，20μl體系如下：10×PCRbuffer2μldNTPMix(各2.5mM)1.6μl上游引物P1（10mM）0.8μl下游引物P2（10mM）0.8μl菌液1.5μl酶（5U/μl）0.2μl滅菌雙蒸水13.1μl3.2.3陽性克隆的簽定（1）于無菌操作臺中，將板上的單克3.2.3陽性克隆的簽定菌液PCR應(yīng)注意：*上下游引物最好一條來自于載體，另一條為特異性引物；*PCR循環(huán)數(shù)不宜多，一般25個循化就行，多了易出現(xiàn)假陽性；*菌落PCR一定要建立陰性對照3.2.3陽性克隆的簽定菌液PCR應(yīng)注意：3.2.3陽性克隆的簽定（3）將初步確定為陽性的克隆保菌（15%甘油），抽質(zhì)粒，送樣測序；（4）分析測序結(jié)果，將陽性克隆質(zhì)粒及對應(yīng)的甘油菌編號，貼標(biāo)簽，質(zhì)粒若短期內(nèi)需要進(jìn)行下一步實驗，則可以暫存區(qū)-20℃，長期保存則應(yīng)置于-80℃。將克隆過程中未經(jīng)測序簽定及測序結(jié)果不對的質(zhì)粒及時丟棄，做好質(zhì)粒樣本貯存登記、克隆的具體實驗記錄、DNA質(zhì)量鑒定記錄等，并由專人統(tǒng)一保管。3.2.3陽性克隆的簽定（3）將初步確定為陽性的克隆保菌（3.3T-A克隆的步驟1割膠回收PCR產(chǎn)物，按照凝膠回收試劑盒操作說明進(jìn)行；*割膠回收前一定要注意，PCR采用的DNA聚合酶是否有加A功能，如果有，可直接割膠回收，如果沒有，PCR結(jié)束后必須進(jìn)行加A處理，一般50微升的PCR體