病理組織學(xué)常用制備技術(shù)一、組織的固定

（一）固定的概念

應(yīng)用各種方法使病理標(biāo)本盡量保持其離體前狀態(tài)的過程稱為固定（fixation）。

病理標(biāo)本（樣本）離體后，由于微環(huán)境的變化將發(fā)生自溶和（或）腐敗，使其結(jié)構(gòu)破壞。固定的目的和機(jī)制是：①使蛋白質(zhì)凝固，終止或減少分解酶的作用，防止自溶，保存組織、細(xì)胞的離體前結(jié)構(gòu)狀態(tài)，包括保存組織或細(xì)胞的抗原性，使抗原不失活，不發(fā)生彌散。②保存組織、細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂肪、糖原、某些維生素及病理性蓄積物，維持病變的特異性特征。③使上述物質(zhì)轉(zhuǎn)為不溶解狀態(tài)，防止和盡量減少制片過程中人為的溶解和丟失。④起助染作用。

固定方法有：①物理學(xué)方法，如低溫冷凍，干冰（dry

ice，即固態(tài)無(wú)水碳酸）冰凍真空脫水，石蠟滲入法。②化學(xué)方法，采用各種化學(xué)溶液作固定液，使組織細(xì)胞進(jìn)入固定狀態(tài)。這是國(guó)內(nèi)最常用的方法。

固定應(yīng)在標(biāo)本離體后盡快進(jìn)行，小標(biāo)本可在取材后直接放入固定液內(nèi)，大標(biāo)本應(yīng)在手術(shù)結(jié)束前或結(jié)束后迅速放入固定液內(nèi)。

固定液與標(biāo)本的比例不得少于標(biāo)本體積得5倍。有特殊要求者應(yīng)事先選定相應(yīng)得固定液，如欲查糖原，應(yīng)選擇無(wú)水乙醇作固定液等。

固定得時(shí)間應(yīng)適當(dāng)，微小標(biāo)本（如胃粘膜等）2～4h即可，大標(biāo)本應(yīng)置放12～24h，但亦不要過久，以免影響抗原性，造成免疫組化操作中得困難。

（二）常用固定液及其配制

固定液分單純固定液和混合固定液。

1甲醛（formaldehyde）

是無(wú)色氣體，易溶于水成為甲醛溶液。易揮發(fā)，且有強(qiáng)烈刺激氣味，常用得是37％～40％得甲醛溶液，商品名為福爾馬林（formalin）。用作固定的濃度習(xí)慣為10％福爾馬林（即1份甲醛溶液加9份水配制而成），實(shí)際含甲醛4％。

10％福爾馬林滲透力強(qiáng)，固定均勻，對(duì)組織收縮少。對(duì)脂肪、神經(jīng)及髓鞘、糖等固定效果好，是最常用的固定劑。

經(jīng)福爾馬林固定時(shí)間長(zhǎng)的組織，易產(chǎn)生黑色的沉淀，稱福爾馬林色素。

2乙醇

無(wú)色液體，易溶于水，它除可作為固定劑外，還可作為脫水劑，對(duì)組織有硬化作用。固定用一般是80%~95%濃度，乙醇滲透力校弱，它能溶解脂肪，核蛋白被沉淀后，仍能溶于水，因此核的著色不良。

3中性甲醛液（混合固定液）

甲醛（濃）120ml，加蒸餾水880ml,磷酸二氫鈉（NaH2PO4·H2O）4g，磷酸氫二納（Na2HPO4）13g。此液固定效果比單純10％福爾馬林要好。

4AF液（混合固定液）

95％乙醇90ml，甲醛(濃)10ml。也有配方是95％乙醇85ml，甲醛（濃）10ml，冰醋酸5ml。

此液除有固定作用外，兼有脫水作用，因此，固定后可直接入95％乙醇脫水。

以上4種固定液中，以中性甲醛為首選，其次為10％福爾馬林，乙醇應(yīng)盡量不用。

二、常規(guī)石蠟切片操作

（一）組織洗滌

經(jīng)過固定的組織一般都要洗滌（washing），其目的是清除組織內(nèi)外殘留的固定劑，以免影響脫水等后續(xù)過程；防止有些固定劑在組織中發(fā)生沉淀或結(jié)晶而影響觀察。洗滌時(shí)最好是從容器的底部入水，再?gòu)娜萜魃厦婢徛鞒觯@樣2h即可，若為陳舊標(biāo)本則需24h。

（二）組織脫水

1概念

為保證石蠟有可能進(jìn)入組織內(nèi)部，采用適當(dāng)方法，將已固定和水洗過的組織中的水分徹底驅(qū)除的過程稱為脫水（dehydration）。脫水劑必須是與水在任何比例均能混合的液體。最常用的脫水劑為乙醇，其它尚有正丁醇和二氧已環(huán)以及丙酮等。

2濃度與時(shí)間

脫水用的乙醇濃度一般從70％~75％開始，然后依次80％→95％→100％，即由低濃度逐步到高濃度。脫水的時(shí)間與組織大小、厚薄有很大關(guān)系、組織厚大，脫水時(shí)間要長(zhǎng)些；而小薄的組織脫水時(shí)間相對(duì)的可以短些。組織脫水時(shí)間在低濃度乙醇中可以長(zhǎng)些（如70％~80％），而在高濃度乙醇中要短些，這是因?yàn)楦邼舛鹊囊掖紳B透力不強(qiáng)，延長(zhǎng)脫水時(shí)間無(wú)益，相反高濃度乙易使組織收縮、變脆，致使以后切片和觀察困難。

（三）組織透明

采用既能與脫水劑（如乙醇）混合，并使之被提去（dealcoholisation），又能作為石蠟溶媒的誘導(dǎo)劑，使石蠟真正滲入組織中的過程稱為媒介（intermediary）。由于常用的透明劑（如二甲苯）作用之后，其折射指數(shù)與組織蛋白折射指數(shù)接近，組織顯示出半透明狀態(tài)，因此，通常又稱此過程為透明（clearing）。但并非所有媒介過程均使組織透明。

常用的透明劑為二甲苯，它易使組織收縮、變脆，故透明時(shí)間不宜長(zhǎng)，一般1..5~2h，二節(jié)（即換2次，下同），最好是肉眼觀察，見組織呈棕黃*色或暗紅色透明狀（象琥珀樣）即可。

（四）組織浸蠟

組織經(jīng)媒介（透明）處理后，置入熔化的石蠟內(nèi)浸漬，使石蠟分子浸透入組織中的過程稱浸蠟或石蠟滲透（infiltrating）。滲透的過程也可用火棉膠代替石蠟，稱為浸膠。但其透明過程應(yīng)作相應(yīng)更動(dòng)。

浸蠟一般分2~3節(jié)，總共4~24h，浸蠟時(shí)間過短，蠟沒有完全滲入組織中，組織過軟，切片困難；浸蠟時(shí)間過長(zhǎng)，造成組織硬脆，切片也困難。

（五）組織包埋

把浸蠟的組織包在蠟里成塊，使之有一定的硬度和韌度，便于在切片機(jī)上夾持切片，稱之為包埋（embedding）。

1注意事項(xiàng)

（1）包埋框要比組織塊大，這樣保證包成的蠟塊組織四周都有蠟邊。

（2）胃、腸、膽囊等組織，應(yīng)將能看到組織學(xué)各個(gè)層面的一面作為切面。其它組織應(yīng)將切面朝下。

（3）包埋蠟冬季用低熔點(diǎn)（56~58℃），夏秋季用高熔點(diǎn)蠟（60~62℃）。

（4）包埋蠟最好是經(jīng)多次熔化、沉淀過的蠟，這樣的蠟干凈、致密，利于切片。

2脫水機(jī)脫水、透明、浸蠟時(shí)間

⑴70％乙醇1h。

⑵80％乙醇1h。

⑶95％乙醇Ⅰ1h。

⑷95％乙醇Ⅱ1h。

⑸95％乙醇Ⅲ1h。

⑹100％乙醇Ⅰ1h。

⑺100％乙醇Ⅱ1h。

⑻二甲苯Ⅰ30min。

⑼二甲苯Ⅱ1h。

⑽浸蠟Ⅰ1h。

⑾浸蠟Ⅱ1h

⑿浸蠟Ⅲ2h以上。

3手工組織脫水、透明、浸蠟時(shí)間

⑴70%乙醇1.5h.

⑵80%乙醇1.5h.

⑶95%乙醇從上午下班前進(jìn)入直到下午上班。

⑷100%乙醇Ⅰ30min

⑸100%乙醇Ⅱ30min

⑹二甲苯Ⅰ15min

⑺二甲苯Ⅱ30~60min(肉眼觀察透明即可)

⑻浸蠟過液。

手工浸蠟只有一節(jié)，故在組織透明后將沾在組織上的二甲苯盡量多去掉（一般是將組織倒在鋪有數(shù)層濾紙上，再一個(gè)個(gè)揀回，或?qū)⒄麄€(gè)脫水籃用力甩幾下），再浸蠟。

（六）組織切片

1切片過程

把切片刀架上，固定緊，然后將蠟塊在切片機(jī)固定器上夾緊。先修塊，左手轉(zhuǎn)推進(jìn)器，右手轉(zhuǎn)輪盤，直到把組織全部切出，這時(shí)左手松掉推進(jìn)器而持毛筆，右手旋圍輪盤，蠟片切成后，右手用小鑷子攝蠟片，左手用毛筆沿刀鋒輕輕把蠟片分開，切面朝下把切片放入50℃水中,攤平后用鑷子輕輕將連續(xù)蠟片分開,再用載玻片撈起,蠟片應(yīng)撈在玻片的1/3處,蠟片厚度一般在3~5μm。

2注意事項(xiàng)

①切片前蠟塊要冷凍，這樣容易切片，特別在夏秋季一定要冷凍，但不能把剛包埋好的熱蠟塊冷凍，否則會(huì)造成蠟塊裂痕，一夾就碎。

②寫號(hào)碼用優(yōu)質(zhì)碳素墨水或用一邊毛砂處理的載玻片時(shí)用鉛筆寫號(hào)即可。不需配制蛋白甘油。

③如遇難切的蠟片時(shí)，可用與蠟塊切面差不多大小的薄紙潮濕后貼在蠟塊上切片，然后將附有蠟片的一面朝上放入水中漂片。

④如遇易脫片組織（如血凝塊、腦組織）時(shí)，可將載玻片上涂少許蛋白甘油后再撈片或用多聚賴氨酸處理過的玻片。

⑤總是切不出完整的蠟片，或皺縮或卷片，可能是刀不快。

⑥切出的蠟片總是皺縮，也可能是切片角度不對(duì)，慢慢調(diào)試，一旦有最佳磨刀角度和切片角度后不要隨意改變。

⑦切片厚薄不勻或空片，可能是刀未固定緊或蠟塊未夾緊，也可能是切片機(jī)有問題。

⑧烤片時(shí)間與溫度有關(guān)，一般時(shí)間寧長(zhǎng)勿短，否則會(huì)造成脫片。62℃6h以上，90℃15min以上。

⑨連續(xù)切片放入熱水漂片時(shí)，不要撈取第一、二張蠟片，因?yàn)榍?張蠟片厚、組織有空洞（鏡下可見）。

⑩如遇硬脂酸石蠟處理的蠟塊時(shí)，切的蠟片不能直接入熱水漂片，否則蠟片會(huì)散碎而應(yīng)先入冷水，然后再慢慢加熱水。為了不影響切片、特殊染色及免疫組化的效果，目前，不用硬脂酸石蠟來代替二甲苯、石蠟。

（七）HE染色

1原理

HE染色也稱蘇木精-伊紅染色，它是常規(guī)染色。

蘇木精是一種天然染料，它本身并不能染色，在經(jīng)氧化后變成蘇木紅才是真正的染料，蘇木對(duì)細(xì)胞核的親和力并不強(qiáng)，而在媒染劑的幫助下才能較好顯示細(xì)胞核，此時(shí)細(xì)胞核呈紅色，只有在堿性環(huán)境中，蘇木才變成藍(lán)色。

伊紅Y是人工全盛染料，它可能是通過滲透或彌散作用完成染色的，因此和組織萬(wàn)分結(jié)合是不牢固的。它對(duì)細(xì)胞質(zhì)著色。

2染色程序

①脫蠟

a.二甲苯Ⅰ5~10min

b.二四苯Ⅱ5~10min

c.100%乙醇1~2min

d.95%乙醇1~2min

e.自來水洗

②染色

a.蘇木精浸染5min

b.自來水洗

c.1％鹽酸乙醇分化數(shù)秒

d.自來水洗

e.藍(lán)化（50℃左右溫水）數(shù)分鐘

f.伊紅浸染數(shù)秒

g.自來水洗

③脫水、透明、封片

a.95％乙醇1min

b.100%乙醇Ⅰ1min

c.100%乙醇Ⅱ1min

d.100%乙醇Ⅲ1min

e.二甲苯-石碳酸液（3：1）1min

f.二甲苯Ⅰ1min

g.二甲苯Ⅱ1min

h.滴中性樹膠，蓋蓋玻片

3注意事項(xiàng)

①二甲苯脫蠟時(shí)間冬季長(zhǎng)些，夏季可短些，為防止脫蠟不凈影響染色，脫蠟時(shí)間寧長(zhǎng)勿短。

②鹽酸乙相離分化時(shí)間靈活掌握，可以在切片藍(lán)化后鏡下觀察。

③染色后的脫水透明也很重要，若脫水不完全，切會(huì)會(huì)模糊不清，脫水的乙醇要保持純度，切片在進(jìn)入脫水乙醇前盡量把水多去掉。

④若用Harris蘇木精液時(shí)，染色前要先用一張紙把液體表面的結(jié)晶撈去，否則會(huì)污染切片。

⑤在脫水透明時(shí)，二甲苯一石碳酸的作用利于透明，此步故也可省去。

⑥HE染色雖是常規(guī)染色，但是要制出一張完美的HE切片并不是易事，如兩種顏色的深淺對(duì)比、與染液的濃度、染液的新舊、染色時(shí)間有關(guān)，需每位操作者靈活運(yùn)用。

4染色液的配制

①Gill改良蘇木精液

蘇木精2g，無(wú)水乙醇250ml，硫酸鋁17.6g，蒸餾水750ml，碘酸鈉0.2g，冰醋酸20ml。先將蘇木精溶于無(wú)水乙醇，硫酸鋁溶于蒸餾水，再將兩液混合后加碘酸納，最后加入冰醋酸。此配方為半氧化蘇木精液，碘酸納為氧化劑，硫酸鋁為媒染劑，此液不會(huì)產(chǎn)生沉淀并很少有氧化膜。

②沉淀酸化伊紅丫乙醇液

伊紅丫20g，蒸餾水500ml，濃鹽酸10ml。將伊紅與蒸餾水混合溶解后加入濃鹽酸，攪拌，過夜。過濾、濾液不要，用蒸餾水多次沖洗濾紙中的沉淀，然后將沉淀物連同濾紙一起入溫箱中干燥，用95％乙醇1000ml配成飽和液。使用前取飽和液1份，95％乙醇2~3份，配成染色液。在用此液染色前最好將切片先在95％乙醇中過一下，以保護(hù)染色液。

③鹽酸乙醇分化液\70％乙醇99ml加濃鹽酸1ml。

三、快速石蠟切片操作

（一）應(yīng)用范圍

（1）替代冷凍切片，在沒有條件制作冷凍切片的單位，用作術(shù)中診斷；

（2）快速診斷：適用于門診外地患者，1天可取報(bào)告。

（二）切片制作

（1）將送檢的各類組織按《規(guī)范》（一）編號(hào)登記、眼觀、描述記錄后，用大頭針和羊皮紙包好，投入配制好的固定液燒杯內(nèi)5~10min(固定液配制：95％乙醉85ml，甲醛10ml，冰醋酸5ml)；若組織較厚，可在預(yù)固定后修薄，重復(fù)固定；

（2）無(wú)水乙醇、丙酮脫水3~5min；

（3）浸蠟5min；

（4）常規(guī)石蠟包埋，或封固于預(yù)制好的蠟塊內(nèi)；

（5）常規(guī)HE加溫染色。

（三）注意事項(xiàng)

（1）制作快速石蠟切片全過程過程均加溫在65~72℃范圍內(nèi)操作，可用快速組織處理儀、或在恒溫水浴鍋或恒溫箱內(nèi)完成；

（2）替代冷凍切片可隨到即做，一般在30min內(nèi)完成；若成批操作，則可根據(jù)標(biāo)本的數(shù)量多少，酌情延長(zhǎng)時(shí)間；

（3）制作快速石蠟切片，操作人員必須經(jīng)過一段時(shí)間的訓(xùn)練和摸索，在取得一定經(jīng)驗(yàn)、技術(shù)較熟練能保證切片質(zhì)量后，方可受理對(duì)外服務(wù)，以把好質(zhì)量關(guān)。

四、冷凍切片操作

冷凍切片的方法是一種最省時(shí)最快速的制片方法。因此主要用于臨床手術(shù)中的病理診斷上。其原理很簡(jiǎn)單：冷凍使組織變硬，以代替石蠟做浸蠟。組織中的水分起著浸蠟的作用，用OCT做包埋劑，將組織固定在冷凍頭上，在短時(shí)間內(nèi)凍好，可以立即在冷凍機(jī)上進(jìn)行切片，不需要經(jīng)過脫蠟，可隨時(shí)染色，節(jié)省了時(shí)間。另外，在冷凍切片的過程中，沒有一個(gè)步驟使組織接觸到任何有機(jī)溶劑或其他試劑能溶解或破壞組織中的脂肪、酶以及抗體。因此，冷凍切片也常用于：①顯示組織中的脂質(zhì)和中性脂肪；②顯示酶的活性；③神經(jīng)組織的染色；④免疫熒光技術(shù)。

冷凍切片種類很多，以前有氯乙烷法、二氧化碳法、半導(dǎo)體冷凍法等。這些方法在使用過程中都存在著一定的難度和不方便，制做出的切片質(zhì)量也不好，直接影響到診斷。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，以上方法已淘汰，現(xiàn)在使用的冷凍切片機(jī)（恒冷切片機(jī)），從根本上解決了不利于切片的難題。能更快、更方便地切出較好的切片，而且人為的缺陷也少。

冷凍切片目前最廣泛應(yīng)用于臨床手術(shù)中的病理診斷，手術(shù)醫(yī)生根據(jù)病理診斷結(jié)果決定手術(shù)范圍，因此做出一些高質(zhì)量的冷凍切片至關(guān)重要。

冷凍切片操作程序：

1.冷凍切片機(jī)要始終處于運(yùn)行狀態(tài)，即使在不做冷凍切片時(shí)也要開著致冷，不能時(shí)開時(shí)關(guān)，以免影響機(jī)器壽命。

2.手術(shù)取下的新鮮組織不要固定，因固定過的組織不利于切片，而且還會(huì)影響染色。

3.用OCT做包埋劑，起到支撐的作用。先將OCT標(biāo)在固定頭上再將組織放在OCT上，OCT不要太多，以免流到固定頭外，組織表面露在OCT外。

4.外固定頭放在冷凍機(jī)內(nèi)的速冷臺(tái)上，在-25℃左右，凍10min，視組織不同而時(shí)間略有差異，組織較大或脂