無菌、微生物限度檢查及方法驗證整理課件1無菌、微生物限度檢查及方法驗證整理課件1微生物實驗室的質(zhì)量管理一、實驗室設(shè)施與設(shè)備和管理（法規(guī)要求）無菌檢查、微生物限度檢查與抗生素微生物檢定的實驗室，應(yīng)嚴(yán)格分開。無菌檢查、微生物限度檢查實驗室分無菌操作間和緩沖間。無菌操作間應(yīng)具備相應(yīng)的空調(diào)凈化設(shè)施和環(huán)境，采用局部百級措施時，其環(huán)境應(yīng)符合萬級潔凈度要求。進入無菌操作間應(yīng)有人流凈化和物流凈化的設(shè)施。無菌操作間應(yīng)根據(jù)檢驗品種的需要，保持對鄰室的相對正壓或相對負壓，并定期檢測潔凈度。無菌操作間內(nèi)禁放雜物，并應(yīng)制定地面、門窗、墻壁、設(shè)施等的定期清潔、滅菌規(guī)程。無菌檢查在潔凈度100級單向流空氣區(qū)域內(nèi)進行，其全過程應(yīng)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止微生物污染。單向流空氣區(qū)與工作臺面，必須進行潔凈度驗證。微生物限度檢查的全過程，均應(yīng)遵守?zé)o菌操作，嚴(yán)防再污染。整理課件2微生物實驗室的質(zhì)量管理一、實驗室設(shè)施與設(shè)備和管理（法規(guī)要求）微生物實驗室的質(zhì)量管理為滿足微生物學(xué)實驗要求，微生物實驗室應(yīng)具有：嚴(yán)格分開的無菌檢查、微生物限度檢查、無菌采樣室。菌種處理與微生物鑒別室有局部百級措施。各自分開的抗生素微生物檢定、細菌內(nèi)毒素檢查、抗菌作用測定半無菌室。培養(yǎng)室（一般為100，000級）。試液及培養(yǎng)基的配制室。滅菌室。實驗器皿洗滌、烘干室。人員辦公休閑室。實驗用品、易耗品儲藏室。整理課件3微生物實驗室的質(zhì)量管理為滿足微生物學(xué)實驗要求，微生物實驗室應(yīng)微生物實驗室的質(zhì)量管理設(shè)施和設(shè)備的管理特殊標(biāo)準(zhǔn)品——菌種培養(yǎng)基、緩沖液、試劑消毒劑文件管理培訓(xùn)內(nèi)審整理課件4微生物實驗室的質(zhì)量管理設(shè)施和設(shè)備的管理整理課件4微生物實驗室的質(zhì)量管理微生物室實驗室的質(zhì)量管理制定潔凈室（無菌室）的使用管理規(guī)程（SOP）菌種處理相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）生物安全柜的使用標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）帶菌廢棄物的處理標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）環(huán)境消毒標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）環(huán)境清潔、消毒標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）試液及培養(yǎng)基配制的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）實驗器皿洗滌標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）建立無菌室使用登記冊使用日期，時間，使用人，設(shè)備運轉(zhuǎn)狀況，溫、濕度，潔凈度狀況（沉降菌數(shù)、浮游菌數(shù)、塵埃粒子數(shù)），報修原因，報修結(jié)果，清潔工作（臺面、地面、墻面、天花板、傳遞窗、門把手），消毒液名稱等整理課件5微生物實驗室的質(zhì)量管理微生物室實驗室的質(zhì)量管理制定使用日期，微生物實驗室的質(zhì)量管理實驗室使用管理每天工作前用消毒液消毒工作臺，開紫外燈（最少半小時）進行空氣消毒，每月定期做徹底清潔工作，適當(dāng)時用消毒劑進行熏蒸。非必要品禁止帶入實驗室，必要資料和記錄應(yīng)消毒后進入并應(yīng)遠離操作臺。實驗人員進入潔凈室（無菌室）不得化妝、戴手表、戒指等首飾；不得吃東西。應(yīng)嚴(yán)格按更衣程序更衣。記錄溫濕度是否在規(guī)定的范圍內(nèi)，每次實驗時，對操作室和層流臺做微生物沉降菌落計數(shù)并記錄；如發(fā)現(xiàn)問題應(yīng)找原因，及時報修和報告并將報修原因和結(jié)果記錄歸檔。如遇停電，應(yīng)立即停止實驗，重新進入無菌室前，至少開啟機房運轉(zhuǎn)1小時以上。在每次實驗結(jié)束時，應(yīng)用消毒劑及時按消毒規(guī)程中的要求消毒操作臺和潔凈室（區(qū)），并開啟室內(nèi)紫外燈以殺滅存留微生物。使用后的器具如平皿、試管，所有微生物培養(yǎng)物，染菌/帶菌物品等應(yīng)用消毒液浸泡（至少24小時以上），經(jīng)煮沸或滅菌后清洗或丟棄。整理課件6微生物實驗室的質(zhì)量管理實驗室使用管理每天工作前用消毒液消毒工微生物實驗室的質(zhì)量管理潔凈室（無菌室）的使用管理每季度定期進行清潔度再驗證，以確保潔凈度符合規(guī)定，保存原始記錄及趨勢分析資料，定期歸檔保存。至少每年一次定期更換新的紫外燈管并記錄，以確保紫外燈管滅菌持續(xù)有效，定期歸檔保存。至少2年1次，或按潔凈度驗證實際情況，定期更換初效、中效、高效頭。以確保凈化系統(tǒng)的功能持續(xù)有效，并同時在使用登記本上做好更換記錄。定期歸檔保存。平時實驗室內(nèi)應(yīng)盡可能減少人員的走動或活動，通向潔凈室的門要關(guān)閉或安裝自動閉門器使其保持關(guān)閉狀態(tài)。發(fā)現(xiàn)潔凈度不符合規(guī)定時，應(yīng)立即停止使用，尋找原因，徹底清潔、消毒，須經(jīng)清潔度再驗證符合規(guī)定后，才再使用，并將情況記錄在無菌室使用登記冊上，定期歸檔保存。非微生物室檢驗人員不得進入潔凈室（無菌室），對必須進入的外來人員或維修人員應(yīng)進行指導(dǎo)和監(jiān)督。整理課件7微生物實驗室的質(zhì)量管理潔凈室（無菌室）的使用管理每季度定期進微生物實驗室的質(zhì)量管理一、實驗室設(shè)施與設(shè)備和管理設(shè)施—潔凈室、凈化工作臺、生物安全柜。設(shè)備—高壓蒸汽滅菌器、電熱恒溫干烤箱、培養(yǎng)箱、冰箱。實驗儀器—全封閉薄膜過濾裝置、電動勻漿儀、電熱恒溫水浴箱、離心機、顯微鏡，及刻度吸管、試管、三角燒瓶、培養(yǎng)皿等。建立主要設(shè)施、設(shè)備、儀器的明細記錄，內(nèi)容包括名稱、型號、生產(chǎn)廠家、購買日期。質(zhì)量保證檔案：購買發(fā)票、安裝驗收或開箱驗收記錄、調(diào)試記錄、計量檢定或運行校驗合格證、指定專人負責(zé)、制訂標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）、建立使用登記冊，維修、保養(yǎng)記錄、改造或更新記錄、直至報廢記錄。整理課件8微生物實驗室的質(zhì)量管理一、實驗室設(shè)施與設(shè)備和管理設(shè)施—潔凈室微生物實驗室的質(zhì)量管理一、實驗室設(shè)施與設(shè)備和管理定期監(jiān)測生物安全柜和（或）超凈工作臺的內(nèi)表面的微生物學(xué)質(zhì)量及其內(nèi)部的空氣質(zhì)量（粒子和微生物）。使用時檢查壓差指示表。培養(yǎng)箱、冰箱需在設(shè)備的每個腔室內(nèi)放置經(jīng)校準(zhǔn)過的玻璃溫度計，每天檢查設(shè)備腔室內(nèi)的溫度狀況并且在日志上做好相應(yīng)的記錄。定期回顧每個設(shè)備的溫度記錄數(shù)據(jù)，以考察設(shè)備的運行狀態(tài)。定期用中性的清潔劑或消毒劑清洗培養(yǎng)箱（或室）、冷藏箱（或室）、冷凍冰箱及水浴的腔室內(nèi)表面。高壓滅菌柜、電熱恒溫干燥箱等需要驗證和持續(xù)監(jiān)控。儀器的校準(zhǔn)和確認(rèn)。整理課件9微生物實驗室的質(zhì)量管理一、實驗室設(shè)施與設(shè)備和管理定期監(jiān)測生物微生物實驗室的質(zhì)量管理需要確認(rèn)和驗證試驗和持續(xù)的質(zhì)量監(jiān)控的設(shè)備高壓滅菌柜和電熱恒溫干燥去熱原烘箱安裝確認(rèn)（IQ）：要確認(rèn)控制系統(tǒng)及其他儀器儀表的設(shè)計是否得當(dāng)并經(jīng)過校驗。檢查有關(guān)共用介質(zhì)（如蒸氣、水和空氣等）符合滅菌工藝的要求。運行確認(rèn)（OQ）：要求證明空載狀態(tài)下驗證方案中所述腔室內(nèi)所有關(guān)鍵位置的溫度是否均處在規(guī)定范圍內(nèi)。建立熱分布圖譜?？蛰d狀態(tài)下，濕熱滅菌當(dāng)腔室工作溫度不低于121℃時，各點溫度與腔室內(nèi)平均溫度之差不超過±1℃，于熱除熱源，當(dāng)運行溫度不低于250℃時，腔室內(nèi)的溫差應(yīng)不得超過±15℃。性能確認(rèn)（PQ）：要求在滿載條件，溫度探頭插入待滅菌物品的內(nèi)部，同時加入一定濃度的微生物或獨立的生物指示劑。對不同的工藝條件（物品、包裝和裝載方式、滅菌參數(shù)等），分別進行性能確認(rèn)試驗，包括熱穿透試驗和生物指示劑挑戰(zhàn)試驗。包括：高壓滅菌柜、除熱源電熱恒溫干燥箱、自動微生物鑒別系統(tǒng)和計數(shù)系統(tǒng)。整理課件10微生物實驗室的質(zhì)量管理需要確認(rèn)和驗證試驗和持續(xù)的質(zhì)量監(jiān)控的設(shè)微生物實驗室的質(zhì)量管理品種：5~20倍稀釋的碘伏水溶液0.10%新潔爾滅容易1:50的84消毒液75%乙醇溶液3%碘酒溶液5%石碳酸（來蘇兒）消毒溶液2%戊二醛水溶液尼泊金酒精消毒液等應(yīng)定期更換消毒劑品種，按標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)確配制。清潔、消毒劑的管理整理課件11微生物實驗室的質(zhì)量管理品種：5~20倍稀釋的碘伏水溶液清潔、微生物實驗室的質(zhì)量管理一、菌種的保存與管理菌種—特殊的標(biāo)準(zhǔn)品

應(yīng)保持基生長特性和減少污染，是微生物實驗結(jié)果一致性的重要保證。制定菌種保藏管理制度

微生物實驗室應(yīng)制定菌種的保藏管理規(guī)程來規(guī)范菌種的來源、申購、保管、轉(zhuǎn)種傳代、存儲和領(lǐng)用等方面的要求，確保菌種的溯源性和穩(wěn)定性；防止試驗用菌種因多次傳代而失去典型生物學(xué)特征發(fā)生變異或死亡，保證菌種長期正確、穩(wěn)定，從而確保實驗的靈敏度和重現(xiàn)性。菌種名稱：金黃色葡萄球菌菌種系列號：[CMCC(B)26003]傳代次數(shù)：第

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代有效期：年月日制備日期：年月日傳代人：王熙鳳整理課件12微生物實驗室的質(zhì)量管理一、菌種的保存與管理菌種—特殊的標(biāo)準(zhǔn)品微生物實驗室的質(zhì)量管理菌種保存應(yīng)有專人負責(zé)，加鎖保存于冰箱中。實驗室的標(biāo)準(zhǔn)菌株應(yīng)來自CMCC（中國藥品生物制品檢定所醫(yī)學(xué)菌種保藏中心或ATCC（美國菌種保藏中心）等國際法定菌種保藏機構(gòu)。有接收、確認(rèn)記錄。菌種的轉(zhuǎn)種等均應(yīng)在超凈工作臺進行，以防污染。各種菌種應(yīng)按規(guī)定時間接種，所有保藏的菌種均應(yīng)貼有相應(yīng)的標(biāo)簽，有菌種清單。整理課件13微生物實驗室的質(zhì)量管理菌種保存應(yīng)有專人負責(zé)，加鎖保存于冰箱中驗證實驗常用菌種枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]生孢梭菌[CMCC（B）64941]銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]大腸埃希菌[CMCC（B）44102]乙型副傷寒沙門菌[CMCC（B）50094]白色念珠菌[CMCC（B）98001]黑曲霉[CMCC（B）9003]整理課件14驗證實驗常用菌種枯草芽孢桿菌菌種保藏步驟干燥菌種復(fù)蘇，劃平板挑選特征典型的純菌菌落；（制菌懸液使用）確定保藏的合格菌體形態(tài)；選擇最適宜的保存方法，定期對保藏菌種進行檢查，觀察是否發(fā)生變化，若有變化，須改變保藏方法。保藏期滿應(yīng)及時進行移種。整理課件15菌種保藏步驟干燥菌種復(fù)蘇，劃平板整理課件15菌種的接收標(biāo)準(zhǔn)菌種一般是玻璃安平裝的凍干粉劑接收時應(yīng)檢查名稱/數(shù)量和完整性。貼好標(biāo)簽后儲存于-20℃一般安平凍干品可在5年之內(nèi)使用使用時應(yīng)按（菌種保藏中心提供的）相關(guān)資料的要求進行復(fù)溶、培養(yǎng)和保存。整理課件16菌種的接收標(biāo)準(zhǔn)菌種一般是玻璃安平裝的凍干粉劑整理課件16菌種的復(fù)活菌種的復(fù)活用70%的酒精擦拭清潔安瓿，自然風(fēng)干用一小砂輪在安瓿的上部劃一條線，用手輕輕將安瓿開無菌操作，用一無菌吸管無菌移取1~2ml適宜的液體培養(yǎng)基到瓿中；輕輕地旋轉(zhuǎn)安瓿以使凍干菌種和液體培養(yǎng)基充分混合并完全溶解；用無菌吸管將安瓶內(nèi)菌液轉(zhuǎn)移到相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，根據(jù)不同菌種類型而將其培養(yǎng)于相宜的溫度下24-72小時。菌種的確認(rèn)菌種復(fù)活后，應(yīng)確認(rèn)菌種的純度與特性從培養(yǎng)肉湯中取細菌培養(yǎng)物接種到平板上，上劃線分離出單個菌落。培養(yǎng)后觀察其是否具有典型的菌落形態(tài)然后挑取單一的純菌落，進行革蘭染色、鏡檢，觀察其染色特性及菌形。最后再做生化實驗以進一步鑒定該菌種，或用API鑒定系統(tǒng)做鑒定工作。對已經(jīng)過鑒定確認(rèn)的菌種就可以進行菌種的傳代和保藏了。整理課件17菌種的復(fù)活菌種的復(fù)活用70%的酒精擦拭清潔安瓿，自然風(fēng)干菌種菌種的傳代和保藏菌種的保藏方法使菌種的代謝處于最不活躍或相對靜止的狀態(tài)，從而在一定時間內(nèi)不發(fā)生變異并保持生命活力。一般來說，低溫、干燥和隔絕空氣是使微生物代謝能力降低的三個重要因素?zé)o論使用那種菌種保藏方法，都應(yīng)進行驗證，以確保在相應(yīng)保存條件下的菌種不會變異并且性能穩(wěn)定。菌種的傳代次數(shù)（自原始菌種凍干粉起）不得超過5代（GMP，藥典）將微生物接種至一新鮮培養(yǎng)基上/內(nèi)，每萌發(fā)一次即稱為“一代”。整理課件18菌種的傳代和保藏菌種的保藏方法使菌種的代謝處于最不活躍或相對冷凍真空干燥保藏法主要是將待保藏菌種混于有保護作用介質(zhì)內(nèi)制成菌液，分裝在安瓿中于冷凍條件下使其快速凍結(jié)，因凍結(jié)可使晶型細致，不致?lián)p傷活菌細胞。然后用真空抽氣減壓，是安瓿內(nèi)的冰晶液體升華，水氣迅速被真空抽走，冰晶型的菌液很快變成疏松的干燥固體物，最后在真空狀態(tài)下熔封管口，使干燥物在局部真空條件下封存，并置冷暗處，在很長時間內(nèi)菌種仍可維持活力不變。整理課件19冷凍真空干燥保藏法主要是將待保藏菌種混于有保甘油冷凍管保藏法將待保藏菌接種至平板或瓊脂斜面，培養(yǎng)用無菌接種環(huán)輕輕刮取菌臺，用接種環(huán)使細菌充分?jǐn)U散到預(yù)先裝于試管中的無菌蒸餾水中調(diào)整菌液濃度，使其等同于麥?zhǔn)媳葷峁艿?0號管向已制備好的菌懸液中加入等體積、濃度為20%的無菌甘油，得到10%甘油菌懸液。輕輕振搖小管，使內(nèi)容物充分混合，分裝于無菌小試管。制好的甘油冷凍管最好在-30℃條件下貯存。有效期至少為2年。氧細菌和酵母菌可用此法保藏，霉菌和厭氧菌則不適于用此法保藏。整理課件20甘油冷凍管保藏法將待保藏菌接種至平板或瓊脂斜面，培養(yǎng)整理課件液體石蠟覆蓋保藏法將菌種穿刺接種于半固體高層培養(yǎng)基中培養(yǎng)，無菌操作在層流臺下用無菌吸管吸取無菌液體石蠟至培養(yǎng)好的菌種管內(nèi)，并使石蠟高出菌種表面約1cm，將試管直立，置于2~8℃冰箱中或室溫下保存，如銅綠假單胞菌。此法保藏霉菌、放線菌、芽胞桿菌可保藏兩年以上，酵母菌可保藏1~2年，一般無芽胞細菌也可保藏1年左右。此法制備簡單，不需要其他特殊設(shè)備，并且效果好，是傳代培養(yǎng)的變相方法，可適當(dāng)延長保藏時間。整理課件21液體石蠟覆蓋保藏法將菌種穿刺接種于半固體高層培養(yǎng)基中培養(yǎng)，整瓊脂斜面低溫保藏法保藏法（廠家常用）將菌種接種在適宜的固體斜面培養(yǎng)基上，生長充分后，移至2~8℃冰箱中保藏。保藏時間：霉菌、放線菌及芽胞的菌保存2~4個月，移種一次；酵母菌2個月移種一次；細菌最好每1月移種一次。優(yōu)點：操作簡單，使用方便，不需特殊設(shè)備，對大多數(shù)微生物都適用。缺點：保藏期太短；傳代次數(shù)多，易發(fā)生變異及污染。此法為實驗室工作用菌種的最常用的保藏方法，僅能用于工作用菌種的短期保藏。整理課件22瓊脂斜面低溫保藏法保藏法（廠家常用）將菌種接種在適宜的固體斜保藏芽胞液對產(chǎn)芽胞的微生物宜制成芽胞菌懸液后再保藏，無菌操作，取1ml孢子液接入茄形瓶或培養(yǎng)皿內(nèi)，輕輕轉(zhuǎn)動使菌液均勻分布于培養(yǎng)基表面。將培養(yǎng)皿在適當(dāng)?shù)臏囟认屡囵B(yǎng)。一般需要7天或更長時間在層流臺下，取3~5ml氯化鈉磷酸鹽緩沖液（pH7.0）加入培養(yǎng)皿內(nèi)用無菌玻璃L棒輕輕刮下菌苔，注意不要劃破培養(yǎng)基。用無菌注射器或無菌吸管吸取菌懸液，收集于試管中。將收集的芽胞液放在80~90℃水浴中加熱15分鐘，冷卻。做好標(biāo)記，放至2~8℃冰箱中保藏。原始芽胞液可保存1年。每次使用前用平皿法重新標(biāo)定其濃度。整理課件23保藏芽胞液對產(chǎn)芽胞的微生物宜制成芽胞菌懸液后再保藏，整理課件微生物菌種的傳代保藏過程按菌種說明書要求復(fù)溶菌粉菌（標(biāo)準(zhǔn)菌株），轉(zhuǎn)種于適當(dāng)?shù)脑鼍囵B(yǎng)基內(nèi)（此為第一代G1），復(fù)壯后轉(zhuǎn)接至平板上，并于適當(dāng)溫度下培養(yǎng)適當(dāng)時間，分離出單個純種菌落（此為第二代G2）菌種鑒定完成后，挑取純菌落制成濃菌懸液用于制備甘油冷凍管，冷凍或低溫保存（標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株G2）；同時挑取純菌落轉(zhuǎn)接斜面菌種作為工作用菌種（工作菌株W3），于適當(dāng)溫度下培養(yǎng)適當(dāng)時間后可用于試驗，直至轉(zhuǎn)為W5為止，需重新開啟安瓶，再重復(fù)上述操作程序。菌種被分為兩類，傳代用菌種和工作用菌種，傳代用菌種（標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株）用甘油冷凍管法保藏工作用菌種（工作菌株）用斜面低溫保藏法保藏整理課件24微生物菌種的傳代保藏過程按菌種說明書要求復(fù)溶菌粉菌（標(biāo)準(zhǔn)菌株試驗用菌液的制備傳代：取菌液0.1ml接種至10ml液體培養(yǎng)基，按規(guī)定培養(yǎng)、稀釋對照用菌種在使用過程中，亦應(yīng)檢查其生物學(xué)特性。如菌落形態(tài)（在可能情況下，用選擇性培養(yǎng)基進行生長檢查）、革蘭染色、鏡檢菌體形態(tài)、主要生化特性（必要時應(yīng)作菌種鑒定實驗）。如發(fā)現(xiàn)染菌或或變異，衰退等現(xiàn)象時，應(yīng)及時處理。為保證試驗的可靠性和準(zhǔn)確性，實驗室還應(yīng)嚴(yán)格按照相關(guān)規(guī)程制備和使用菌種，并對每種微生物的存貯條件（需/厭氧狀態(tài)、溫度和時間）進行確認(rèn)。室溫下菌懸液應(yīng)在制備后的2小時內(nèi)使用低溫保存（2-8℃）時細菌和酵母菌的菌懸液應(yīng)在制備后的24小時內(nèi)使用霉菌孢子液則應(yīng)在制備后的7天內(nèi)使用（黑曲霉孢子懸液可保存在2~8℃，在驗證過的貯存期內(nèi)使用）在使用時（在24小時之內(nèi)）均應(yīng)同時進行菌數(shù)復(fù)核檢查。試驗時可采用分光光度法或麥?zhǔn)媳葷岱ü烙嬀簼舛?。整理課件25試驗用菌液的制備傳代：取菌液0.1ml接種至10ml液體培養(yǎng)菌種的制備、保藏和使用記錄1、菌種名稱_______菌種系列號_________菌種來源________實驗室編號_______傳代代數(shù)________2、菌種制備：培養(yǎng)基_______批號_______接種日期_______接種容器_______數(shù)量_______培養(yǎng)條件_______溫度_______時間_______純化分離鑒定結(jié)果_______操作人_______日期_______3、菌種保藏方法_______保藏數(shù)量_______保藏用培養(yǎng)基_______批號_______培養(yǎng)條件溫度______時間______有效期______操作人______日期__________4、菌種使用記錄序號支取日期數(shù)量操作人用途處理當(dāng)菌種超過有效期或被污染以后應(yīng)滅菌后丟棄?！跏恰醴裾f明：實驗室菌種編號原則：名稱+傳代代數(shù)+制備日期整理課件26菌種的制備、保藏和使用記錄1、菌種名稱_______菌種系列培養(yǎng)基管理一般采用購自中國藥品生物制品檢定所合格的商品脫水培養(yǎng)基。同時按照使用說明書進行配制，需注意培養(yǎng)基的pH值應(yīng)符合規(guī)定，否則必須校正后，按說明書規(guī)定滅菌。商品脫水培養(yǎng)基應(yīng)在有效期內(nèi)使用，使用前應(yīng)注意核對名稱，檢查外觀，遇有結(jié)塊、吸潮現(xiàn)象，應(yīng)廢棄。新鮮培養(yǎng)基的配制，應(yīng)按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的配方進行，對培養(yǎng)基的原材料要進行挑選，試劑應(yīng)為化學(xué)純試劑規(guī)格。制成的培養(yǎng)基要求無沉淀。必要時以適當(dāng)方法過濾，調(diào)整pH值，分裝滅菌備用。滅菌：應(yīng)經(jīng)驗證合格的滅菌程序（一定裝載方式下滅菌方法和條件）。驗證：無菌性試驗，促生長試驗，滅菌器蒸汽循環(huán)系統(tǒng)。整理課件27培養(yǎng)基管理一般采用購自中國藥品生物制品檢定所合格的商品脫水培培養(yǎng)基的質(zhì)量控制建立質(zhì)量控制程序所有配好的培養(yǎng)基均需進行質(zhì)量控制（pH、適用性檢查試驗）培養(yǎng)基有效期的確定：定期的穩(wěn)定性檢查以確定有效期（2~25℃，避光，非密閉容器3周內(nèi)使用，密閉容器1年內(nèi)使用。質(zhì)量控制的頻率：用同1批脫水培養(yǎng)基，采用經(jīng)驗證的配制和滅菌方法制備的培養(yǎng)基，可只做1次靈敏度檢驗。質(zhì)量控制菌株的選擇（營養(yǎng)、靈敏、代表性）對無菌培養(yǎng)基的無菌性、靈敏度檢查與對照培養(yǎng)基進行比較無菌檢查用需氣厭氣培養(yǎng)基的指示劑氧化層不得超過培養(yǎng)基深度的1/5，否則須經(jīng)水浴煮沸10分鐘，但只限加熱一次。無菌檢查結(jié)束時，指示劑氧化層應(yīng)不超過培養(yǎng)基深度的1/2。大腸埃希菌檢查用MUG培養(yǎng)基配制前應(yīng)挑選無熒光的試管進行配制，觀察結(jié)果時應(yīng)用同批培養(yǎng)基配制的空白管和陽性菌管同時觀察。整理課件28培養(yǎng)基的質(zhì)量控制建立質(zhì)量控制程序整理課件28培養(yǎng)基的靈敏度檢查：已知菌生長試驗①細菌組：取每管裝量為12ml硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基9支，分別接種小于100cfu試驗菌各2支；菌種：金黃色葡萄球菌銅綠假單胞菌枯草芽孢桿菌生孢梭菌空白對照：另一支不接種，培養(yǎng)24~72小時逐日觀察結(jié)果②霉菌組：取每管裝量為9ml的改良馬丁液體培養(yǎng)基5支，分別接種小于100cfu試驗菌各2支；菌種：白色念珠菌黑曲霉空白對照：另一支不接種，培養(yǎng)5天逐日觀察結(jié)果結(jié)果判定空白管培養(yǎng)基無菌生長加菌的培養(yǎng)基管均生長良好判靈敏度檢查合格。整理課件29培養(yǎng)基的靈敏度檢查：已知菌生長試驗①細菌組：菌種：空培養(yǎng)基管理配制好的培養(yǎng)基，按無菌要求進行滅菌。培養(yǎng)基的配制須有記錄，記錄內(nèi)容含有：配制日期和配制人員的標(biāo)識；培養(yǎng)基/溶液的類型、體積；成分、每個成分物質(zhì)的含量、制造商、批號；pH（最初和最終）值無菌措施，包括實施的方式、時間和溫度。按日期編制滅菌后的培養(yǎng)基編號將制備完畢的培養(yǎng)基按品種放置在陰涼的指定位置，備用。注意保存期整理課件30培養(yǎng)基管理配制好的培養(yǎng)基，按無菌要求進行滅菌。配制日期和配制滅菌法濕熱高壓蒸汽滅菌法：依115℃、121℃或132℃，應(yīng)用于培養(yǎng)基滅菌、試驗器械、工作服、橡膠物品和實驗室廢棄物，也可用于玻璃器皿的滅菌。一般121℃30min干熱法：利用物理學(xué)，171℃-1小時，160℃-2小時、121℃-3小時：玻璃器皿濕熱：蛋白質(zhì)容易凝固干熱：氧化整理課件31滅菌法濕熱高壓蒸汽滅菌法：依115℃、121℃或132℃檢驗方法學(xué)驗證：在化學(xué)測試中，藥品的測定方法需要驗證，與此相應(yīng)，當(dāng)建立藥品的無菌、微生物限度檢查法時，也應(yīng)進行分析方法的驗證，以證明所采用的方法適合于該產(chǎn)品的無菌、微生物限度檢查。證明采用藥典的某種方法和檢驗條件，在該供試品的檢驗量、檢驗條件下，無抑菌活性或活性已消失，保證檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。整理課件32檢驗方法學(xué)驗證：在化學(xué)測試中，藥品的測定方法需要驗證，與此相檢驗方法學(xué)驗證：驗證時機；建立檢驗方法時；修訂檢驗方法時；組分和檢驗條件發(fā)生變更時；定期再驗證。整理課件33檢驗方法學(xué)驗證：驗證時機；整理課件33人員人是無菌藥品生產(chǎn)中的主要污染源，在管理比較到位。生產(chǎn)設(shè)備自動化程度較好，操作人員素質(zhì)較高的企業(yè)，人員操作所致的污染率超過70%。具微生物專業(yè)知識經(jīng)無菌技術(shù)培訓(xùn)對實驗結(jié)果能進行充分全面的評價。整理課件34人員人是無菌藥品生產(chǎn)中的主要污染源，在管理比較到位。生產(chǎn)設(shè)備其它重要影響因素藥品本身的抑菌性；培養(yǎng)基的促菌生長能力；培養(yǎng)條件（溫度、濕度及需氧或厭氧）；過濾系統(tǒng)的材質(zhì)整理課件35其它重要影響因素藥品本身的抑菌性；整理課件35檢驗的進展強調(diào)檢驗的過程控制，提高檢出率，保證檢驗結(jié)果的可靠性。人員的要求環(huán)境、設(shè)施要求培養(yǎng)基適用性檢驗數(shù)量方法驗證培養(yǎng)時間試驗用菌全封閉過濾培養(yǎng)器、隔離系統(tǒng)整理課件36檢驗的進展強調(diào)檢驗的過程控制，提高檢出率，保證檢驗結(jié)果的可靠檢驗結(jié)果的保證要求有一個取樣計劃來涵蓋整個批號有足夠的取樣量和檢驗量選擇適用的培養(yǎng)基采用經(jīng)驗證的無菌檢驗方法良好的環(huán)境監(jiān)控人員保證整理課件37檢驗結(jié)果的保證要求有一個取樣計劃來涵蓋整個批號整理課件37無菌檢查整理課件38無菌檢查整理課件38無菌檢查定義：無菌原料藥是指法定藥品標(biāo)準(zhǔn)中列有無菌檢查項目的制劑和原料藥，包括無菌制劑和無菌原料藥。無菌檢查是檢查要求無菌的藥品、醫(yī)療器具、原料、輔料以及要求無菌的其他物品是否染有活菌的一種方法。符合無菌檢查法的規(guī)定僅表明了供試品在該檢驗條件下未發(fā)現(xiàn)細菌和真菌污染。無菌檢查法建立在批產(chǎn)品受微生物污染是均勻的假設(shè)上（其實非均勻）。無菌檢出低污染的概率極低的。因此，無菌檢查存在風(fēng)險和局限性。整理課件39無菌檢查定義：無菌原料藥是指法定藥品標(biāo)準(zhǔn)中列有無菌檢查項目的無菌檢查的局限性無法對整批產(chǎn)品進行100%檢驗只進行細菌和真菌的檢驗培養(yǎng)基培養(yǎng)條件（如溫度和時間）是有限的我們的工作環(huán)境及操作是在相對無菌的狀態(tài)。整理課件40無菌檢查的局限性無法對整批產(chǎn)品進行100%檢驗整理課件40無菌檢查：注射劑、植入劑、部分外用藥鼻用制劑：用于手術(shù)或創(chuàng)傷的鼻用制劑。凝膠劑：用于嚴(yán)重創(chuàng)傷的凝膠劑。乳膏劑：用于燒傷或嚴(yán)重創(chuàng)傷的乳膏劑。新增的無菌檢查中藥制劑散劑：用于燒傷或嚴(yán)重創(chuàng)傷的外用散劑。鼻用制劑：用于嚴(yán)重創(chuàng)傷的鼻用制劑。眼用制劑：用于傷口的眼用制劑。軟膏劑：用于燒傷或嚴(yán)重創(chuàng)傷的乳膏劑。氣霧劑、噴霧劑：用于燒傷或嚴(yán)重創(chuàng)傷的氣霧劑、噴霧劑。整理課件41無菌檢查：注射劑、植入劑、部分外用藥鼻用制劑：用于手術(shù)或創(chuàng)傷GMP—取樣取樣注意事項，包括為降低取樣過程產(chǎn)生的各種風(fēng)險所采取的預(yù)防措施，尤其是無菌或有害物料的取樣以及防止取樣過程中污染和交叉污染的注意事項；在生產(chǎn)的每一階段，應(yīng)當(dāng)保護產(chǎn)品和物料免受微生物和其他污染。附錄1無菌藥品質(zhì)量控制第八十條無菌檢查的取樣計劃應(yīng)當(dāng)根據(jù)風(fēng)險評估結(jié)果制定，樣品應(yīng)當(dāng)包括微生物污染風(fēng)險最大的產(chǎn)品。無菌檢查樣品的取樣至少應(yīng)當(dāng)符合以下要求：（一）無菌灌裝產(chǎn)品的樣品必須包括最初、最終灌裝的產(chǎn)品以及灌裝過程中發(fā)生較大偏差后的產(chǎn)品；（二）最終滅菌產(chǎn)品應(yīng)當(dāng)從可能的滅菌冷點處取樣；（三）同一批產(chǎn)品經(jīng)多個滅菌設(shè)備或同一滅菌設(shè)備分次滅菌的，樣品應(yīng)當(dāng)從各個/次滅菌設(shè)備中抽取。一般隨機抽樣，保證樣品的代表性和原始性，復(fù)試樣品應(yīng)盡量重現(xiàn)原取樣。整理課件42GMP—取樣取樣注意事項，包括為降低取樣過程產(chǎn)生的各種風(fēng)險所注意事項只要供試品的性狀允許，應(yīng)采用薄膜過濾法（首選）只要供試品的性狀允許（溶解性、抑菌性），應(yīng)將所有容器內(nèi)的全部內(nèi)容物過濾驗證用供試品用最大量陽性對照分開培養(yǎng)大腸埃希菌代替銅綠假單胞菌（G+敏感，保證結(jié)果有效）無菌檢測14天（補償生長條件、潛在的低生長者、修復(fù)受損細胞）優(yōu)先選用密閉式過濾器，或一次性過濾器濾膜材質(zhì)（抗用低吸附），濾膜的完整性，沖洗量。直接法接種供試品體積不得大于培養(yǎng)基體積的10%，每管裝量硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基不少于15ml，改良馬丁培養(yǎng)基不少于10ml，可用濃縮培養(yǎng)基，或增加培養(yǎng)容器數(shù)。整理課件43注意事項只要供試品的性狀允許，應(yīng)采用薄膜過濾法（首選）整理課結(jié)果判斷陽性管生長良好，陰性管不得長菌，否則試驗無效。以一次檢出為準(zhǔn)，不得復(fù)試。（低檢出率，實驗環(huán)境、條件改善當(dāng)符合下列至少一個條件時，方可判試驗結(jié)果無效；無菌檢查試驗所用的設(shè)備及環(huán)境的微生物監(jiān)控結(jié)果不符合無菌檢查法的要求?；仡櫉o菌試驗過程中，發(fā)現(xiàn)有可能引起微生物污染的因素。陰性對照管有菌生長。供試品管中生長的微生物經(jīng)鑒定后，確認(rèn)是因無菌試驗中所使用的物品和（或）無菌操作技術(shù)不當(dāng)引起的。整理課件44結(jié)果判斷陽性管生長良好，陰性管不得長菌，否則試驗無效。無菌檢結(jié)果保證有效的結(jié)果可靠的結(jié)論培養(yǎng)基保證結(jié)果判斷SOP操作人整理課件45結(jié)果保證有效的結(jié)果可靠的結(jié)論培養(yǎng)基保證結(jié)果判斷SOP操作人整方法驗證的一般程序與環(huán)節(jié)需前處理不需前處理有抑菌作用樣品無抑菌作用去除抑菌作用檢查①驗證前處理方法對污染菌生長、檢出的影響。②可以通過驗證實驗判斷③驗證抑菌活性去除的有效性，以及去除方法對污染菌生長、檢出的影響。整理課件46方法驗證的一般程序與環(huán)節(jié)需前處理不需前處理有抑菌作用樣品無抑無菌檢查驗證實驗：供試品直接接種法薄膜過濾法100ml/筒①試驗組（供試品+菌）金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸、枯草桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉②培養(yǎng)基對照組③陽性菌對照組（加菌同試驗組）規(guī)定T培養(yǎng)3~5天觀察結(jié)果書寫驗證報告④稀釋劑對照組整理課件47無菌檢查驗證實驗：供試品直接接種法薄膜過濾法①試驗組（供試品微生物限度檢查整理課件48微生物限度檢查整理課件48微生物限度檢查：口服、外用控制項目雜菌數(shù)：細菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)?？刂凭ㄖ虏【捍竽c埃希菌、大腸菌群、沙門菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、梭菌、白色念珠菌。制定原則：非無菌藥品的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)是基于藥品的給藥途徑及對患者潛在的危害而制定的。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)檢查控制菌整理課件49微生物限度檢查：口服、外用控制項目雜菌數(shù)：細菌數(shù)、霉菌和酵母不含藥材原粉的制劑含藥材原粉的制劑：丸劑含動物藥的制劑外用制劑滴眼劑一般局部用藥直腸給藥制劑尿道、陰道給藥制劑滴鼻劑不同制劑的限度整理課件50不含藥材原粉的制劑滴眼劑不同制劑的限度整理課件50注意事項采用稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性供試液從制備到加入檢驗用培養(yǎng)基不得超過1小時供試液制備若需用水浴加溫時，溫度不應(yīng)超過45℃供試品須符合微生物限度標(biāo)準(zhǔn)和菌數(shù)報告規(guī)則，應(yīng)采用使微生物生長的更高稀釋級進行驗證。（10-3，1000）無合適方法消除抑菌性的檢驗方法，選擇回收率更接近要求的方法和條件應(yīng)對生產(chǎn)工藝和產(chǎn)品特性進行風(fēng)險評估，保證檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和產(chǎn)品質(zhì)量。報告規(guī)則（平均數(shù)，300cfu）培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間變化檢驗量（中藥膜劑，沙門菌）樣品稀釋級的選擇（驗證）離心法500轉(zhuǎn)/分，3分鐘（中藥混懸劑重新驗證，只適用細菌）控制菌-培養(yǎng)基的適用性（促生長能力、指標(biāo)能力和抑制能力）—參照培養(yǎng)基（比較菌落形態(tài)、大小、指標(biāo)劑反應(yīng)、生長速度）—最長（抑）、最短（生）培養(yǎng)時間。疑似菌確認(rèn)，選擇認(rèn)可的菌種鑒定方法，陽性對照試驗至少進行到分離的步驟。整理課件51注意事項采用稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過濾法、中和法等方法微生物限度檢查法驗證細菌、霉菌及酵母菌數(shù)計數(shù)方法驗證定量——回收率測定實驗控制菌檢查方法驗證定性——能否生長、專屬性實驗整理課件52微生物限度檢查法驗證細菌、霉菌及酵母菌數(shù)計數(shù)方法驗證定量——回收率計算試驗組的菌回收率=[（試驗組平均菌落數(shù)-供試品組平均菌落數(shù)）/菌液組平均菌落數(shù)]﹡100%稀釋級對照組的菌回收率=[（稀釋劑對照組的平均菌落數(shù)/菌液組的平均菌落數(shù)）]﹡100%在3次獨立的平行試驗中，稀釋劑對照組、試驗組的回收率均不低于70%，若任一次試驗中回收率低于70@，應(yīng)重新選擇方法再驗證。整理課件53回收率計算試驗組的菌回收率=[（試驗組平均菌落數(shù)-供試品組平方法驗證：控制菌控制菌：大腸埃希菌，銅綠假單胞菌、沙門菌、大腸菌群、生孢梭菌計數(shù)方法：平皿法、薄膜過濾法。特殊：生孢梭菌（加菌量：10~100cfu，只要求生長不要求回收率制定原則：非無菌藥品的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)是基于藥品的給藥途徑及對患者潛在的危害而制定的。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)檢查控制菌整理課件54方法驗證：控制菌控制菌：大腸埃希菌，銅綠假單胞菌、沙門菌、大原料藥/賦形劑量微生物檢查微生物能否在原料或賦形劑中生長或存活？提供支持?jǐn)?shù)據(jù)，不必做微生物限度檢查和制定認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)原料或賦形劑是否無菌？不需進一步做微生物限度檢查法或制定認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)原料/賦形劑合成/工藝相關(guān)步驟本身是否會減少微生物按照協(xié)議后藥典各論制訂微生物限度認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)按照協(xié)議后藥典各論制訂微生物限度認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)逐批檢查微生物限度和指示菌抽批檢驗微生物限度和指示菌是否有科學(xué)證明減少步驟會造成原料/輔料中微生物量認(rèn)可限度（未檢出覺指示菌）？提供支持?jǐn)?shù)據(jù)，不必做微生物限度檢查和制訂認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)所監(jiān)控的微生物量/指示菌量是否都低于規(guī)定限度？是否是是是否是是整理課件55原料藥/賦形劑量微生物檢查微生物能否在原料或賦形劑中生長或存非無菌制劑的微生物檢查制劑中是否含防腐劑或本身是否有抗微生物能力？制訂防腐劑認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)和認(rèn)證在低于或等于指定的最小防腐劑濃度時是否有效，并證明制劑本身的抗微生物能力逐批進行微生物限度實驗按照協(xié)議后藥典各論制訂微生物限度認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)不必做微生物限度檢查和制訂認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)是否每批都符合微生物限度標(biāo)準(zhǔn)？提供支持?jǐn)?shù)據(jù)，不必做微生物限度檢查和制訂認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)是否是否是制劑是否為固體劑型？是否有科學(xué)證據(jù)證明制劑有抑制微生物生長的特性？否否是整理課件56非無菌制劑的微生物檢查制劑中是否含防腐劑或本身是否有抗微生物保證藥品微生物檢驗結(jié)果可靠的有效途徑藥品微生物實驗環(huán)境微生物的監(jiān)測環(huán)境微生物的監(jiān)測環(huán)境細菌與藥品細菌的比較結(jié)論整理課件57保證藥品微生物檢驗結(jié)果可靠的有效途徑藥品微生物實驗環(huán)境微生物2010版藥典無菌檢查法的主要增修訂情況整理課件582010版藥典無菌檢查法的主要增修訂情況整理課件58前言部分1、新增規(guī)定：“防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出?！?、新增規(guī)定：“日常檢驗還需要對環(huán)境進行監(jiān)控?！?、新增規(guī)定：“無菌檢查人員必須具備微生物專業(yè)知識，并經(jīng)過無菌技術(shù)的培訓(xùn)?！闭碚n件59前言部分1、新增規(guī)定：“防止污染的措施不得影響供試品中微生物培養(yǎng)基靈敏度檢查部分新增加稀釋后的工作用菌液的保存條件和保存期限：“菌液制備后若在室溫下放置，應(yīng)在2小時內(nèi)使用，若保存在2~8℃，可在24小時內(nèi)使用。稀釋液、沖洗液及其制備方法部分在原有1、0.1%蛋白胨水溶液2、pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液的基礎(chǔ)上新增加：“可根據(jù)供試品的特性，選用其他經(jīng)驗證的適宜的溶液作為稀釋液、沖洗液?！闭碚n件60培養(yǎng)基靈敏度檢查部分新增加稀釋后的工作用菌液的保存條件和保存方法驗證試驗部分驗證試驗用菌種及菌液制備在培養(yǎng)基靈敏度所用菌種的基礎(chǔ)上，刪除了銅綠假單胞菌，增訂了大腸埃希菌?！且蛟隍炞C試驗的實踐中，發(fā)現(xiàn)作為革蘭氏陰性桿菌代表的銅綠假單胞菌在驗證試驗中對大部分抗生素不敏感，而大腸埃希菌對抗革蘭氏陰性桿菌為主的抗生素敏感性較好。（頭孢類檢驗方法重新驗證）整理課件61方法驗證試驗部分驗證試驗用菌種及菌液制備在培養(yǎng)基靈敏度所用菌供試品的無菌檢查部分薄膜過濾法：1、新增規(guī)定：“抗生素供試品應(yīng)選擇低吸附的濾器及濾膜2、新增規(guī)定：“對每片濾膜的總沖洗量不得過1000ml3、新增規(guī)定：“所用沖洗量、沖洗方法同驗證試驗直接接種法刪除原直接接種法中β-內(nèi)酰胺類或磺胺類供試品項?！蛟搩深惞┰嚻返臒o菌檢查以采用薄膜過濾法加中和劑更好。整理課件62供試品的無菌檢查部分薄膜過濾法：直接接種法刪除原直接接種法中供試品的無菌檢查部分培養(yǎng)及觀察：對于培養(yǎng)14天后，不能從外觀上判定有無微生物生長時，刪除了：“或劃線接種于斜面培養(yǎng)基上”的規(guī)定。同時刪除了可根據(jù)斜面是否有菌生長而判斷的規(guī)定。整理課件63供試品的無菌檢查部分培養(yǎng)及觀察：整理課件632010版《中國藥典》微生物限度檢查法及應(yīng)用指導(dǎo)原則整理課件642010版《中國藥典》微生物限度檢查法及應(yīng)用指導(dǎo)原則整理課件表1常見干擾物的中和劑或滅活方法干擾物可選用的中和劑或滅活方法戊二醛亞硫酸氫鈉酚類、乙醇、吸附物稀釋法醛類稀釋法、甘氨酸、硫代硫酸鹽季銨類化合物（QACs）卵磷脂、聚山梨酯對羥基苯甲酸酯汞類制劑亞硫酸氫鈉、巰基乙酸鹽、硫代硫酸鹽雙胍類化合物卵磷脂碘酒、洗必泰類聚山梨酯鹵化物硫代硫酸鹽乙二胺四乙酸（EDTA）鎂或鈣離子磺胺類對氨基苯甲酸β-內(nèi)酰胺類抗生素β-內(nèi)酰胺酶整理課件65表1常見干擾物的中和劑或滅活方法干擾物可選用的中和劑或滅增、修訂內(nèi)容控制菌培養(yǎng)溫度35~37℃30~35℃菌落培養(yǎng)和計數(shù)時間：

細菌：由48小時2天

霉菌、酵母菌：由72小時5天延長培養(yǎng)時間：由5~7天7天離心沉淀法取消，改為500轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，取全部上清混合。只用于細菌檢查。（重新驗證，中藥混懸劑）增加貼（膏）劑供試品供試液制備眼用制劑：無菌凝膠膏劑、貼劑：微生物限度橡膠膏劑：金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌膏藥：未要求整理課件66增、修訂內(nèi)容控制菌培養(yǎng)溫度35~37℃增加“培養(yǎng)基的適用性檢查”

促生長、指示和抑制特性能力控制菌檢查中增加了白色念珠菌檢查增加了有關(guān)濾膜直徑的規(guī)定：

薄膜過濾法，濾膜孔徑應(yīng)不大于0.45μm，直徑約一般為50mm，若采用其他直徑的濾膜，沖洗量應(yīng)進行相應(yīng)的調(diào)整。增加了薄膜過濾法每張濾膜沖洗量的規(guī)定：

每張濾膜每次沖洗量不超過100ml，總沖洗量不得超過1000ml結(jié)果報告刪除控制菌驗證中的陰性對照增加無適宜方法消除抑制菌時的檢驗整理課件67增加“培養(yǎng)基的適用性檢查”促生長、指示和抑制特?zé)o菌、微生物限度檢查及方法驗證整理課件68無菌、微生物限度檢查及方法驗證整理課件1微生物實驗室的質(zhì)量管理一、實驗室設(shè)施與設(shè)備和管理（法規(guī)要求）無菌檢查、微生物限度檢查與抗生素微生物檢定的實驗室，應(yīng)嚴(yán)格分開。無菌檢查、微生物限度檢查實驗室分無菌操作間和緩沖間。無菌操作間應(yīng)具備相應(yīng)的空調(diào)凈化設(shè)施和環(huán)境，采用局部百級措施時，其環(huán)境應(yīng)符合萬級潔凈度要求。進入無菌操作間應(yīng)有人流凈化和物流凈化的設(shè)施。無菌操作間應(yīng)根據(jù)檢驗品種的需要，保持對鄰室的相對正壓或相對負壓，并定期檢測潔凈度。無菌操作間內(nèi)禁放雜物，并應(yīng)制定地面、門窗、墻壁、設(shè)施等的定期清潔、滅菌規(guī)程。無菌檢查在潔凈度100級單向流空氣區(qū)域內(nèi)進行，其全過程應(yīng)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止微生物污染。單向流空氣區(qū)與工作臺面，必須進行潔凈度驗證。微生物限度檢查的全過程，均應(yīng)遵守?zé)o菌操作，嚴(yán)防再污染。整理課件69微生物實驗室的質(zhì)量管理一、實驗室設(shè)施與設(shè)備和管理（法規(guī)要求）微生物實驗室的質(zhì)量管理為滿足微生物學(xué)實驗要求，微生物實驗室應(yīng)具有：嚴(yán)格分開的無菌檢查、微生物限度檢查、無菌采樣室。菌種處理與微生物鑒別室有局部百級措施。各自分開的抗生素微生物檢定、細菌內(nèi)毒素檢查、抗菌作用測定半無菌室。培養(yǎng)室（一般為100，000級）。試液及培養(yǎng)基的配制室。滅菌室。實驗器皿洗滌、烘干室。人員辦公休閑室。實驗用品、易耗品儲藏室。整理課件70微生物實驗室的質(zhì)量管理為滿足微生物學(xué)實驗要求，微生物實驗室應(yīng)微生物實驗室的質(zhì)量管理設(shè)施和設(shè)備的管理特殊標(biāo)準(zhǔn)品——菌種培養(yǎng)基、緩沖液、試劑消毒劑文件管理培訓(xùn)內(nèi)審整理課件71微生物實驗室的質(zhì)量管理設(shè)施和設(shè)備的管理整理課件4微生物實驗室的質(zhì)量管理微生物室實驗室的質(zhì)量管理制定潔凈室（無菌室）的使用管理規(guī)程（SOP）菌種處理相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）生物安全柜的使用標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）帶菌廢棄物的處理標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）環(huán)境消毒標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）環(huán)境清潔、消毒標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）試液及培養(yǎng)基配制的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）實驗器皿洗滌標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）建立無菌室使用登記冊使用日期，時間，使用人，設(shè)備運轉(zhuǎn)狀況，溫、濕度，潔凈度狀況（沉降菌數(shù)、浮游菌數(shù)、塵埃粒子數(shù)），報修原因，報修結(jié)果，清潔工作（臺面、地面、墻面、天花板、傳遞窗、門把手），消毒液名稱等整理課件72微生物實驗室的質(zhì)量管理微生物室實驗室的質(zhì)量管理制定使用日期，微生物實驗室的質(zhì)量管理實驗室使用管理每天工作前用消毒液消毒工作臺，開紫外燈（最少半小時）進行空氣消毒，每月定期做徹底清潔工作，適當(dāng)時用消毒劑進行熏蒸。非必要品禁止帶入實驗室，必要資料和記錄應(yīng)消毒后進入并應(yīng)遠離操作臺。實驗人員進入潔凈室（無菌室）不得化妝、戴手表、戒指等首飾；不得吃東西。應(yīng)嚴(yán)格按更衣程序更衣。記錄溫濕度是否在規(guī)定的范圍內(nèi)，每次實驗時，對操作室和層流臺做微生物沉降菌落計數(shù)并記錄；如發(fā)現(xiàn)問題應(yīng)找原因，及時報修和報告并將報修原因和結(jié)果記錄歸檔。如遇停電，應(yīng)立即停止實驗，重新進入無菌室前，至少開啟機房運轉(zhuǎn)1小時以上。在每次實驗結(jié)束時，應(yīng)用消毒劑及時按消毒規(guī)程中的要求消毒操作臺和潔凈室（區(qū)），并開啟室內(nèi)紫外燈以殺滅存留微生物。使用后的器具如平皿、試管，所有微生物培養(yǎng)物，染菌/帶菌物品等應(yīng)用消毒液浸泡（至少24小時以上），經(jīng)煮沸或滅菌后清洗或丟棄。整理課件73微生物實驗室的質(zhì)量管理實驗室使用管理每天工作前用消毒液消毒工微生物實驗室的質(zhì)量管理潔凈室（無菌室）的使用管理每季度定期進行清潔度再驗證，以確保潔凈度符合規(guī)定，保存原始記錄及趨勢分析資料，定期歸檔保存。至少每年一次定期更換新的紫外燈管并記錄，以確保紫外燈管滅菌持續(xù)有效，定期歸檔保存。至少2年1次，或按潔凈度驗證實際情況，定期更換初效、中效、高效頭。以確保凈化系統(tǒng)的功能持續(xù)有效，并同時在使用登記本上做好更換記錄。定期歸檔保存。平時實驗室內(nèi)應(yīng)盡可能減少人員的走動或活動，通向潔凈室的門要關(guān)閉或安裝自動閉門器使其保持關(guān)閉狀態(tài)。發(fā)現(xiàn)潔凈度不符合規(guī)定時，應(yīng)立即停止使用，尋找原因，徹底清潔、消毒，須經(jīng)清潔度再驗證符合規(guī)定后，才再使用，并將情況記錄在無菌室使用登記冊上，定期歸檔保存。非微生物室檢驗人員不得進入潔凈室（無菌室），對必須進入的外來人員或維修人員應(yīng)進行指導(dǎo)和監(jiān)督。整理課件74微生物實驗室的質(zhì)量管理潔凈室（無菌室）的使用管理每季度定期進微生物實驗室的質(zhì)量管理一、實驗室設(shè)施與設(shè)備和管理設(shè)施—潔凈室、凈化工作臺、生物安全柜。設(shè)備—高壓蒸汽滅菌器、電熱恒溫干烤箱、培養(yǎng)箱、冰箱。實驗儀器—全封閉薄膜過濾裝置、電動勻漿儀、電熱恒溫水浴箱、離心機、顯微鏡，及刻度吸管、試管、三角燒瓶、培養(yǎng)皿等。建立主要設(shè)施、設(shè)備、儀器的明細記錄，內(nèi)容包括名稱、型號、生產(chǎn)廠家、購買日期。質(zhì)量保證檔案：購買發(fā)票、安裝驗收或開箱驗收記錄、調(diào)試記錄、計量檢定或運行校驗合格證、指定專人負責(zé)、制訂標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）、建立使用登記冊，維修、保養(yǎng)記錄、改造或更新記錄、直至報廢記錄。整理課件75微生物實驗室的質(zhì)量管理一、實驗室設(shè)施與設(shè)備和管理設(shè)施—潔凈室微生物實驗室的質(zhì)量管理一、實驗室設(shè)施與設(shè)備和管理定期監(jiān)測生物安全柜和（或）超凈工作臺的內(nèi)表面的微生物學(xué)質(zhì)量及其內(nèi)部的空氣質(zhì)量（粒子和微生物）。使用時檢查壓差指示表。培養(yǎng)箱、冰箱需在設(shè)備的每個腔室內(nèi)放置經(jīng)校準(zhǔn)過的玻璃溫度計，每天檢查設(shè)備腔室內(nèi)的溫度狀況并且在日志上做好相應(yīng)的記錄。定期回顧每個設(shè)備的溫度記錄數(shù)據(jù)，以考察設(shè)備的運行狀態(tài)。定期用中性的清潔劑或消毒劑清洗培養(yǎng)箱（或室）、冷藏箱（或室）、冷凍冰箱及水浴的腔室內(nèi)表面。高壓滅菌柜、電熱恒溫干燥箱等需要驗證和持續(xù)監(jiān)控。儀器的校準(zhǔn)和確認(rèn)。整理課件76微生物實驗室的質(zhì)量管理一、實驗室設(shè)施與設(shè)備和管理定期監(jiān)測生物微生物實驗室的質(zhì)量管理需要確認(rèn)和驗證試驗和持續(xù)的質(zhì)量監(jiān)控的設(shè)備高壓滅菌柜和電熱恒溫干燥去熱原烘箱安裝確認(rèn)（IQ）：要確認(rèn)控制系統(tǒng)及其他儀器儀表的設(shè)計是否得當(dāng)并經(jīng)過校驗。檢查有關(guān)共用介質(zhì)（如蒸氣、水和空氣等）符合滅菌工藝的要求。運行確認(rèn)（OQ）：要求證明空載狀態(tài)下驗證方案中所述腔室內(nèi)所有關(guān)鍵位置的溫度是否均處在規(guī)定范圍內(nèi)。建立熱分布圖譜?？蛰d狀態(tài)下，濕熱滅菌當(dāng)腔室工作溫度不低于121℃時，各點溫度與腔室內(nèi)平均溫度之差不超過±1℃，于熱除熱源，當(dāng)運行溫度不低于250℃時，腔室內(nèi)的溫差應(yīng)不得超過±15℃。性能確認(rèn)（PQ）：要求在滿載條件，溫度探頭插入待滅菌物品的內(nèi)部，同時加入一定濃度的微生物或獨立的生物指示劑。對不同的工藝條件（物品、包裝和裝載方式、滅菌參數(shù)等），分別進行性能確認(rèn)試驗，包括熱穿透試驗和生物指示劑挑戰(zhàn)試驗。包括：高壓滅菌柜、除熱源電熱恒溫干燥箱、自動微生物鑒別系統(tǒng)和計數(shù)系統(tǒng)。整理課件77微生物實驗室的質(zhì)量管理需要確認(rèn)和驗證試驗和持續(xù)的質(zhì)量監(jiān)控的設(shè)微生物實驗室的質(zhì)量管理品種：5~20倍稀釋的碘伏水溶液0.10%新潔爾滅容易1:50的84消毒液75%乙醇溶液3%碘酒溶液5%石碳酸（來蘇兒）消毒溶液2%戊二醛水溶液尼泊金酒精消毒液等應(yīng)定期更換消毒劑品種，按標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)確配制。清潔、消毒劑的管理整理課件78微生物實驗室的質(zhì)量管理品種：5~20倍稀釋的碘伏水溶液清潔、微生物實驗室的質(zhì)量管理一、菌種的保存與管理菌種—特殊的標(biāo)準(zhǔn)品

應(yīng)保持基生長特性和減少污染，是微生物實驗結(jié)果一致性的重要保證。制定菌種保藏管理制度

微生物實驗室應(yīng)制定菌種的保藏管理規(guī)程來規(guī)范菌種的來源、申購、保管、轉(zhuǎn)種傳代、存儲和領(lǐng)用等方面的要求，確保菌種的溯源性和穩(wěn)定性；防止試驗用菌種因多次傳代而失去典型生物學(xué)特征發(fā)生變異或死亡，保證菌種長期正確、穩(wěn)定，從而確保實驗的靈敏度和重現(xiàn)性。菌種名稱：金黃色葡萄球菌菌種系列號：[CMCC(B)26003]傳代次數(shù)：第

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代有效期：年月日制備日期：年月日傳代人：王熙鳳整理課件79微生物實驗室的質(zhì)量管理一、菌種的保存與管理菌種—特殊的標(biāo)準(zhǔn)品微生物實驗室的質(zhì)量管理菌種保存應(yīng)有專人負責(zé)，加鎖保存于冰箱中。實驗室的標(biāo)準(zhǔn)菌株應(yīng)來自CMCC（中國藥品生物制品檢定所醫(yī)學(xué)菌種保藏中心或ATCC（美國菌種保藏中心）等國際法定菌種保藏機構(gòu)。有接收、確認(rèn)記錄。菌種的轉(zhuǎn)種等均應(yīng)在超凈工作臺進行，以防污染。各種菌種應(yīng)按規(guī)定時間接種，所有保藏的菌種均應(yīng)貼有相應(yīng)的標(biāo)簽，有菌種清單。整理課件80微生物實驗室的質(zhì)量管理菌種保存應(yīng)有專人負責(zé)，加鎖保存于冰箱中驗證實驗常用菌種枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]生孢梭菌[CMCC（B）64941]銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]大腸埃希菌[CMCC（B）44102]乙型副傷寒沙門菌[CMCC（B）50094]白色念珠菌[CMCC（B）98001]黑曲霉[CMCC（B）9003]整理課件81驗證實驗常用菌種枯草芽孢桿菌菌種保藏步驟干燥菌種復(fù)蘇，劃平板挑選特征典型的純菌菌落；（制菌懸液使用）確定保藏的合格菌體形態(tài)；選擇最適宜的保存方法，定期對保藏菌種進行檢查，觀察是否發(fā)生變化，若有變化，須改變保藏方法。保藏期滿應(yīng)及時進行移種。整理課件82菌種保藏步驟干燥菌種復(fù)蘇，劃平板整理課件15菌種的接收標(biāo)準(zhǔn)菌種一般是玻璃安平裝的凍干粉劑接收時應(yīng)檢查名稱/數(shù)量和完整性。貼好標(biāo)簽后儲存于-20℃一般安平凍干品可在5年之內(nèi)使用使用時應(yīng)按（菌種保藏中心提供的）相關(guān)資料的要求進行復(fù)溶、培養(yǎng)和保存。整理課件83菌種的接收標(biāo)準(zhǔn)菌種一般是玻璃安平裝的凍干粉劑整理課件16菌種的復(fù)活菌種的復(fù)活用70%的酒精擦拭清潔安瓿，自然風(fēng)干用一小砂輪在安瓿的上部劃一條線，用手輕輕將安瓿開無菌操作，用一無菌吸管無菌移取1~2ml適宜的液體培養(yǎng)基到瓿中；輕輕地旋轉(zhuǎn)安瓿以使凍干菌種和液體培養(yǎng)基充分混合并完全溶解；用無菌吸管將安瓶內(nèi)菌液轉(zhuǎn)移到相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，根據(jù)不同菌種類型而將其培養(yǎng)于相宜的溫度下24-72小時。菌種的確認(rèn)菌種復(fù)活后，應(yīng)確認(rèn)菌種的純度與特性從培養(yǎng)肉湯中取細菌培養(yǎng)物接種到平板上，上劃線分離出單個菌落。培養(yǎng)后觀察其是否具有典型的菌落形態(tài)然后挑取單一的純菌落，進行革蘭染色、鏡檢，觀察其染色特性及菌形。最后再做生化實驗以進一步鑒定該菌種，或用API鑒定系統(tǒng)做鑒定工作。對已經(jīng)過鑒定確認(rèn)的菌種就可以進行菌種的傳代和保藏了。整理課件84菌種的復(fù)活菌種的復(fù)活用70%的酒精擦拭清潔安瓿，自然風(fēng)干菌種菌種的傳代和保藏菌種的保藏方法使菌種的代謝處于最不活躍或相對靜止的狀態(tài)，從而在一定時間內(nèi)不發(fā)生變異并保持生命活力。一般來說，低溫、干燥和隔絕空氣是使微生物代謝能力降低的三個重要因素?zé)o論使用那種菌種保藏方法，都應(yīng)進行驗證，以確保在相應(yīng)保存條件下的菌種不會變異并且性能穩(wěn)定。菌種的傳代次數(shù)（自原始菌種凍干粉起）不得超過5代（GMP，藥典）將微生物接種至一新鮮培養(yǎng)基上/內(nèi)，每萌發(fā)一次即稱為“一代”。整理課件85菌種的傳代和保藏菌種的保藏方法使菌種的代謝處于最不活躍或相對冷凍真空干燥保藏法主要是將待保藏菌種混于有保護作用介質(zhì)內(nèi)制成菌液，分裝在安瓿中于冷凍條件下使其快速凍結(jié)，因凍結(jié)可使晶型細致，不致?lián)p傷活菌細胞。然后用真空抽氣減壓，是安瓿內(nèi)的冰晶液體升華，水氣迅速被真空抽走，冰晶型的菌液很快變成疏松的干燥固體物，最后在真空狀態(tài)下熔封管口，使干燥物在局部真空條件下封存，并置冷暗處，在很長時間內(nèi)菌種仍可維持活力不變。整理課件86冷凍真空干燥保藏法主要是將待保藏菌種混于有保甘油冷凍管保藏法將待保藏菌接種至平板或瓊脂斜面，培養(yǎng)用無菌接種環(huán)輕輕刮取菌臺，用接種環(huán)使細菌充分?jǐn)U散到預(yù)先裝于試管中的無菌蒸餾水中調(diào)整菌液濃度，使其等同于麥?zhǔn)媳葷峁艿?0號管向已制備好的菌懸液中加入等體積、濃度為20%的無菌甘油，得到10%甘油菌懸液。輕輕振搖小管，使內(nèi)容物充分混合，分裝于無菌小試管。制好的甘油冷凍管最好在-30℃條件下貯存。有效期至少為2年。氧細菌和酵母菌可用此法保藏，霉菌和厭氧菌則不適于用此法保藏。整理課件87甘油冷凍管保藏法將待保藏菌接種至平板或瓊脂斜面，培養(yǎng)整理課件液體石蠟覆蓋保藏法將菌種穿刺接種于半固體高層培養(yǎng)基中培養(yǎng)，無菌操作在層流臺下用無菌吸管吸取無菌液體石蠟至培養(yǎng)好的菌種管內(nèi)，并使石蠟高出菌種表面約1cm，將試管直立，置于2~8℃冰箱中或室溫下保存，如銅綠假單胞菌。此法保藏霉菌、放線菌、芽胞桿菌可保藏兩年以上，酵母菌可保藏1~2年，一般無芽胞細菌也可保藏1年左右。此法制備簡單，不需要其他特殊設(shè)備，并且效果好，是傳代培養(yǎng)的變相方法，可適當(dāng)延長保藏時間。整理課件88液體石蠟覆蓋保藏法將菌種穿刺接種于半固體高層培養(yǎng)基中培養(yǎng)，整瓊脂斜面低溫保藏法保藏法（廠家常用）將菌種接種在適宜的固體斜面培養(yǎng)基上，生長充分后，移至2~8℃冰箱中保藏。保藏時間：霉菌、放線菌及芽胞的菌保存2~4個月，移種一次；酵母菌2個月移種一次；細菌最好每1月移種一次。優(yōu)點：操作簡單，使用方便，不需特殊設(shè)備，對大多數(shù)微生物都適用。缺點：保藏期太短；傳代次數(shù)多，易發(fā)生變異及污染。此法為實驗室工作用菌種的最常用的保藏方法，僅能用于工作用菌種的短期保藏。整理課件89瓊脂斜面低溫保藏法保藏法（廠家常用）將菌種接種在適宜的固體斜保藏芽胞液對產(chǎn)芽胞的微生物宜制成芽胞菌懸液后再保藏，無菌操作，取1ml孢子液接入茄形瓶或培養(yǎng)皿內(nèi)，輕輕轉(zhuǎn)動使菌液均勻分布于培養(yǎng)基表面。將培養(yǎng)皿在適當(dāng)?shù)臏囟认屡囵B(yǎng)。一般需要7天或更長時間在層流臺下，取3~5ml氯化鈉磷酸鹽緩沖液（pH7.0）加入培養(yǎng)皿內(nèi)用無菌玻璃L棒輕輕刮下菌苔，注意不要劃破培養(yǎng)基。用無菌注射器或無菌吸管吸取菌懸液，收集于試管中。將收集的芽胞液放在80~90℃水浴中加熱15分鐘，冷卻。做好標(biāo)記，放至2~8℃冰箱中保藏。原始芽胞液可保存1年。每次使用前用平皿法重新標(biāo)定其濃度。整理課件90保藏芽胞液對產(chǎn)芽胞的微生物宜制成芽胞菌懸液后再保藏，整理課件微生物菌種的傳代保藏過程按菌種說明書要求復(fù)溶菌粉菌（標(biāo)準(zhǔn)菌株），轉(zhuǎn)種于適當(dāng)?shù)脑鼍囵B(yǎng)基內(nèi)（此為第一代G1），復(fù)壯后轉(zhuǎn)接至平板上，并于適當(dāng)溫度下培養(yǎng)適當(dāng)時間，分離出單個純種菌落（此為第二代G2）菌種鑒定完成后，挑取純菌落制成濃菌懸液用于制備甘油冷凍管，冷凍或低溫保存（標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株G2）；同時挑取純菌落轉(zhuǎn)接斜面菌種作為工作用菌種（工作菌株W3），于適當(dāng)溫度下培養(yǎng)適當(dāng)時間后可用于試驗，直至轉(zhuǎn)為W5為止，需重新開啟安瓶，再重復(fù)上述操作程序。菌種被分為兩類，傳代用菌種和工作用菌種，傳代用菌種（標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株）用甘油冷凍管法保藏工作用菌種（工作菌株）用斜面低溫保藏法保藏整理課件91微生物菌種的傳代保藏過程按菌種說明書要求復(fù)溶菌粉菌（標(biāo)準(zhǔn)菌株試驗用菌液的制備傳代：取菌液0.1ml接種至10ml液體培養(yǎng)基，按規(guī)定培養(yǎng)、稀釋對照用菌種在使用過程中，亦應(yīng)檢查其生物學(xué)特性。如菌落形態(tài)（在可能情況下，用選擇性培養(yǎng)基進行生長檢查）、革蘭染色、鏡檢菌體形態(tài)、主要生化特性（必要時應(yīng)作菌種鑒定實驗）。如發(fā)現(xiàn)染菌或或變異，衰退等現(xiàn)象時，應(yīng)及時處理。為保證試驗的可靠性和準(zhǔn)確性，實驗室還應(yīng)嚴(yán)格按照相關(guān)規(guī)程制備和使用菌種，并對每種微生物的存貯條件（需/厭氧狀態(tài)、溫度和時間）進行確認(rèn)。室溫下菌懸液應(yīng)在制備后的2小時內(nèi)使用低溫保存（2-8℃）時細菌和酵母菌的菌懸液應(yīng)在制備后的24小時內(nèi)使用霉菌孢子液則應(yīng)在制備后的7天內(nèi)使用（黑曲霉孢子懸液可保存在2~8℃，在驗證過的貯存期內(nèi)使用）在使用時（在24小時之內(nèi)）均應(yīng)同時進行菌數(shù)復(fù)核檢查。試驗時可采用分光光度法或麥?zhǔn)媳葷岱ü烙嬀簼舛?。整理課件92試驗用菌液的制備傳代：取菌液0.1ml接種至10ml液體培養(yǎng)菌種的制備、保藏和使用記錄1、菌種名稱_______菌種系列號_________菌種來源________實驗室編號_______傳代代數(shù)________2、菌種制備：培養(yǎng)基_______批號_______接種日期_______接種容器_______數(shù)量_______培養(yǎng)條件_______溫度_______時間_______純化分離鑒定結(jié)果_______操作人_______日期_______3、菌種保藏方法_______保藏數(shù)量_______保藏用培養(yǎng)基_______批號_______培養(yǎng)條件溫度______時間______有效期______操作人______日期__________4、菌種使用記錄序號支取日期數(shù)量操作人用途處理當(dāng)菌種超過有效期或被污染以后應(yīng)滅菌后丟棄?！跏恰醴裾f明：實驗室菌種編號原則：名稱+傳代代數(shù)+制備日期整理課件93菌種的制備、保藏和使用記錄1、菌種名稱_______菌種系列培養(yǎng)基管理一般采用購自中國藥品生物制品檢定所合格的商品脫水培養(yǎng)基。同時按照使用說明書進行配制，需注意培養(yǎng)基的pH值應(yīng)符合規(guī)定，否則必須校正后，按說明書規(guī)定滅菌。商品脫水培養(yǎng)基應(yīng)在有效期內(nèi)使用，使用前應(yīng)注意核對名稱，檢查外觀，遇有結(jié)塊、吸潮現(xiàn)象，應(yīng)廢棄。新鮮培養(yǎng)基的配制，應(yīng)按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的配方進行，對培養(yǎng)基的原材料要進行挑選，試劑應(yīng)為化學(xué)純試劑規(guī)格。制成的培養(yǎng)基要求無沉淀。必要時以適當(dāng)方法過濾，調(diào)整pH值，分裝滅菌備用。滅菌：應(yīng)經(jīng)驗證合格的滅菌程序（一定裝載方式下滅菌方法和條件）。驗證：無菌性試驗，促生長試驗，滅菌器蒸汽循環(huán)系統(tǒng)。整理課件94培養(yǎng)基管理一般采用購自中國藥品生物制品檢定所合格的商品脫水培培養(yǎng)基的質(zhì)量控制建立質(zhì)量控制程序所有配好的培養(yǎng)基均需進行質(zhì)量控制（pH、適用性檢查試驗）培養(yǎng)基有效期的確定：定期的穩(wěn)定性檢查以確定有效期（2~25℃，避光，非密閉容器3周內(nèi)使用，密閉容器1年內(nèi)使用。質(zhì)量控制的頻率：用同1批脫水培養(yǎng)基，采用經(jīng)驗證的配制和滅菌方法制備的培養(yǎng)基，可只做1次靈敏度檢驗。質(zhì)量控制菌株的選擇（營養(yǎng)、靈敏、代表性）對無菌培養(yǎng)基的無菌性、靈敏度檢查與對照培養(yǎng)基進行比較無菌檢查用需氣厭氣培養(yǎng)基的指示劑氧化層不得超過培養(yǎng)基深度的1/5，否則須經(jīng)水浴煮沸10分鐘，但只限加熱一次。無菌檢查結(jié)束時，指示劑氧化層應(yīng)不超過培養(yǎng)基深度的1/2。大腸埃希菌檢查用MUG培養(yǎng)基配制前應(yīng)挑選無熒光的試管進行配制，觀察結(jié)果時應(yīng)用同批培養(yǎng)基配制的空白管和陽性菌管同時觀察。整理課件95培養(yǎng)基的質(zhì)量控制建立質(zhì)量控制程序整理課件28培養(yǎng)基的靈敏度檢查：已知菌生長試驗①細菌組：取每管裝量為12ml硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基9支，分別接種小于100cfu試驗菌各2支；菌種：金黃色葡萄球菌銅綠假單胞菌枯草芽孢桿菌生孢梭菌空白對照：另一支不接種，培養(yǎng)24~72小時逐日觀察結(jié)果②霉菌組：取每管裝量為9ml的改良馬丁液體培養(yǎng)基5支，分別接種小于100cfu試驗菌各2支；菌種：白色念珠菌黑曲霉空白對照：另一支不接種，培養(yǎng)5天逐日觀察結(jié)果結(jié)果判定空白管培養(yǎng)基無菌生長加菌的培養(yǎng)基管均生長良好判靈敏度檢查合格。整理課件96培養(yǎng)基的靈敏度檢查：已知菌生長試驗①細菌組：菌種：空培養(yǎng)基管理配制好的培養(yǎng)基，按無菌要求進行滅菌。培養(yǎng)基的配制須有記錄，記錄內(nèi)容含有：配制日期和配制人員的標(biāo)識；培養(yǎng)基/溶液的類型、體積；成分、每個成分物質(zhì)的含量、制造商、批號；pH（最初和最終）值無菌措施，包括實施的方式、時間和溫度。按日期編制滅菌后的培養(yǎng)基編號將制備完畢的培養(yǎng)基按品種放置在陰涼的指定位置，備用。注意保存期整理課件97培養(yǎng)基管理配制好的培養(yǎng)基，按無菌要求進行滅菌。配制日期和配制滅菌法濕熱高壓蒸汽滅菌法：依115℃、121℃或132℃，應(yīng)用于培養(yǎng)基滅菌、試驗器械、工作服、橡膠物品和實驗室廢棄物，也可用于玻璃器皿的滅菌。一般121℃30min干熱法：利用物理學(xué)，171℃-1小時，160℃-2小時、121℃-3小時：玻璃器皿濕熱：蛋白質(zhì)容易凝固干熱：氧化整理課件98滅菌法濕熱高壓蒸汽滅菌法：依115℃、121℃或132℃檢驗方法學(xué)驗證：在化學(xué)測試中，藥品的測定方法需要驗證，與此相應(yīng)，當(dāng)建立藥品的無菌、微生物限度檢查法時，也應(yīng)進行分析方法的驗證，以證明所采用的方法適合于該產(chǎn)品的無菌、微生物限度檢查。證明采用藥典的某種方法和檢驗條件，在該供試品的檢驗量、檢驗條件下，無抑菌活性或活性已消失，保證檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。整理課件99檢驗方法學(xué)驗證：在化學(xué)測試中，藥品的測定方法需要驗證，與此相檢驗方法學(xué)驗證：驗證時機；建立檢驗方法時；修訂檢驗方法時；組分和檢驗條件發(fā)生變更時；定期再驗證。整理課件100檢驗方法學(xué)驗證：驗證時機；整理課件33人員人是無菌藥品生產(chǎn)中的主要污染源，在管理比較到位。生產(chǎn)設(shè)備自動化程度較好，操作人員素質(zhì)較高的企業(yè)，人員操作所致的污染率超過70%。具微生物專業(yè)知識經(jīng)無菌技術(shù)培訓(xùn)對實驗結(jié)果能進行充分全面的評價。整理課件101人員人是無菌藥品生產(chǎn)中的主要污染源，在管理比較到位。生產(chǎn)設(shè)備其它重要影響因素藥品本身的抑菌性；培養(yǎng)基的促菌生長能力；培養(yǎng)條件（溫度、濕度及需氧或厭氧）；過濾系統(tǒng)的材質(zhì)整理課件102其它重要影響因素藥品本身的抑菌性；整理課件35檢驗的進展強調(diào)檢驗的過程控制，提高檢出率，保證檢驗結(jié)果的可靠性。人員的要求環(huán)境、設(shè)施要求培養(yǎng)基適用性檢驗數(shù)量方法驗證培養(yǎng)時間試驗用菌全封閉過濾培養(yǎng)器、隔離系統(tǒng)整理課件103檢驗的進展強調(diào)檢驗的過程控制，提高檢出率，保證檢驗結(jié)果的可靠檢驗結(jié)果的保證要求有一個取樣計劃來涵蓋整個批號有足夠的取樣量和檢驗量選擇適用的培養(yǎng)基采用經(jīng)驗證的無菌檢驗方法良好的環(huán)境監(jiān)控人員保證整理課件104檢驗結(jié)果的保證要求有一個取樣計劃來涵蓋整個批號整理課件37無菌檢查整理課件105無菌檢查整理課件38無菌檢查定義：無菌原料藥是指法定藥品標(biāo)準(zhǔn)中列有無菌檢查項目的制劑和原料藥，包括無菌制劑和無菌原料藥。無菌檢查是檢查要求無菌的藥品、醫(yī)療器具、原料、輔料以及要求無菌的其他物品是否染有活菌的一種方法。符合無菌檢查法的規(guī)定僅表明了供試品在該檢驗條件下未發(fā)現(xiàn)細菌和真菌污染。無菌檢查法建立在批產(chǎn)品受微生物污染是均勻的假設(shè)上（其實非均勻）。無菌檢出低污染的概率極低的。因此，無菌檢查存在風(fēng)險和局限性。整理課件106無菌檢查定義：無菌原料藥是指法定藥品標(biāo)準(zhǔn)中列有無菌檢查項目的無菌檢查的局限性無法對整批產(chǎn)品進行100%檢驗只進行細菌和真菌的檢驗培養(yǎng)基培養(yǎng)條件（如溫度和時間）是有限的我們的工作環(huán)境及操作是在相對無菌的狀態(tài)。整理課件107無菌檢查的局限性無法對整批產(chǎn)品進行100%檢驗整理課件40無菌檢查：注射劑、植入劑、部分外用藥鼻用制劑：用于手術(shù)或創(chuàng)傷的鼻用制劑。凝膠劑：用于嚴(yán)重創(chuàng)傷的凝膠劑。乳膏劑：用于燒傷或嚴(yán)重創(chuàng)傷的乳膏劑。新增的無菌檢查中藥制劑散劑：用于燒傷或嚴(yán)重創(chuàng)傷的外用散劑。鼻用制劑：用于嚴(yán)重創(chuàng)傷的鼻用制劑。眼用制劑：用于傷口的眼用制劑。軟膏劑：用于燒傷或嚴(yán)重創(chuàng)傷的乳膏劑。氣霧劑、噴霧劑：用于燒傷或嚴(yán)重創(chuàng)傷的氣霧劑、噴霧劑。整理課件108無菌檢查：注射劑、植入劑、部分外用藥鼻用制劑：用于手術(shù)或創(chuàng)傷GMP—取樣取樣注意事項，包括為降低取樣過程產(chǎn)生的各種風(fēng)險所采取的預(yù)防措施，尤其是無菌或有害物料的取樣以及防止取樣過程中污染和交叉污染的注意事項；在生產(chǎn)的每一階段，應(yīng)當(dāng)保護產(chǎn)品和物料免受微生物和其他污染。附錄1無菌藥品質(zhì)量控制第八十條無菌檢查的取樣計劃應(yīng)當(dāng)根據(jù)風(fēng)險評估結(jié)果制定，樣品應(yīng)當(dāng)包括微生物污染風(fēng)險最大的產(chǎn)品。無菌檢查樣品的取樣至少應(yīng)當(dāng)符合以下要求：（一）無菌灌裝產(chǎn)品的樣品必須包括最初、最終灌裝的產(chǎn)品以及灌裝過程中發(fā)生較大偏差后的產(chǎn)品；（二）最終滅菌產(chǎn)品應(yīng)當(dāng)從可能的滅菌冷點處取樣；（三）同一批產(chǎn)品經(jīng)多個滅菌設(shè)備或同一滅菌設(shè)備分次滅菌的，樣品應(yīng)當(dāng)從各個/次滅菌設(shè)備中抽取。一般隨機抽樣，保證樣品的代表性和原始性，復(fù)試樣品應(yīng)盡量重現(xiàn)原取樣。整理課件109GMP—取樣取樣注意事項，包括為降低取樣過程產(chǎn)生的各種風(fēng)險所注意事項只要供試品的性狀允許，應(yīng)采用薄