食物中泛酸的測定方法微生物測定法.原理泛酸對于Lactobacillusplantarum（ATCC8014）的正常生長是一種必需的營養(yǎng)素，在一定生長條件下，Lactobacillusplantarum的生長與繁殖速度同樣品中泛酸的含量成一定的線性關(guān)系，通過利用濁度法或光密度法測定細菌增殖的強度即可間接地檢測出食物樣品中泛酸的含量。本方法最低檢出限為 5ng。.適用范圍本方法參考"OfficialMethodsofAnalysisoftheAssociationofofficialAnalyticalChemists"、"MethodsofVitaminAnalysis"以及"MethodsoftheMicrobiologicalAnalysisofSelectedNutrients"。本方法適用于測定各類食物（包括天然食物及加工食物）及飼料中的泛酸含量。.試劑本試驗用水均為蒸儲水，所用試劑均需分析純試劑。甲苯1mol/L鹽酸溶液Tris緩沖溶^將24.2三羥基氨基甲烷溶于 150ml水中，用7.5mol/LNaOH調(diào)pH至8.0~8.3,然后定容至200ml,貯存于4c冰箱中，可保存2周。7.5mol/L氫氧化鈉溶液：溶150g氫氧化鈉于水中，定容至500ml。2mol/L醋酸：12ml冰醋酸用水定容至1000ml。2mol/L醋酸鈉溶液：將16.4g醋酸鈉用水定容至1000ml。2mol/L碳酸氫鉀溶液：稱取 10.012g碳酸氫鉀溶于水中，然后定容至500ml。2%堿性磷酸酶溶液：稱取 2g堿性磷酸酶（Sigma公司No.P-3877）溶于水中，然后定容至100ml。貯存于4c冰箱中保存。10%鴿子肝臟提取物溶液：將所用容器在配制此試劑前一天放入 4c冰箱中過夜。（1）稱取30g鴿子肝臟丙酮提取物粉末（Sigma公司，No.L-8376）放入冷的研缽中，分兩次加入300ml0.2NKHCO3,至0c的冰浴中研磨均勻直至呈懸濁液； （2）將此懸濁液分別放入8支離心管中，塞緊后充分振搖，冷凍10分鐘，然后3000轉(zhuǎn)離心5分鐘；（3）將上清夜放入500ml預(yù)冷的廣口燒瓶中，力口150g活性Dowex1-X8（Bio-RadLaboratories,Inc.,Brussels,Belgium）,放在冰浴中震搖5分鐘；將混合液倒入離心管中，3000轉(zhuǎn)離心5分鐘；（4）再將上清液移入另一個冷的 500ml廣口燒瓶中，冷凍10分鐘；（5）重復(fù)上述（3）、（4）步驟一次；（6）然后分裝于試管中，冷凍條件下保存，用前化凍。酸解酪蛋白液：稱取50g不含維生素的酪蛋白于 500ml燒杯中，加200ml3mol/L鹽酸，于壓力蒸汽消毒器內(nèi)10.3M04Pa（15lb/in2）壓力下水解6小時。將水解物轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿內(nèi)，在沸水浴上蒸發(fā)至膏狀。加200ml水使之溶解后再蒸發(fā)至膏狀，如此反復(fù) 3次，以去除鹽酸。以澳酚藍作外指示劑，用 10mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至3.5。加20g活性炭，振搖，過濾，如果濾液不呈淡黃色或無色，可用活性炭重復(fù)處理。濾液加水稀釋至 500ml,貯存于試劑瓶中，加少許甲苯于冰箱中保存。?酸解的目的是為了去除酪蛋白中的維生素，使基本培養(yǎng)基中不含待測定的維生素，但有時酸水解不一定徹底，所以一定要選用不含維生素的酪蛋白粉， 這樣可較好地確保酸解酪蛋白中不含生物素。胱氨酸-色氨酸溶液：稱取4gL-胱氨酸和1gL-色氨酸（或2gDL-色氨酸）于800ml水中，加熱至70-80C,逐滴加入（1+5）的鹽酸，不斷攪拌，直至完全溶解為止。冷至室溫，加水稀釋至1000ml。加少許甲苯于冰箱中保存。腺喋吟、鳥喋吟、尿喀咤溶液：稱取硫酸腺喋吟（純度為 98%）、鹽酸鳥喋吟（生化試劑）以及尿喀咤各0.1g于250ml燒杯中，加75ml水和2ml濃鹽酸，然后加熱使其完全溶解，冷卻，若有沉淀產(chǎn)生，加鹽酸數(shù)滴，再加熱，如此反復(fù)，直至冷卻后無沉淀產(chǎn)生為止，以水稀釋至100ml。加少許甲苯于冰箱中保存。吐溫80溶液：將25g吐溫溶于乙醇中并定容至250ml。維生素溶液I:稱取20mg核黃素，10mg鹽酸硫月素，0.04mg生物素，用0.02mol/L醋酸溶液溶解并定容至1000ml。維生素溶液n：10mg對氨基苯甲酸，50mg尼克酸，40mg鹽酸口比哆醇，溶于（1+3）的乙醇溶液，并定容至1000ml。鹽溶液A:稱取25g磷酸二氫鉀和25g磷酸氫二鉀溶于500ml水中，加5滴濃鹽酸。3.17鹽溶液B:稱取10gMgSO47H2O、1gKCl、0.5gMnSO44H2O,0.5gFeSO47H2O、23ml85%H3PO4,溶于水中并定容至500ml。泛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液溶液名稱濃度配置方法標(biāo)準(zhǔn)儲備液40（1g/ml稱取43.47mgD-泛酸鈣（Sigma公司，No.P-2250）標(biāo)準(zhǔn)物，溶解于500ml水中，加入10ml0.2mol/L的醋酸，100ml0.2mol/L醋酸鈉，然后用水定容至 1000ml,此時溶液的泛酸鈣濃度為43.47ml,相當(dāng)于泛酸濃度為 40/ml,貯存于2-4C冰箱中。標(biāo)準(zhǔn)中間液1.0 /ml取25ml儲備液放入500ml水中，再加入10mlmol/L的醋酸，100ml0.2mol/L醋酸鈉，然后用水定容至1000ml,在2-4C冰箱中貯存。標(biāo)準(zhǔn)工作液10ng/ml取1ml中間液用水定容至100ml,在2-4C冰箱中貯存。3.19基本培養(yǎng)基：將下列試劑混合于 500ml燒杯中，加水至200ml,以澳麝香草酚藍作外指示劑，用10mol/L氫氧化鈉液調(diào)節(jié)pH至6.8,用水稀釋至250ml。酸解酪蛋白25ml胱氨酸、色氨酸溶液25ml腺喋吟、鳥喋吟、尿喀咤溶液5ml維生素溶液I5ml維生素溶液n5ml鹽溶液A5ml鹽溶液B5ml無水葡萄糖10g三水醋酸鈉8.3g吐溫80溶液0.25ml此培養(yǎng)基也可從Difco公司購得，產(chǎn)品號為0816-15-7。?由于國內(nèi)的某些試劑純度不夠，所以自行配制的培養(yǎng)基較渾濁，嚴重影響到最后的濁度測定結(jié)果，因此建議使用進口培養(yǎng)基。瓊脂培養(yǎng)基：在600ml水中，加入15g蛋白月東，5g水溶性酵母提取物干粉，10g無水葡萄糖，2g無水磷酸二氫鉀，100ml番茄汁，10ml吐溫80,加熱溶解，用40%氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為6.5~6.8,然后定容至1000ml,每500ml液體培養(yǎng)基加5.0~7.5g瓊脂，于121c高壓滅菌10分鐘，取出后豎直試管，待冷卻至室溫后于冰箱 2-4C條件下保存。生理鹽水：稱取9.0g氯化鈉溶于1000ml水中，。每次使用時分別到入2~4支10ml試管中，每支約加10ml,塞好棉塞，于121c高壓滅菌10分鐘，備用。0.04%澳麝香草酚藍溶液：稱取0.1g澳麝香草酚藍于小研缽內(nèi)， 加1.6ml0.1mol/L氫氧化鈉研磨，加少許水繼續(xù)研磨，直至完全溶解，用水稀釋至 250ml。0.04%澳甲酚綠溶液：稱取0.1g澳甲酚綠于小研缽中，加1.4ml0.1mol/L氫氧化鈉研磨，加少許水繼續(xù)研磨，直至完全溶解，用水稀釋至 250ml。0.1%澳酚藍乙醇溶液：稱取0.1g澳酚藍，用乙醇溶解后，加乙醇稀釋至 100ml。番茄汁：將新鮮番茄去皮、去籽，制成勻漿后，用紗布過濾數(shù)次，直至呈淡黃色透明液體，在液面上加幾滴甲苯，冷凍保存。.儀器與設(shè)備實驗室常用設(shè)備電熱恒溫培養(yǎng)箱壓力蒸汽消毒器液體快速混合器離心機722分光光度計硬質(zhì)玻璃試管：20mm<150mm.菌種與培養(yǎng)液的制備與保存儲備菌種白制備：Lactobacillusplantarum(ATCC8014)接種于直面瓊脂培養(yǎng)管中，在37M.5c恒溫箱中培養(yǎng)16~24小時，取出后放入冰箱中保存，每隔兩周至少傳種一次。在實驗前一天必須傳種一次。種子培養(yǎng)液的制備：加2ml泛酸標(biāo)準(zhǔn)工作液和3ml基本培養(yǎng)基于10ml離心管中，塞好棉塞，于121c高壓滅菌10分鐘，取出，冷卻后于冰箱中保存。每次制備兩管，備用。?加入離心管中的泛酸標(biāo)準(zhǔn)液要適量， 過少會影響Lactobacillusplantarum的生長，過多則不宜于洗凈殘余泛酸，因此會使零管中的光密度值增大，影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。一般 2-3ml標(biāo)準(zhǔn)工作液即可。.操作步驟接種液的配制：使用前一天，將已在瓊脂管中生長16-24小時的L.plantarum接種于種子培養(yǎng)液中，在37m5c培養(yǎng)16-24小時，取出后離心10分鐘（3000rpm）,棄取上清液，用已滅菌的生理鹽水淋洗2次，再加入3ml滅菌生理鹽水，混勻后，將此液倒入已滅菌的注射器中，立即使用。樣品制備：稱取適量樣品，放入100ml三角瓶中，力口10mlTris緩沖液，力口蒸儲水30ml,混勻于121c高壓條件下水解15分鐘，取出冷卻至室溫，定容至50ml,過濾。?泛酸在空氣中穩(wěn)定，但對于熱不穩(wěn)定，因此水解時間切勿過長。取1ml樣品液（5.2.1.）,加入0.4ml堿性磷酸酶溶液，0.2ml肝臟提取物溶液，0.1ml碳酸氫鈉溶液，0.4ml蒸儲水，混勻后，37c溫箱中培養(yǎng)過夜。加水至20ml,以澳甲酚綠為外指示劑，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH=4.5,定容至25ml,過濾。取適量水解液（5.2.3）于25ml具塞刻度試管中，以澳麝香草酚藍為外指示劑，用0.1mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)至pH=6.8,用水定容至某刻度。樣品試管的制備：于平行樣品管中分別加入 1.0、2.0、3.0、4.0ml樣品水解液（5.2.4）,加水至5ml,然后再加入5ml基本液體培養(yǎng)基。標(biāo)準(zhǔn)管的制備每組試管中分別加入泛酸標(biāo)準(zhǔn)工作液 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml（相當(dāng)0.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0ng泛酸），加水至5ml,再加入5ml基本液體培養(yǎng)基，需做三組標(biāo)準(zhǔn)曲線。。滅菌：樣品管與標(biāo)準(zhǔn)管均用棉塞塞好，于 121c高壓滅菌10分鐘。?滅菌時間不宜過長， 否則會破壞基本培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分， 影響Lactobacillusplantarum的生長，最好在5-10分鐘內(nèi)。接種與培養(yǎng)：待試管冷至室溫后，每管接種一滴種子液， 于37M.5c恒溫箱中培養(yǎng)16~20小時。?（1）接種前，接種室要在紫外燈下消毒至少 30分鐘。（2）在接種時，其中一支標(biāo)準(zhǔn)系列0管可不接種，這樣可觀察此次實驗是否存在污染， 并且可消除由于管中液體的顏色造成的誤差。測定：722分光光度計，波長640nm條件下，以標(biāo)準(zhǔn)系列0管儀器調(diào)零，測定樣品管及

標(biāo)準(zhǔn)管的吸光度值。?首先以未