精品1總提取(1)液氮研磨或冰上勻漿實(shí)驗(yàn)材料；先將1mlTrizol加到離心管中待用謝謝閱讀(2)將研磨好的樣品加到離心管中混勻，室溫放置5min精品文檔放心下載(3)加μL氯仿，振蕩sec，室溫放置3min，分層；感謝閱讀(4)4o，12,000，離心min；感謝閱讀(5)取上清，加μL異丙醇，混勻，室溫放置min；精品文檔放心下載(6)4o，12,000，離心min；謝謝閱讀(7)棄上清，加1乙醇，漂浮洗滌沉淀，振蕩充分；再用100%乙感謝閱讀醇清洗(8)4o，7,500，離心5min；(9)μLDEPC精品文檔放心下載水，－oC保存。此操作中所用到的器皿均需經(jīng)過DEPC滅活酶處理。提取的總RNA精品文檔放心下載需經(jīng)電泳檢測質(zhì)量，并用紫外分光光度計(jì)測定濃度。OD感謝閱讀260值為核酸的吸280260/280值在1.8-2.0間一般說明該核酸蛋白精品文檔放心下載OD230值為多糖和酚類的吸收值，比較干凈的核酸OD260/230值能達(dá)到2.2濃精品文檔放心下載度（μg/mL）=A×稀釋倍數(shù)×40。-可編輯-精品2反轉(zhuǎn)錄/cDNA第一鏈的合成純化以去除基因組，操作按TaKaRa公司的PrimeScriptRT謝謝閱讀reagentgDNAEraser(PerfectTime)感謝閱讀TotalRNA1μggDNAEraserBuffer2μLEraser1μLRNaseFreedH補(bǔ)齊至10μLO條件為：oC，；純化后，即可進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。其體系為：5×PrimeScriptBuffer（forReal）4μL謝謝閱讀PrimeScriptRTenzymemixⅠ1μL感謝閱讀RTPrimerMix1μL上一步的反應(yīng)液10μLRNaseFreedH補(bǔ)齊至20μLO操作條件為：(1)37oC放置15；(2)85o5sec；(3)4oC保存。感謝閱讀3PCR按TaKaRa公司的PremixTaqVersion2.0反應(yīng)體系如下：謝謝閱讀-可編輯-精品PremixTaqμL模板5μL引物1(10μM)1μL引物2(10μM)1μLO18μLPCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性5min；94°C變性，退火30s，精品文檔放心下載延伸30s，循環(huán)次；延伸10min。謝謝閱讀PCR反應(yīng)完畢，取5μL反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳（若割膠回收則感謝閱讀用10μL4基因克隆及測序4.1PCR產(chǎn)物切膠回收將PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，在紫外燈下觀察并切下預(yù)期大小精品文檔放心下載的片段。使用TIANGEN公司的UniversalDNAPurificationKit割膠回精品文檔放心下載收試劑盒進(jìn)行純化，步驟如下：CB2500μL平衡謝謝閱讀液，13,400×g離心1min，倒掉收集管中的廢液，吸附柱CB2重新套回收感謝閱讀集管中；(2)按mgagarose膠加入100μL溶液PC，置于50oC中10min左感謝閱讀右，中途混勻幾次，至膠完全融化；(3)將樣品倒入一個(gè)吸附柱CB2感謝閱讀×g離心1，倒掉收集管中的廢液，吸附柱CB2重新套回收集管中；謝謝閱讀-可編輯-精品(4)向吸附柱CB2中加入600μL漂洗液13,400×g感謝閱讀離心1，倒掉收集管中的廢液，吸附柱CB2重新套回收集管中；精品文檔放心下載(5)重復(fù)上一步驟；(6)將吸附柱CB2放入收集管中，室溫下13,400×g離心2，盡量除謝謝閱讀去漂洗液，將吸附柱置于室溫放置數(shù)分鐘，徹底晾干；(7)將柱子套入一新的滅菌1.5mL離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加精品文檔放心下載50μL洗脫緩沖液，室溫放置2分鐘，13,400×g室溫離心2感謝閱讀脫液即為回收的純化液；(8)取5μL的純化液體進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，以檢查純度，并測量溶液精品文檔放心下載中含量。4.2目的片段與載體連接(1)膠回收產(chǎn)物與T載體連接體系，參考Takara公司pMD18-T載體的試謝謝閱讀劑盒說明書。在滅菌的0.5mL離心管中配制如下溶液（謝謝閱讀回收4μLLigationSolution5μLpMD18-TVector1μL(2)16oC反應(yīng)30分鐘，所得產(chǎn)物保存于－C冰箱備用。謝謝閱讀4.3連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α(1)將5μL連接產(chǎn)物加入到100μLE.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕旋轉(zhuǎn)感謝閱讀離心管混勻內(nèi)容物，冰上靜置min；(2)42oC水浴熱激轉(zhuǎn)化sec，立即放回冰上，放置3min；精品文檔放心下載-可編輯-精品(3)每管加入500μLoC160-180rpm振蕩培感謝閱讀養(yǎng)min，使菌體復(fù)蘇并表達(dá)抗性基因；(4)在含有μg/mL60-100μL菌液，用精品文檔放心下載無菌涂布棒輕輕涂布均勻后，用Parafilm膜封好；謝謝閱讀(5)oC約50min精品文檔放心下載養(yǎng)h。4.4轉(zhuǎn)化子的篩選及鑒定(1)用無菌槍頭挑取平板上3-5個(gè)單菌落，分別接種到3.5mLLB液體精品文檔放心下載培養(yǎng)基中（含μg/mLoC，165rpm振蕩培養(yǎng)10-1