二、基本原理

細(xì)菌個(gè)體微小，且較透明，必須借助染色法使菌體著色，顯示出細(xì)菌的一般形態(tài)結(jié)構(gòu)及特殊結(jié)構(gòu)，從而有利于對(duì)細(xì)菌標(biāo)本的觀察。細(xì)菌染色法可分為單染色法和復(fù)染色法兩大類。

1、簡(jiǎn)單染色法原理這是最基本的染色方法，由于細(xì)菌在中性環(huán)境中一般帶負(fù)電荷，所以通常采用一種堿性燃料進(jìn)行染色（如美藍(lán)、堿性復(fù)紅、結(jié)晶紫、孔雀綠、蕃紅等）。這類染料解離后，染料離子帶正電荷，故使細(xì)菌著色。2、革蘭氏染色法原理革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的重要鑒別染色法，通過此法染色，可將細(xì)菌鑒別為革蘭氏陽性菌（G+）和革蘭氏陰性菌（G-）兩大類。革蘭氏染色的意義細(xì)菌分類鑒定指導(dǎo)臨床用藥三、實(shí)驗(yàn)器材1、菌種:大腸桿菌18-24h瓊脂斜面培養(yǎng)物、葡萄球菌18-24h瓊脂斜面培養(yǎng)物、大腸桿菌與葡萄球菌的混合菌液。2、染液（1）簡(jiǎn)單染色液（2）革蘭氏染液3、其他物品：顯微鏡、載玻片、香柏油、擦鏡紙、酒精燈、接種環(huán)、蒸餾水、染色架。四、實(shí)驗(yàn)步驟（一）單染色法取大腸桿菌或葡萄球菌中任一種進(jìn)行單染色。（二）革蘭氏染色法取另兩種菌進(jìn)行革蘭氏復(fù)染。涂片干燥固定染色水洗鏡檢（一）單染色法干燥（二）細(xì)菌的革蘭氏染色法

染色方法

結(jié)晶紫初染1min碘液媒染1min乙醇脫色番紅復(fù)染1min涂片固定涂片制作水洗水洗水洗G+：紫色G-：紅色方法涂片初染媒染脫色復(fù)染鏡檢五、思考題1、比較單染色法和復(fù)染色法的優(yōu)缺點(diǎn)？2、革蘭氏染色有哪些步驟，要注意哪些步驟？為什么？3、革蘭氏染色有何實(shí)際意義？4、細(xì)菌染色結(jié)果為紅色就是G-嗎？為什么？5、在你所做的革蘭染色制片中細(xì)菌染成了何顏色？并判斷是G+還是G-?微生物分類鑒定的特征形態(tài)學(xué)和生理生化特征血清學(xué)實(shí)驗(yàn)和噬菌體分型氨基酸序列和蛋白質(zhì)分析核酸堿基組成和序列分析形態(tài)學(xué)特征培養(yǎng)特征、菌落的形狀、大小、顏色、表面特征、光澤等細(xì)胞形態(tài)：形狀、大小、排列方式特殊結(jié)構(gòu)：鞭毛、芽孢、孢子、莢膜等細(xì)胞內(nèi)涵物染色反應(yīng)：革蘭氏染色、抗酸性染色運(yùn)動(dòng)性球菌肺炎鏈球菌桿菌破傷風(fēng)桿菌肉毒芽孢桿菌炭疽桿菌桿菌變形桿菌大腸桿菌綠膿桿菌螺菌鉤端螺旋體幽門螺桿菌霍亂弧菌涂片菌液涂片時(shí)不需滴加生理鹽水；注意練習(xí)無菌操作；取菌不要貪多，接種環(huán)上肉眼可見菌苔痕跡即可；菌苔在生理鹽水中涂片要均勻，局部不宜過厚,以免脫色不完全造成假陽性。⑴初染將涂片置于桌面上，滴加結(jié)晶紫染色液于細(xì)菌涂抹處，使其布滿菌膜，染色1min。傾去染色液，用自來水小心地沖洗去多余染液，甩凈積水。⑵媒染滴加(Lugol)碘液覆蓋菌膜，染1min，水洗。⑶脫色滴加95%乙醇于載玻片上，直至流下的乙醇無色，然后水洗（終止脫色），甩凈。⑷復(fù)染滴加稀釋復(fù)紅染液于菌膜上，覆蓋住菌膜，染色1min，水洗，甩凈，最后用吸水紙輕輕吸干。干燥后，置油鏡觀察。被染成紫色者即為革蘭氏陽性菌(G)；被染成紅色者是革蘭氏陰性菌(G-)。革蘭氏陽性菌革蘭氏陰性菌1、涂片取一塊干凈的載玻片平放在桌面上，在載玻片中央滴一滴生理鹽水（或蒸餾水）；無菌操作從試管中生長(zhǎng)有瓊脂斜面上挑取少許菌苔；將挑取的菌苔沾入載玻片中央生理鹽水中混勻并涂成薄膜。注意：載玻片要潔凈無油跡；滴生理鹽水和取菌不宜過多；涂片要涂抹均勻，不宜過厚。2、干燥將涂好菌膜的載玻片平放在桌面上，室溫下自然干燥。3、固定手持已經(jīng)自然干燥的涂好菌膜的載玻片，涂面朝上，在酒精燈火焰上通過2~3次，熱固定細(xì)菌細(xì)胞。注意：熱固定溫度不宜過高，否則會(huì)改變甚至破壞細(xì)胞形態(tài)。4、染色將熱固定的細(xì)菌涂片平放于在桌面上，滴加染液于涂片上（染液剛好覆蓋涂片薄膜為宜）。染色時(shí)間：呂氏堿性美藍(lán)染色1~2min；石炭酸復(fù)紅染色約1min草酸銨結(jié)晶紫染色約1min。5、水洗將細(xì)菌涂片上染液倒入廢液缸中；手持細(xì)菌染色涂片，置于廢液缸上方，用洗瓶中自來水沖洗涂片，直至流下的水無色為止。注意：水洗時(shí)，不要直接沖洗涂面，而應(yīng)使水從載玻片的一端流下。水流不宜過急，過大，以免涂片薄膜脫落。6、干燥自然干燥：將染好色的細(xì)菌涂片平放在載玻片架上，室溫下自然干燥；吹干：將染好色的細(xì)菌涂片平放在載玻片架上，用電吹風(fēng)冷風(fēng)或低溫?zé)犸L(fēng)吹干；吸干：將染好色的細(xì)菌涂片平放在一張吸水紙上，上面覆蓋一張吸水