關于流式細胞術實驗技巧及數(shù)據(jù)分析第1頁，共52頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五BD公司不同型號流式細胞儀FACSCaliburLSRIIFACSAriaFACSCountFACSVantage&DiVaFACSCanto第2頁，共52頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五一流式細胞儀的基本原理

*穩(wěn)定流動*激發(fā)光斑*熒光補償*熒光素選擇二數(shù)據(jù)分析及開窗第3頁，共52頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五FCM原理示意圖第4頁，共52頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五

層流是液體穩(wěn)定流動的必要條件,管道中層流的形成要滿足雷諾數(shù)

dρVRe=<2300，

η式中ρ、η分別為液體的密度和粘滯系數(shù)，d和V分別為管道的直徑和液體的平均流速。FCM利用層流技術,使細胞流動穩(wěn)定,并具有自聚焦作用,為細胞分析分選提供技術保證.

層流技術第5頁，共52頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五液流驅(qū)動系統(tǒng)（示意圖）

流速與壓力的關系服從Bernoulli方程，即P=(1/2)V2

(忽略高度的變化)。改變氣壓,就可獲得不同的流速。

第6頁，共52頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五第7頁，共52頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五

低速高速

不同樣本速率形成的樣本流

第8頁，共52頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五激發(fā)光源與光束成形系統(tǒng)第9頁，共52頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五.20um64um32um032um聚焦距離激光束聚焦透鏡強度光束成形與細胞受照方式這種橢圓形光斑的檢測區(qū)保證每個細胞分別受到光照且受檢時受到一致的光照

FCM的單細胞照明技術第10頁，共52頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五第11頁，共52頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五熒光光譜重疊

FITC和PE熒光光譜重疊

第12頁，共52頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五UncompensatedvsCompensatedFL1FL2

利用電子技術或計算機軟件等方法將串入相鄰熒光通道的信號加以扣除的方法稱“熒光補償”熒光補償?shù)?3頁，共52頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五熒光補償?shù)?4頁，共52頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五Mean值判斷補償?shù)?5頁，共52頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五雙或多參數(shù)熒光抗體的組合標記FITC+PE488525、575綠色、橙色FITC+Tred488525綠色

568615

紅色FITC+PeCy5488525、675綠色、紅色FITC+ECD488525、625綠色、橙紅色F+P+PeCy5488525、575、675綠、橙、紅色F+ECD+PeCy5488525、575、675綠、橙紅色、紅色F+P+PeCy5+APC488525、575綠色、橙色

633670

紅色

熒光染料激發(fā)波長（nm)發(fā)射波長（nm)顏色第16頁，共52頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五

用化學法將兩種不同激發(fā)波長的染料結合在一起，在488nm波長激發(fā)光激發(fā)后產(chǎn)生的發(fā)射波長激發(fā)另一熒光染料產(chǎn)生的熒光信號。LaserCY7755PEECD620CY5670488nm能量傳遞染料：第17頁，共52頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五流式細胞術操作流程：培養(yǎng)細胞新鮮組織石蠟包埋單細胞懸液制備熒光抗體標記上機檢測表型測定細胞分選繼續(xù)培養(yǎng)FISHPCR統(tǒng)計學分析第18頁，共52頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五單分散細胞第19頁，共52頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五FSCFSC信號的強弱與細胞的大小和活力相關第20頁，共52頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五SSCSSC信號的強弱與細胞內(nèi)顆粒多少相關第21頁，共52頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五細胞散色光信號第22頁，共52頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五細胞熒光測量細胞的自發(fā)熒光

未經(jīng)染色的樣品細胞在激發(fā)光的照射下可測到有微弱的熒光信號.細胞的特異性熒光

經(jīng)過各種特異染色的細胞在激發(fā)光的照射下可測到較強的熒光信號.第23頁，共52頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五自發(fā)熒光信號與特異染色的熒光信號分析圖自發(fā)熒光信號第24頁，共52頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五特異染色的熒光信號第25頁，共52頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五DNA分析比較第26頁，共52頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五排除雙聯(lián)體細胞第27頁，共52頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五細胞阻滯在G2M期第28頁，共52頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五雙克隆細胞周期分析第29頁，共52頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五

溴脫氧尿嘧啶核苷(Bromodeoxyuridine，

BrdUrd)是胸苷的一種類似物。它可以替代胸腺嘧啶摻入到細胞新合成的DNA分子中，成為S期細胞的一種標記物。流式細胞術采用抗BrdUrd單克隆抗體免疫熒光和PI雙參數(shù)檢測細胞，不僅可檢測一個細胞群體的動力學參數(shù)和DNA含量，同時可以了解不同細胞的DNA合成能力高低。

BrdUrd和DNA雙標記染色第30頁，共52頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五第31頁，共52頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五BrdUrd與PI檢測第32頁，共52頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五BrdUrd與PI檢測第33頁，共52頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五BrdUrd與PI檢測第34頁，共52頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五細胞三色熒光檢測第35頁，共52頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五細胞因子測定*檢測T細胞(CD69)活化第36頁，共52頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五G6=R1*R5第37頁，共52頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五*CD4抗原分子結構引起CD4熒光強度下調(diào)第38頁，共52頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五細胞因子分析圖*過敏性鼻息肉與鼻息肉細胞因子比較第39頁，共52頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五純化單核細胞第40頁，共52頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五調(diào)節(jié)性T細胞檢測第41頁，共52頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五第42頁，共52頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五G3=R1*R3G4=R1*R4第43頁，共52頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五凋亡細胞測定第44頁，共52頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五凋亡細胞測定第45頁，共52頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五細胞凋亡檢測第46頁，共52頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五陰性的設置第47頁，共52頁，2022年，5