會(huì)計(jì)學(xué)1獲能和頂體反應(yīng)會(huì)計(jì)學(xué)1獲能和頂體反應(yīng)2精子獲能、頂體反應(yīng)和與透明帶的結(jié)合曾海濤中南大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院第1頁/共50頁2精子獲能、頂體反應(yīng)和與透明帶的結(jié)合曾海濤第1頁/共50頁3國家中長期科學(xué)和技術(shù)發(fā)展規(guī)劃綱要（2006-2020）六、基礎(chǔ)研究4.重大科學(xué)研究計(jì)劃（4）發(fā)育與生殖研究第2頁/共50頁3國家中長期科學(xué)和技術(shù)發(fā)展規(guī)劃綱要（2006-2020）第24第3頁/共50頁4第3頁/共50頁5一.精子獲能

哺乳動(dòng)物精子在離開雄性生殖道時(shí)，還不能立即與卵子受精。它必須在雌性生殖道內(nèi)經(jīng)歷一段成熟過程，才獲得受精能力。

這一現(xiàn)象稱為獲能（1951年張民覺和Austin）。第4頁/共50頁5一.精子獲能第4頁/共50頁6

體外獲能體內(nèi)獲能的研究．常受到某些條件的限制。從雌性生殖道內(nèi)．特別是輸卵管內(nèi)回收到的精子數(shù)量太少，不易檢測獲能精子化學(xué)成分的改變。因此,研究精子獲能一般采用體外獲能的方法。第5頁/共50頁6體外獲能第5頁/共50頁7第6頁/共50頁7第6頁/共50頁8影響獲能的一些因素(溫度、pH、滲透壓)大多數(shù)動(dòng)物精子體外獲能的溫度為37—38℃。有的動(dòng)物(豬和羊)精子獲能的最佳溫度為39℃。

第7頁/共50頁8影響獲能的一些因素(溫度、pH、滲透壓)第7頁/共50頁9獲能的最適pH為7.4—8.0。低于6.7時(shí)獲能時(shí)間大大延長；豚鼠精子pH低于7.6時(shí)則獲能時(shí)間需24h。pH高于8.2時(shí)，可縮短精子獲能時(shí)間，但不利于精子生存。

第8頁/共50頁9獲能的最適pH為7.4—8.0。低于6.7時(shí)獲10滲透壓對(duì)精子獲能也產(chǎn)生重要影響。低于270mOsm／kgH2O

或高于343mOsm／kgH2O

則影響精子獲能進(jìn)程。最適宜的滲透壓為295～310mOsm／kgH2O

第9頁/共50頁10滲透壓對(duì)精子獲能也產(chǎn)生重要影響。低于270mO11獲能的種間和種內(nèi)差異體外獲能所需要的時(shí)間，種間存在著較大差異。在一些種類動(dòng)物獲能最短時(shí)間為0.5-1h．如小鼠；另一些種類生物則需要7～8h，如兔及人。

第10頁/共50頁11獲能的種間和種內(nèi)差異第10頁/共50頁12精子獲能的異質(zhì)性

從同一個(gè)體射出的所有精子并不是同時(shí)發(fā)生獲能。一些精子獲能較快，另一些則較慢，即所謂獲能上的“異質(zhì)性”或非均一性。

第11頁/共50頁12精子獲能的異質(zhì)性第11頁/共50頁13精子獲能的可逆性張民覺(1958)最早發(fā)現(xiàn)精子獲能是一個(gè)可逆過程，獲能精子一旦與精漿和附睪液接觸，又可去獲能(decapcitation)。如果把去獲能的精子轉(zhuǎn)移到雌性生殖道中，并使之停留一段時(shí)間，精于又可重新獲能。表明精漿和附睪液中存在著一種去獲能因子(decapcitationfactor，DF)。如用超速離心除去DF，精子也可重新獲得受精能力。表明DF參與獲能的調(diào)節(jié)。一般認(rèn)為DF是一種糖蛋白。第12頁/共50頁13精子獲能的可逆性第12頁/共50頁14獲能期間精子出現(xiàn)的各種變化1.膽固醇是維持細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)和功能所必需的成分。質(zhì)膜脂質(zhì)雙層內(nèi)有豐富的膽固醇。獲能期間精子質(zhì)膜膽固醇外流。精子質(zhì)膜膽固醇的喪失可使膜蛋白的分布發(fā)生改變;可使膜的通透性發(fā)生改變,進(jìn)而促進(jìn)獲能。第13頁/共50頁14獲能期間精子出現(xiàn)的各種變化第13頁/共50頁15人輸卵管液中含有的白蛋白(HSA)，能結(jié)合并移去膽固醇；輸卵管液高濃度的高密度脂蛋白(HDL)可直接誘導(dǎo)膽固醇外流，其作用比白蛋白更強(qiáng).在精子體外獲能時(shí)，獲能液中的牛血清白蛋白(BSA)，在有HCO3-

存在時(shí)可與膽固醇結(jié)合，以濃度依賴方式刺激膽固醇外流。

第14頁/共50頁15人輸卵管液中含有的白蛋白(HSA)，能結(jié)合并移去16獲能期間精子出現(xiàn)的各種變化2.胞內(nèi)離子的改變精子獲能期間一些胞外Ca2+進(jìn)入胞內(nèi)，胞內(nèi)Ca2+逐步升高，并呈時(shí)間依賴關(guān)系.HCO3-濃度增加.Ca2+和HCO3-均能刺激腺苷酸環(huán)化酶(AC)合成cAMP，胞內(nèi)cAMP升高進(jìn)而促進(jìn)精子獲能.第15頁/共50頁16獲能期間精子出現(xiàn)的各種變化第15頁/共50頁173.活性氧第16頁/共50頁173.活性氧第16頁/共50頁184.磷酸化第17頁/共50頁184.磷酸化第17頁/共50頁第18頁/共50頁第18頁/共50頁第19頁/共50頁第19頁/共50頁21檢測精子獲能的方法

超激活運(yùn)動(dòng)

頂體反應(yīng)精子穿卵試驗(yàn)(SPA)CTC法第20頁/共50頁21檢測精子獲能的方法第20頁/共50頁22超激活運(yùn)動(dòng)(hyperactivatedmotility,HAM)精子一旦獲能,其運(yùn)動(dòng)類型發(fā)生顯著改變,精子頭部側(cè)擺幅度和頻率明顯增加,而尾部振幅加大,頻率加快,呈現(xiàn)一種特殊的超激活運(yùn)動(dòng)或鞭打樣運(yùn)動(dòng)(whiplashmotility)。HAM系受精前精子為了適應(yīng)受精需要而發(fā)生的一類特殊的運(yùn)動(dòng)類型。Yanagimachi(1970)首先在倉鼠精子獲能時(shí)觀察到這種現(xiàn)象。HAM對(duì)于精子穿越輸卵管峽部,克服輸卵管上皮細(xì)胞的阻力,最后穿過卵丘細(xì)胞及其細(xì)胞外基質(zhì)和透明帶起著重要的作用。第21頁/共50頁22超激活運(yùn)動(dòng)(hyperactivatedmotilit23頂體反應(yīng)(acrosomereaction,AR)

獲能后的精子在生理性誘導(dǎo)物如透明帶、孕酮,或非生理性誘導(dǎo)物如鈣離子載體A23187的誘導(dǎo)下,可發(fā)生頂體反應(yīng),即精子質(zhì)膜與頂體外膜融合釋放頂體內(nèi)容物。第22頁/共50頁23頂體反應(yīng)(acrosomereaction,AR24第23頁/共50頁24第23頁/共50頁25第24頁/共50頁25第24頁/共50頁第25頁/共50頁第25頁/共50頁考馬氏亮藍(lán)染色法第26頁/共50頁考馬氏亮藍(lán)染色法第26頁/共50頁28精子穿卵試驗(yàn)(spermpenetrationofzona-freehamstereggassay)將除去了透明帶的倉鼠卵子與獲能處理后的精子混合培養(yǎng),觀察穿入卵子的精子數(shù)目.第27頁/共50頁28精子穿卵試驗(yàn)(spermpenetrationof29CTC(chlortetracycline)法CTC是一種抗菌素即金霉索。它可根據(jù)精子不同的獲能和AR階段或精子表面差異進(jìn)行染色。它可將精子分為3種類型，即F、B和AR型。

第28頁/共50頁29CTC(chlortetracycline)法第28頁/30二.頂體反應(yīng)當(dāng)獲能的精子接近或進(jìn)入卵丘細(xì)胞或與卵透明帶結(jié)合時(shí)被激活，其頭部發(fā)生頂體反應(yīng)或稱胞吐作用(exocytosis)。頂體反應(yīng)使精子頂體內(nèi)所含的頂體酶釋放出來，支持精子穿過卵透明帶，從而導(dǎo)致精卵融合即受精。第29頁/共50頁30二.頂體反應(yīng)第29頁/共50頁31AR時(shí)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的增加Ca2+在AR過程中起著關(guān)鍵的作用,大多數(shù)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)精子發(fā)生AR時(shí),Ca2+內(nèi)流是早期的反應(yīng)之一.第30頁/共50頁31AR時(shí)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的增加第30頁/共50頁32第31頁/共50頁32第31頁/共50頁33檢測頂體反應(yīng)的方法電鏡法相差顯微鏡法CTC法Hoechst33258法考馬氏亮藍(lán)染色法第32頁/共50頁33檢測頂體反應(yīng)的方法第32頁/共50頁34電鏡法第33頁/共50頁34電鏡法第33頁/共50頁35相差顯微鏡法該法適用于觀察頂體較大的動(dòng)物精子,如豚鼠,倉鼠,麝.頂體較小的精子不能用該法觀察.如小鼠,大鼠,兔.第34頁/共50頁35相差顯微鏡法第34頁/共50頁36第35頁/共50頁36第35頁/共50頁37Hoechst33258法Hoechst33258是一種可結(jié)合DNA的熒光染料.精子先在含Hoechst33258的培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)。只有死精子的核才能吸取這種染料，而具有完整質(zhì)膜的活精子則不能吸收。然后固定精子，再以親頂體的凝集素染色或用抗頂體內(nèi)含物的抗體染色。第36頁/共50頁37Hoechst33258法第36頁/共50頁38三.精子與透明帶的識(shí)別和結(jié)合透明帶是一層包被在卵外的糖蛋白.人、兔、大鼠和小鼠透明帶都由ZP1、ZP2和ZP3三種成分組成。第37頁/共50頁38三.精子與透明帶的識(shí)別和結(jié)合第37頁/共50頁39

ZP2和ZP3以異二聚體的形式存在，排列成細(xì)絲狀，細(xì)絲間由ZP1連接第38頁/共50頁39ZP2和ZP3以異二聚體的形式存在，排列40精子與卵子ZP之間的初級(jí)識(shí)別是由ZP3和精子質(zhì)膜上的ZP3受體介導(dǎo)的；精子與ZP3結(jié)合誘發(fā)頂體反應(yīng)的發(fā)生；發(fā)生了頂體反應(yīng)的精子與ZP2相互作用，發(fā)生次級(jí)識(shí)別和結(jié)合。第39頁/共50頁40精子與卵子ZP之間的初級(jí)識(shí)別是由ZP3和精子質(zhì)膜上41第40頁/共50頁41第40頁/共50頁42精子與卵子透明帶的初級(jí)識(shí)別和結(jié)合ZP3的作用有許多證據(jù)表明，ZP3是精子的初級(jí)受體。證據(jù)包括：①純化的mZP3僅能與頂體完整的精子頭部質(zhì)膜結(jié)合；②精子能與共價(jià)附著mZP3的玻璃珠結(jié)合，也能與轉(zhuǎn)入mZP3基因后能夠分泌mZP3的畸胎瘤細(xì)胞結(jié)合；③純化的mZP3能誘發(fā)精子頂體反應(yīng)；④抗ZP3多肽的抗體能阻止精卵結(jié)合；

第41頁/共50頁42精子與卵子透明帶的初級(jí)識(shí)別和結(jié)合ZP3的作用第41頁/43精子與透明帶的次級(jí)識(shí)別和結(jié)合ZP2的作用頂體反應(yīng)發(fā)生后，精子質(zhì)膜脫落，精子表面與ZP3結(jié)合的受體也隨之丟失。此時(shí)，精子與ZP間發(fā)生次級(jí)識(shí)別。ZP中負(fù)責(zé)與精子發(fā)生次級(jí)識(shí)別的是ZP2。mZP2能與頂體反應(yīng)后的精子結(jié)合。mZP2的抗體能抑制頂體反應(yīng)后的精子與ZP的次級(jí)結(jié)合，而對(duì)頂體反應(yīng)前頂體完整的精子與ZP間初級(jí)識(shí)別和結(jié)合沒有影響第42頁/共50頁43精子與透明帶的次級(jí)識(shí)別和結(jié)合ZP2的作用第42頁/共5044ZP1的作用小鼠卵子的ZPl主要發(fā)揮結(jié)構(gòu)支撐功能，它把ZP2、ZP3細(xì)絲橫向連接起來，構(gòu)成透明帶三維構(gòu)象。然而，在其他動(dòng)物，例如豬和兔的研究表明，ZPl也可能是精子的次級(jí)受體，在精卵結(jié)合中發(fā)揮作用。第43頁/共50頁44ZP1的作用第43頁/共50頁45精子表面的透明帶結(jié)合蛋白卵子ZP蛋白作為精子受體，與精子上相應(yīng)的配體(即透明帶結(jié)合蛋白)相互作用．精子表面的卵子結(jié)合蛋白分為初級(jí)透明帶結(jié)合蛋白和次級(jí)透明帶結(jié)合蛋白。初級(jí)透明帶結(jié)合蛋白位于精子頂體區(qū)質(zhì)膜上。它與ZP3相互作用，誘發(fā)頂體反應(yīng)的發(fā)生。次級(jí)透明帶結(jié)合蛋白位于頂體反應(yīng)后的精子表面，即頂體內(nèi)膜上，它與ZP2相互作用，在精子穿過ZP過程中，次級(jí)透明帶結(jié)合蛋白始終使精子與ZP結(jié)合。不同動(dòng)物中，已有多種不同的精子蛋白被認(rèn)為參與精卵識(shí)別和結(jié)合。第44頁/共50頁45精子表面的透明帶結(jié)合蛋白第44頁/共50頁46半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶(GalTase)

B-l，4半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶是最早報(bào)道的初級(jí)卵子結(jié)合蛋白，它存在精子表面。純化的GalTase及其抑制劑和它的抗體均可抑制精卵相互作用。該酶可特異地作用于ZP3。實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，GalTase可能是精子上的初級(jí)卵子結(jié)合蛋白。然而，來自GalTase基因敲除小鼠的精子在體內(nèi)仍具有受精能力。

第45頁/共50頁46半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶(GalTase)第45頁/共50頁47透明帶受體激酶p95另一個(gè)初級(jí)卵子結(jié)合蛋白候選者是一種跨膜受體，具有酪氨酸激酶活性，稱為透明帶受體激酶(zonareceptorkinase,ZRK)，又稱p95。酪氨酸磷酸化是精子受精所必需的，抑制酪氨酸蛋白激酶活性即可阻止頂體反應(yīng)，從而阻斷受精。小鼠和人的精子中都有一種95kDa的酪氪酸磷酸化的蛋白質(zhì).第46頁/共50頁47透明帶受體激酶p95第46頁/共50頁48sp56sp56是小鼠精子表面的一種分子量為56kDa的外周膜蛋白。它僅存在于頂體完整的精子表面.sp56存在于成熟小鼠精子頭部背區(qū)。純化的sp56可與小鼠卵結(jié)合，并在體外抑制精卵結(jié)合。sp56存在于小鼠和倉鼠精子表面。所以,小鼠和倉鼠的精子都能與小鼠卵透明帶結(jié)合。人和豚鼠精子不含sp56，因此不能與小鼠卵透明帶結(jié)臺(tái)。sp56是小鼠精子表面卵子結(jié)合蛋白的又一個(gè)主要候選者。第47頁/共50頁48sp56第47頁/共50頁思考題1.簡述獲能期間精子出現(xiàn)的變化。2.檢測頂體反應(yīng)的方法。第48頁/共50頁思考題第48頁/共50頁50ThankYou第49頁/共50頁50ThankYou第49頁/共50頁51感謝您的觀看。第50頁/共50頁51感謝您的觀看。第50頁/共50頁會(huì)計(jì)學(xué)52獲能和頂體反應(yīng)會(huì)計(jì)學(xué)1獲能和頂體反應(yīng)53精子獲能、頂體反應(yīng)和與透明帶的結(jié)合曾海濤中南大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院第1頁/共50頁2精子獲能、頂體反應(yīng)和與透明帶的結(jié)合曾海濤第1頁/共50頁54國家中長期科學(xué)和技術(shù)發(fā)展規(guī)劃綱要（2006-2020）六、基礎(chǔ)研究4.重大科學(xué)研究計(jì)劃（4）發(fā)育與生殖研究第2頁/共50頁3國家中長期科學(xué)和技術(shù)發(fā)展規(guī)劃綱要（2006-2020）第255第3頁/共50頁4第3頁/共50頁56一.精子獲能

哺乳動(dòng)物精子在離開雄性生殖道時(shí)，還不能立即與卵子受精。它必須在雌性生殖道內(nèi)經(jīng)歷一段成熟過程，才獲得受精能力。

這一現(xiàn)象稱為獲能（1951年張民覺和Austin）。第4頁/共50頁5一.精子獲能第4頁/共50頁57

體外獲能體內(nèi)獲能的研究．常受到某些條件的限制。從雌性生殖道內(nèi)．特別是輸卵管內(nèi)回收到的精子數(shù)量太少，不易檢測獲能精子化學(xué)成分的改變。因此,研究精子獲能一般采用體外獲能的方法。第5頁/共50頁6體外獲能第5頁/共50頁58第6頁/共50頁7第6頁/共50頁59影響獲能的一些因素(溫度、pH、滲透壓)大多數(shù)動(dòng)物精子體外獲能的溫度為37—38℃。有的動(dòng)物(豬和羊)精子獲能的最佳溫度為39℃。

第7頁/共50頁8影響獲能的一些因素(溫度、pH、滲透壓)第7頁/共50頁60獲能的最適pH為7.4—8.0。低于6.7時(shí)獲能時(shí)間大大延長；豚鼠精子pH低于7.6時(shí)則獲能時(shí)間需24h。pH高于8.2時(shí)，可縮短精子獲能時(shí)間，但不利于精子生存。

第8頁/共50頁9獲能的最適pH為7.4—8.0。低于6.7時(shí)獲61滲透壓對(duì)精子獲能也產(chǎn)生重要影響。低于270mOsm／kgH2O

或高于343mOsm／kgH2O

則影響精子獲能進(jìn)程。最適宜的滲透壓為295～310mOsm／kgH2O

第9頁/共50頁10滲透壓對(duì)精子獲能也產(chǎn)生重要影響。低于270mO62獲能的種間和種內(nèi)差異體外獲能所需要的時(shí)間，種間存在著較大差異。在一些種類動(dòng)物獲能最短時(shí)間為0.5-1h．如小鼠；另一些種類生物則需要7～8h，如兔及人。

第10頁/共50頁11獲能的種間和種內(nèi)差異第10頁/共50頁63精子獲能的異質(zhì)性

從同一個(gè)體射出的所有精子并不是同時(shí)發(fā)生獲能。一些精子獲能較快，另一些則較慢，即所謂獲能上的“異質(zhì)性”或非均一性。

第11頁/共50頁12精子獲能的異質(zhì)性第11頁/共50頁64精子獲能的可逆性張民覺(1958)最早發(fā)現(xiàn)精子獲能是一個(gè)可逆過程，獲能精子一旦與精漿和附睪液接觸，又可去獲能(decapcitation)。如果把去獲能的精子轉(zhuǎn)移到雌性生殖道中，并使之停留一段時(shí)間，精于又可重新獲能。表明精漿和附睪液中存在著一種去獲能因子(decapcitationfactor，DF)。如用超速離心除去DF，精子也可重新獲得受精能力。表明DF參與獲能的調(diào)節(jié)。一般認(rèn)為DF是一種糖蛋白。第12頁/共50頁13精子獲能的可逆性第12頁/共50頁65獲能期間精子出現(xiàn)的各種變化1.膽固醇是維持細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)和功能所必需的成分。質(zhì)膜脂質(zhì)雙層內(nèi)有豐富的膽固醇。獲能期間精子質(zhì)膜膽固醇外流。精子質(zhì)膜膽固醇的喪失可使膜蛋白的分布發(fā)生改變;可使膜的通透性發(fā)生改變,進(jìn)而促進(jìn)獲能。第13頁/共50頁14獲能期間精子出現(xiàn)的各種變化第13頁/共50頁66人輸卵管液中含有的白蛋白(HSA)，能結(jié)合并移去膽固醇；輸卵管液高濃度的高密度脂蛋白(HDL)可直接誘導(dǎo)膽固醇外流，其作用比白蛋白更強(qiáng).在精子體外獲能時(shí)，獲能液中的牛血清白蛋白(BSA)，在有HCO3-

存在時(shí)可與膽固醇結(jié)合，以濃度依賴方式刺激膽固醇外流。

第14頁/共50頁15人輸卵管液中含有的白蛋白(HSA)，能結(jié)合并移去67獲能期間精子出現(xiàn)的各種變化2.胞內(nèi)離子的改變精子獲能期間一些胞外Ca2+進(jìn)入胞內(nèi)，胞內(nèi)Ca2+逐步升高，并呈時(shí)間依賴關(guān)系.HCO3-濃度增加.Ca2+和HCO3-均能刺激腺苷酸環(huán)化酶(AC)合成cAMP，胞內(nèi)cAMP升高進(jìn)而促進(jìn)精子獲能.第15頁/共50頁16獲能期間精子出現(xiàn)的各種變化第15頁/共50頁683.活性氧第16頁/共50頁173.活性氧第16頁/共50頁694.磷酸化第17頁/共50頁184.磷酸化第17頁/共50頁第18頁/共50頁第18頁/共50頁第19頁/共50頁第19頁/共50頁72檢測精子獲能的方法

超激活運(yùn)動(dòng)

頂體反應(yīng)精子穿卵試驗(yàn)(SPA)CTC法第20頁/共50頁21檢測精子獲能的方法第20頁/共50頁73超激活運(yùn)動(dòng)(hyperactivatedmotility,HAM)精子一旦獲能,其運(yùn)動(dòng)類型發(fā)生顯著改變,精子頭部側(cè)擺幅度和頻率明顯增加,而尾部振幅加大,頻率加快,呈現(xiàn)一種特殊的超激活運(yùn)動(dòng)或鞭打樣運(yùn)動(dòng)(whiplashmotility)。HAM系受精前精子為了適應(yīng)受精需要而發(fā)生的一類特殊的運(yùn)動(dòng)類型。Yanagimachi(1970)首先在倉鼠精子獲能時(shí)觀察到這種現(xiàn)象。HAM對(duì)于精子穿越輸卵管峽部,克服輸卵管上皮細(xì)胞的阻力,最后穿過卵丘細(xì)胞及其細(xì)胞外基質(zhì)和透明帶起著重要的作用。第21頁/共50頁22超激活運(yùn)動(dòng)(hyperactivatedmotilit74頂體反應(yīng)(acrosomereaction,AR)

獲能后的精子在生理性誘導(dǎo)物如透明帶、孕酮,或非生理性誘導(dǎo)物如鈣離子載體A23187的誘導(dǎo)下,可發(fā)生頂體反應(yīng),即精子質(zhì)膜與頂體外膜融合釋放頂體內(nèi)容物。第22頁/共50頁23頂體反應(yīng)(acrosomereaction,AR75第23頁/共50頁24第23頁/共50頁76第24頁/共50頁25第24頁/共50頁第25頁/共50頁第25頁/共50頁考馬氏亮藍(lán)染色法第26頁/共50頁考馬氏亮藍(lán)染色法第26頁/共50頁79精子穿卵試驗(yàn)(spermpenetrationofzona-freehamstereggassay)將除去了透明帶的倉鼠卵子與獲能處理后的精子混合培養(yǎng),觀察穿入卵子的精子數(shù)目.第27頁/共50頁28精子穿卵試驗(yàn)(spermpenetrationof80CTC(chlortetracycline)法CTC是一種抗菌素即金霉索。它可根據(jù)精子不同的獲能和AR階段或精子表面差異進(jìn)行染色。它可將精子分為3種類型，即F、B和AR型。

第28頁/共50頁29CTC(chlortetracycline)法第28頁/81二.頂體反應(yīng)當(dāng)獲能的精子接近或進(jìn)入卵丘細(xì)胞或與卵透明帶結(jié)合時(shí)被激活，其頭部發(fā)生頂體反應(yīng)或稱胞吐作用(exocytosis)。頂體反應(yīng)使精子頂體內(nèi)所含的頂體酶釋放出來，支持精子穿過卵透明帶，從而導(dǎo)致精卵融合即受精。第29頁/共50頁30二.頂體反應(yīng)第29頁/共50頁82AR時(shí)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的增加Ca2+在AR過程中起著關(guān)鍵的作用,大多數(shù)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)精子發(fā)生AR時(shí),Ca2+內(nèi)流是早期的反應(yīng)之一.第30頁/共50頁31AR時(shí)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的增加第30頁/共50頁83第31頁/共50頁32第31頁/共50頁84檢測頂體反應(yīng)的方法電鏡法相差顯微鏡法CTC法Hoechst33258法考馬氏亮藍(lán)染色法第32頁/共50頁33檢測頂體反應(yīng)的方法第32頁/共50頁85電鏡法第33頁/共50頁34電鏡法第33頁/共50頁86相差顯微鏡法該法適用于觀察頂體較大的動(dòng)物精子,如豚鼠,倉鼠,麝.頂體較小的精子不能用該法觀察.如小鼠,大鼠,兔.第34頁/共50頁35相差顯微鏡法第34頁/共50頁87第35頁/共50頁36第35頁/共50頁88Hoechst33258法Hoechst33258是一種可結(jié)合DNA的熒光染料.精子先在含Hoechst33258的培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)。只有死精子的核才能吸取這種染料，而具有完整質(zhì)膜的活精子則不能吸收。然后固定精子，再以親頂體的凝集素染色或用抗頂體內(nèi)含物的抗體染色。第36頁/共50頁37Hoechst33258法第36頁/共50頁89三.精子與透明帶的識(shí)別和結(jié)合透明帶是一層包被在卵外的糖蛋白.人、兔、大鼠和小鼠透明帶都由ZP1、ZP2和ZP3三種成分組成。第37頁/共50頁38三.精子與透明帶的識(shí)別和結(jié)合第37頁/共50頁90

ZP2和ZP3以異二聚體的形式存在，排列成細(xì)絲狀，細(xì)絲間由ZP1連接第38頁/共50頁39ZP2和ZP3以異二聚體的形式存在，排列91精子與卵子ZP之間的初級(jí)識(shí)別是由ZP3和精子質(zhì)膜上的ZP3受體介導(dǎo)的；精子與ZP3結(jié)合誘發(fā)頂體反應(yīng)的發(fā)生；發(fā)生了頂體反應(yīng)的精子與ZP2相互作用，發(fā)生次級(jí)識(shí)別和結(jié)合。第39頁/共50頁40精子與卵子ZP之間的初級(jí)識(shí)別是由ZP3和精子質(zhì)膜上92第40頁/共50頁41第40頁/共50頁93精子與卵子透明帶的初級(jí)識(shí)別和結(jié)合ZP3的作用有許多證據(jù)表明，ZP3是精子的初級(jí)受體。證據(jù)包括：①純化的mZP3僅能與頂體完整的精子頭部質(zhì)膜結(jié)合；②精子能與共價(jià)附著mZP3的玻璃珠結(jié)合，也能與轉(zhuǎn)入mZP3基因后能夠分泌mZP3的畸胎瘤細(xì)胞結(jié)合；③純化的mZP3能誘發(fā)精子頂體反應(yīng)；④抗ZP3多肽的抗體能阻止精卵結(jié)合；

第41頁/共50頁42精子與卵子透明帶的初級(jí)識(shí)別和結(jié)合ZP3的作用第41頁/94精子與透明帶的次級(jí)識(shí)別和結(jié)合ZP2的作用頂體反應(yīng)發(fā)生后，精子質(zhì)膜脫落，精子表面與ZP3結(jié)合的受體也隨之丟失。此時(shí)，精子與ZP間發(fā)生次級(jí)識(shí)別。ZP中負(fù)責(zé)與精子發(fā)生次級(jí)識(shí)別的是ZP2。mZP2能與頂體反應(yīng)后的精子結(jié)合。mZP2的抗體能抑制頂體反應(yīng)后的精子與ZP的次級(jí)結(jié)合，而對(duì)頂體反應(yīng)前頂體完整的精子與ZP間初級(jí)識(shí)別和結(jié)合沒有影響第42頁/共50頁43精子與透明帶的次級(jí)識(shí)別和結(jié)合ZP2的作用第42頁/共5095ZP1的作用小鼠卵子的ZPl主要發(fā)揮結(jié)構(gòu)支撐功能，它把ZP2、ZP3細(xì)絲橫向連接起來，構(gòu)成透明