ICS65.020.20B16

DB37山 東 省 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB37/T4101—2020蘋果輪紋病菌快速檢測方法Rapiddetectionofbotryosphaeriadothidea20202020083120201001山東省市場監(jiān)督管理局發(fā)布前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并組織實(shí)施。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：山東省煙臺市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：王英姿、劉保友、汪少麗、王培松、石潔。蘋果輪紋病菌快速檢測方法范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了用環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（LAMP）快速檢測蘋果輪紋病菌的測定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于蘋果葉片、枝條和果實(shí)中蘋果輪紋病菌的快速檢測。方法檢出限：10-7ng/μL蘋果輪紋病菌DNA。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T27403實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測原理ITSBstITS基DNASYBRGreenIDNADNA000倍。在不發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)時，SYBR染料分子的熒光信號不DNASYBRDNA縮略語下列縮略語適用于本文件。LAMP：環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（loop-mediatedisothermalamplification）DNA：脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）ITS：內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internaltranscribedspacer）2×LampMasterMix：等溫擴(kuò)增PCR混合液Bst酶：BstDNA聚合酶（BstDNApolymerase）除有特殊說明外，所有實(shí)驗(yàn)用試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為GB/T6682中規(guī)定的一級水。42 CR（2amPRMaterMi1)40molLTi-C20mmol/(NH)SO、20mmol/LKC1（pH8.8）16mmol/LMgSO42.0mmol/LdNTPs、0.2Trion42 BstDNA8U/μLSYBRGreenI1000ITSbp，引物序列見附錄ADNADNA-EZReagentsAll-DNA-Fast-Out2)5mol/L0.1mL、1.5mL70mm6.2mm9.5mm6.165±380℃±16.20.5μL～10μL10μL～100μL，100μL～1000μL（Valsamali）DNA（Botryosphaeriadothidea）DNADNA0.5cm×0.5cm（），1.5mLDNA100μLDNA1.5mL5min80±1510min～30minLAMPLAMP（上海認(rèn)可。如果其他等效產(chǎn)品具有相同的效果，則可使用這些等效產(chǎn)品。（上海認(rèn)可。如果其他等效產(chǎn)品具有相同的效果，則可使用這些等效產(chǎn)品。LAMP2DNA1μL表1LAMP組分工作液濃度加樣量反應(yīng)體系最終濃度外引物1（F3）10μmol/L0.5μL0.2μmol/L外引物2（B3）10μmol/L0.5μL0.2μmol/L內(nèi)引物1（FIP）10μmol/L2μL0.8μmol/L內(nèi)引物2（BIP）10μmol/L2μL0.8μmol/L環(huán)引物1（LF）10μmol/L1μL0.4μmol/L環(huán)引物2（LB）10μmol/L1μL0.4μmol/LLampPCRMasterMix2×12.5μL1×BstDNA聚合酶8U/μL0.5μL0.16U/μL甜菜堿5mol/L4μL0.8mmol/LDNA模板-1μL-水-補(bǔ)足至25.0μL-65±360min，80110min（7.5防污染措施環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測過程的防污染措施應(yīng)符合GB/T27403中附錄D規(guī)定。8結(jié)果判定22附錄A（資料性附錄）蘋果輪紋病菌ITS基因特異性序列ITS（accessionno.MN559436.1）1ATTGCGCCCTTTGGTATTCCGAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTACAACCCTCAAGC61TCTGCTTGGTATTGGGCACCGTCCTTTGCGGGCGCGCCTCAAAGACCTCGGCGGTGGCGT121CTTGCCTCAAGCGTAGTAGAACATACATCTCGCTTCGGAGCGCAGGGCGTCGCCCGCCGG181ACGAACCTTCTGAACTTTTCTCAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAAC注：下劃線所示部分為引物擴(kuò)增匹配區(qū)段。1（F3，5’-3’）：TGCCTGTTCGAGCGTCAT2（B3，5’-3’）：TCCGAGGTCAACCTTGAGAAF1cF2B1cB2內(nèi)引物2（BIP，5’-3’）：GCGTCTTGCCTCAAGCGTAGTGTTCAGAAGGTTCGTCCGG環(huán)引物1（LF，5’-3’）：G