微生物學大實驗實驗指導編者：生物技術教研室2007.3實驗六釀酒酵母細胞固定化與酒精發(fā)酵一、目的要求了解固定化酶及微生物細胞固定化的原理及其優(yōu)缺點。掌握制備固定化細胞中最基本、最常用的方法。學會用固定化釀酒酵母進行酒精發(fā)酵及酒精的測定方法。二、基本原理用發(fā)酵法生產(chǎn)的許多產(chǎn)品如乙醇、乳酸、檸檬酸、氨基酸和維生素等，常是由于微生物細胞內(nèi)的ATP再生和輔酶的多級反應形成的?？紤]到微生物細胞可將輔助因子再生，并且酶在細胞內(nèi)比提取出來穩(wěn)定性更高，日本科學家千佃一郎從酶的固定化研究進入了微生物細胞固定化的研究。固定化酶和固定微生物細胞的原理是將酶或微生物細胞利用物理的或化學的方法，使酶或細胞與固體的水不溶性支持物（或稱載體）相結(jié)合，使其既不溶于水，又能保持酶和微生物的活性。它在固相狀態(tài)作用于底物，具有離子交換樹脂那樣的特點，有一定的機械強度，可用攪拌或裝柱形式與底物溶液接觸。由于酶和微生物細胞被固定在載體上，使得它們在反應結(jié)束后，可反復使用，也可貯存較長時間使酶和微生物活性不變。該項技術是近代工業(yè)微生物學上的重要革新，展示著廣闊的前景。固定化酶的研究開始于50年代初至60年代后半期，發(fā)展迅速。由于微生物酶有胞外酶和胞內(nèi)酶之分，胞外酶由微生物細胞合成后分泌至培養(yǎng)基中；胞內(nèi)酶在整個培養(yǎng)過程始終保留在細胞內(nèi)或細胞表面，只有當細胞裂解后才能釋放至培養(yǎng)基中，因此，在使用胞內(nèi)酶時，應先將其從細胞中提取出來。有些胞內(nèi)酶在提純、固定化過程中還會失去活性，提純過程復雜，故提高了成本，給固定化酶帶來許多麻煩。此外，有些酶促反應需要多步完成，固定一種酶并不能滿足工藝需要。因此，由固定化酶發(fā)展到將整個細胞固定化起來，即微生物細胞固定化，其優(yōu)點是可避免復雜的酶提取和純化過程，同時解決了酶的不穩(wěn)定性問題。細胞固定化后，酶活較高，操作穩(wěn)定性較好，可在多步酶促反應中應用并便于連續(xù)化、自動化操作。一般胞內(nèi)酶、提純酶在固定化中或固定化后常不穩(wěn)定、而微生物不含干擾酶或易去除干擾性酶，若代謝底物及產(chǎn)物均為低分子物質(zhì)時使用固定化微生物細胞效果更佳。微生物細胞固定化常用載體有（1）多糖類（纖維素、瓊脂、葡聚糖凝膠、藻酸鈣、K-角叉膠、DEAE-纖維素等）；（2）蛋白質(zhì)（骨膠原、明膠等）；（3）無機載體（氧化鋁、活性炭、陶瓷、磁鐵、二氧化硅、高嶺土、磷酸鈣凝膠等）；（4）合成載體（聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、酚醛樹脂等）。選擇載體原則以價廉、無毒、強度高為好。微生物細胞固定化常用的方法有三大類：1．吸附法吸附法是將細胞直接吸附于惰性載體上，分物理吸附法與離子結(jié)合法。①物理吸附法是利用硅藻土、多孔磚、木屑等作為載體，將微生物細胞吸附住。②離子結(jié)合法是利用微生物細胞表面的靜電荷在適當條件下可以和離子交換樹脂進行離子結(jié)合和吸附制成固定化細胞。吸附法優(yōu)點是：操作簡便、載體可再生；缺點是：細胞與載體的結(jié)合力弱，pH、離子強度等外界條件的變化都可以造成細胞的解吸而從載體上脫落。2．包埋法是將微生物細胞均勻地包埋在水不溶性載體的緊密結(jié)構(gòu)中，細胞不至漏出而底物和產(chǎn)物可以進入和滲出。細胞和載體不起任何結(jié)合反應，細胞處于最佳生理狀態(tài)。因此，酶的穩(wěn)定性高，活力持久，所以目前對于微生物細胞的固定化大多采用包埋法。本次實驗作為重點訓練。3．共價交聯(lián)法是利用雙功能或多功能交聯(lián)劑，使載體和酶或微生物細胞相互交聯(lián)起來，成為固定化酶或固定化細胞。常用的最有效的交聯(lián)劑是戊二醛，這是一種雙功能的交聯(lián)劑，在它的分子中，一個功能團與載體交聯(lián)，另一個功能團與酶或細胞交聯(lián)。此法最為突出的優(yōu)點是：固定化酶或細胞穩(wěn)定性好，共價交聯(lián)劑和載體都很豐富。然而到目前為止，尚無一種可用于所有種類的微生物細胞固定化的通用方法，因此，對某一特定的微生物細胞來說，必須選擇其合適的固定化方法和條件。三、實驗材料（一）菌種釀酒酵母。（二）培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基YPD分裝30ml培養(yǎng)基于250ml錐形瓶中，共4瓶，經(jīng)100Pa滅菌20min,備用。酒精發(fā)酵培養(yǎng)基YG分裝200ml培養(yǎng)基于300ml錐形瓶中，共4瓶，經(jīng)100Pa滅菌備用。（三）主要藥品海藻酸鈉、瓊脂、K-角叉膠、葡萄糖、蛋白質(zhì)、酵母膏、明膠、戌二醛等。（四）器皿培養(yǎng)皿、無菌10ml注射器外套及5#靜脈針頭或帶噴嘴的小塑料瓶、移液管、小燒杯、玻璃棒、牛角勺、小刀、燒瓶、冷凝管等。四、實驗內(nèi)容（一）酵母種子培養(yǎng)液的制備挑取新鮮斜面菌種一環(huán)，接入裝有30mlYPD培養(yǎng)基的錐形瓶中，30°C振蕩培養(yǎng)，共接4瓶，培養(yǎng)至對數(shù)期。（二）細胞的固定化1．包埋法（1）瓊脂凝膠固定化細胞的制備稱取1.6g瓊脂于100ml小燒杯中，加水40ml,火上加熱熔化后，100Pa滅菌20min冷卻至50C左右，加入10ml培養(yǎng)至對數(shù)期酵母種子液，混合均勻，立即倒入直徑15cm的無菌平皿中，待充分凝固后用小刀切成大小為3x3x3mm3的塊狀，裝入300ml錐形瓶中，用無菌去離子水洗滌3次，加入200mlYG培養(yǎng)液，置30C培養(yǎng)72h。另外，再取10ml未經(jīng)固定化的酵母種子液接入到裝有200mlYG培養(yǎng)液的無菌錐形瓶中作為對照，同樣條件下培養(yǎng)72h后測酒精含量。如采用連續(xù)發(fā)酵法，可使用柱式反應器（圖12-2-1）,即將固定化細胞放入12.5x2.8cm柱中，然后將YG培養(yǎng)基于30C，以50ml.h-1的速率通過反應柱。包埋細胞在凝膠柱中生長繁殖達到穩(wěn)定狀態(tài)。連續(xù)添加YG培養(yǎng)基可維持這種穩(wěn)定狀態(tài)。在這種情況下，以填充柱中凝膠珠體積和流加培養(yǎng)基速率比，來表示滯留時間，溫度維持在30C，為了防止填充柱被雜菌污染，通常是在無菌條件下進行的。（2）海藻酸鈉凝膠固定化細胞的制備海藻酸鈉凝膠是從海藻中提取獲得的藻酸鹽，為D-甘露糖醛酸和古洛糖醛酸的線性共聚物，多價陽離子如Ca2、Al3可誘導凝膠形成。將微生物細胞與海藻酸鈉溶液混勻后，通過注射器針頭或相似的滴注器將上述混合液滴入CaCl2溶液中，Ca2從外部擴散進入海藻酸鈉與細胞混合液珠內(nèi)，使藻酸鈉轉(zhuǎn)變?yōu)樗蝗艿脑逅徕}凝膠，由此將微生物細胞包埋在其中。在此法的使用中，應盡量避免培養(yǎng)基中含有鈣螯合劑（如磷酸根），因為它可導致鈣的溶解和釋放，并由此引起凝膠的破壞。稱取1.6g海藻酸鈉于無菌的小燒杯中，加無菌去離子水少許，調(diào)成糊狀，再加入其余的水（總量為40ml）。火上加溫至熔化，冷卻至45C左右，加入10ml酵母培養(yǎng)液，混合均勻，倒入一個無菌的小塑料瓶中或注射器外套并與針頭相連，通過1.5?2.0mm的小孔，以恒定的速度滴到盛有10％CaCl2（膠誘導劑）溶液的平皿中制成凝膠珠。浸泡30min后，將凝膠珠轉(zhuǎn)入300ml錐形瓶中，用無菌去離子水洗滌三次后加入200mlYG培養(yǎng)基，置30C培養(yǎng)72h測定酒精含量。（3）K-角叉膠固定化細胞的制備K-角叉膠是一種從海藻中分離出來的多糖，其化學組成為P-D-半乳糖硫酸鹽和3,6-脫水-a-D-半乳糖交聯(lián)而成。熱K-角叉膠可經(jīng)冷卻或經(jīng)膠誘生劑如K、NH4、Ca2、Mg2、Fe3及水溶性有機溶劑誘導形成凝膠。K-角叉膠固定微生物細胞有許多優(yōu)點，如凝膠條件粗放，凝膠誘生劑對酶活性影響很少，細胞回收方便，因此，目前多選用它作載體。稱取1.6gK-角叉膠，于小燒杯中加無菌去離子水，調(diào)成糊狀，再加入其余的水(總量為40ml),火上加溫至熔化，冷卻于45°C左右，加入10ml預熱至31°C左右的酵母培養(yǎng)液。混合后倒入帶有小噴嘴的塑料瓶中或注射器外套并與小針頭相接，通過直徑為1.5?2.0mm的小孔，以恒定的速度滴到裝有已預熱至20C、2％KCl溶液的平皿中制成凝膠珠，浸泡30min后，將凝膠轉(zhuǎn)入300ml錐形瓶中，用無菌去離子水洗滌三次后，加入200mlYG培養(yǎng)液，置30C恒溫箱培養(yǎng)72h，觀察結(jié)果；同時取出2粒凝膠置于無菌生理鹽水中浸泡，然后放4C冰箱保存，留作計算細胞活菌數(shù)。2．共價交聯(lián)法吸取10ml培養(yǎng)到對數(shù)期的酵母菌懸液加入加25ml2%的明膠液中，混合均勻，倒入15cm的無菌平皿中，在0?5°C凍結(jié)后，切成3x3x3mm3小塊，再浸入1.5%戊二醛中，室溫下交聯(lián)3h，將顆粒轉(zhuǎn)入300ml錐形瓶中，用無菌去離子水洗滌三次，加入YG培養(yǎng)基，置30C培養(yǎng)72h后測定酒精含量。結(jié)果觀察1．固定化細胞的回收與活菌計數(shù)取培養(yǎng)72h的固定化細胞，如含酵母的K-角叉凝膠包埋珠2粒，放入5ml無菌生理鹽水中。培養(yǎng)前的凝膠珠同樣處理。37C輕振15min，使膠珠溶解。適當稀釋后涂布于YPD瓊脂平板進行活菌計數(shù)，觀察酵母菌在包埋塊中的增殖情況。2．酒精發(fā)酵液的蒸餾及酒精度的測定(1)由于本次實驗發(fā)酵液中所含酒精度較