第2節(jié)微生物的培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用二微生物的選擇培養(yǎng)和計數(shù)一、選擇培養(yǎng)基1.概念：

在微生物學(xué)中，將允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基稱為選擇培養(yǎng)基。2.原理：

人為提供_________________的條件（包括_____、_____和_____等），同時___________________________。有利于目的菌生長抑制或阻止其他微生物的生長營養(yǎng)溫度pH3.舉例：（1）利用改變培養(yǎng)條件進(jìn)行選擇培養(yǎng)。70～80℃的高溫分離耐高溫的水生棲熱菌使用將pH調(diào)至酸性的培養(yǎng)基分離耐酸菌（2）利用營養(yǎng)條件進(jìn)行選擇培養(yǎng)。不加碳源（含碳有機(jī)物）的培養(yǎng)基分離出自養(yǎng)型微生物不加氮源的培養(yǎng)基分離出固氮菌（3）利用添加某種化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行選擇培養(yǎng)。加入青霉素分離酵母菌、霉菌等真菌選擇培養(yǎng)基配方的設(shè)計尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中一種重要的氮肥。尿素施入土壤后，會被土壤中的某些細(xì)菌分解成NH3，再被轉(zhuǎn)化為NO3-、NH4+等被植物吸收。而這些細(xì)菌之所以能分解尿素，是因?yàn)樗鼈兡芎铣呻迕?，脲酶催化尿素分解產(chǎn)生NH3，NH3可以作為細(xì)菌生長的氮源。討論：1.如果讓你配制一種培養(yǎng)基，將土壤稀釋液中能分解尿素的細(xì)菌分離出來，培養(yǎng)基的配方該如何設(shè)計？

在選擇培養(yǎng)基中，以尿素作為唯一氮源，只有能合成脲酶的細(xì)菌才能生長發(fā)育繁殖。2.該培養(yǎng)基與普通培養(yǎng)基有哪些共同點(diǎn)和不同點(diǎn)？

除以尿素作為唯一氮源外，該培養(yǎng)基的其他營養(yǎng)成分與普通培養(yǎng)基基本相同。二、微生物的選擇培養(yǎng)1.方法：稀釋涂布平板法2.操作流程①鏟取土樣，將樣品裝入紙袋中②將10g土樣加入盛有90mL無菌水的錐形瓶中，充分搖勻，制成菌液。取1mL上清液加入盛有9mL無菌水的試管中，依次等比稀釋。1ⅹ1071ⅹ1051ⅹ1061ⅹ1031ⅹ1021ⅹ1049mL無菌水1ⅹ1090mL無菌水1mL1mL1mL1mL1mL1mL③取0.1mL菌液，滴加到（選擇）培養(yǎng)基表面。④將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中。⑤將涂布器放在火焰上灼燒，待酒精燃盡、涂布器冷卻后，再進(jìn)行涂布⑥用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。涂布時可轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿，使涂布均勻。注意事項：①10g土樣加入盛有90mL無菌水中后，已稀釋10倍，在計算時，不要忽略；②由于使用的是選擇培養(yǎng)基，所以一般情況下，獲得的單菌落即目的菌，但因?yàn)橛行┪⑸锟梢岳媚康木拇x產(chǎn)物來生長繁殖，所以還需要進(jìn)一步驗(yàn)證；③過程中所有操作都應(yīng)在酒精燈火焰旁進(jìn)行；④將涂布器從酒精中取出時，要讓多余的酒精在燒杯中滴盡，然后再放在火焰上灼燒；不要將過熱的涂布器放在盛有酒精的燒杯中，以免引燃酒精。

待涂布的菌液被__________后，將平板_____，放入___________中培養(yǎng)____d，在涂布有________菌液的平板上就可以觀察到分離的_______；培養(yǎng)基吸收倒置恒溫培養(yǎng)箱1-2合適濃度單菌落稀釋涂布平板法除可以分離微生物外，也常用來統(tǒng)計樣品中活菌的數(shù)目。三、微生物的數(shù)量測定——間接計數(shù)法1.稀釋涂布平板法（1）原理：

當(dāng)樣品的稀釋度足夠___時，培養(yǎng)基表面生長的一個____，來源于__________中的一個____；通過計數(shù)平板上的____數(shù)，就能推測出樣品中大約含有多少_____；高菌落樣品稀釋液活菌菌落活菌（2）計數(shù)原則①選擇菌落數(shù)為_______的平板計數(shù)30-300②同一稀釋度下，應(yīng)至少對___個平板進(jìn)行重復(fù)計數(shù)，然后求出______；3平均值樣品的______將直接影響平板上的菌落數(shù)目；稀釋度（3）結(jié)果分析：①統(tǒng)計的菌落數(shù)往往比活菌的實(shí)際數(shù)目____；原因：________________________________________________________②統(tǒng)計結(jié)果一般用_______而不是用活菌數(shù)來表示；少當(dāng)兩個或多個細(xì)胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落菌落數(shù)（4）計算公式：每g樣品中的菌落數(shù)＝(C÷V)×MC代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(mL)M代表稀釋倍數(shù)2.顯微鏡直接計數(shù)——直接計數(shù)法（1）方法：

利用特定的___________或_____________在______下觀察、計數(shù)，然后再計算_________的樣品中微生物的數(shù)量；細(xì)菌計數(shù)板血細(xì)胞計數(shù)板顯微鏡一定體積血細(xì)胞計數(shù)板常用于_______________________________等的計數(shù)；相對較大的酵母菌細(xì)胞、霉菌孢子細(xì)菌計數(shù)板可對_________________進(jìn)行觀察和計數(shù)。細(xì)菌等較小的細(xì)胞（2）優(yōu)點(diǎn)：快速直觀（3）缺點(diǎn)：①統(tǒng)計的結(jié)果一般是活菌數(shù)和死菌數(shù)的總和，不能區(qū)分死菌與活菌。②個體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察。四、探究實(shí)踐：土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計數(shù)1.提出問題（實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?）從土壤中分離出能夠分解尿素的細(xì)菌。（2）統(tǒng)計每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細(xì)菌。2.實(shí)驗(yàn)原理

絕大多數(shù)微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成_____的微生物才能分解尿素，利用___________________的_____培養(yǎng)基，可以從土壤中分離出_________的細(xì)菌。組分含量KH2PO41.4gNa2HPO42.1gMgSO4·7H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素1.0g瓊脂15.0gH2O定容至1000mL脲酶以尿素作為唯一氮源選擇分解尿素CO(NH2)2+H2O脲酶2NH3+CO23.實(shí)驗(yàn)步驟（1）土壤取樣①取樣地點(diǎn)要求：

酸堿度接近中性的潮濕土壤。細(xì)菌適宜在該環(huán)境中生長。②取樣過程：

鏟去表層土（一般3cm左右）。細(xì)菌絕大部分分布在距地表3～8cm的土壤層。③注意事項：

取土樣時用的鐵鏟和取樣袋在使用前都需要滅菌。操作完成后，一定要洗手。（2）制備培養(yǎng)基①選擇培養(yǎng)基：以尿素為唯一氮源。葡萄糖10.0g尿素1.0gKH2PO41.4gNa2HPO42.1gMgSO4·7H2O0.2g瓊脂15.0g蒸餾水1000ml②牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：作為對照組，來判斷選擇培養(yǎng)基是否具有選擇作用。（3）樣品的稀釋與涂布平板（稀釋涂布平板法）

測細(xì)菌時，一般選用104、105、106倍稀釋的稀釋液進(jìn)行平板培養(yǎng)。

在初次實(shí)驗(yàn)中，對于稀釋的范圍沒有把握，應(yīng)選擇一個比較寬的范圍，將1×103～1×107倍稀釋的稀釋液分別涂布到平板上培養(yǎng)，以保證能從中選擇出菌落數(shù)在30～300的平板進(jìn)行計數(shù)。①每個濃度至少設(shè)置4個平板，1、2、3平板是選擇培養(yǎng)基（實(shí)驗(yàn)組，三個重復(fù)），4為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（用以判斷選擇培養(yǎng)基是否具有選擇作用）②如何驗(yàn)證培養(yǎng)基中是否含有雜菌？設(shè)置2個平板作為對照：不涂布稀釋液的選擇培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基注意事項：本實(shí)驗(yàn)使用的平板和試管較多，為了避免混淆，最好在使用前做好標(biāo)記。例如，在標(biāo)記培養(yǎng)皿時應(yīng)該注明組別、培養(yǎng)日期和平板上培養(yǎng)樣品的稀釋度等。（4）微生物的培養(yǎng)與觀察①培養(yǎng)條件：

不同種類的微生物，往往需要不同的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間。（細(xì)菌一般在30-37℃的溫度下培養(yǎng)1-2d）②觀察：

每隔24h統(tǒng)計一次菌落數(shù)目，選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結(jié)果。（一般來說，在相同的培養(yǎng)條件下，同種微生物表現(xiàn)出穩(wěn)定的菌落特征，如形狀、大小和顏色等）（5）結(jié)果分析現(xiàn)象分析未涂布培養(yǎng)基上無菌落生長未涂布培養(yǎng)基上有菌落生長牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上的菌落數(shù)目明顯多于選擇培養(yǎng)基上的菌落數(shù)目培養(yǎng)基未被雜菌污染培養(yǎng)基被雜菌污染選擇培養(yǎng)基具有選擇作用2022/11/7①結(jié)合對照組，分析培養(yǎng)物中是否有雜菌污染以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出一些菌落。②你是否獲得了某一稀釋度下菌落數(shù)為30～300的平板?在這一稀釋度下，是否至少有2個平板的菌落數(shù)接近?③你統(tǒng)計的每克土樣中能分解尿素的細(xì)菌的菌落數(shù)是多少?與其他同學(xué)統(tǒng)計的結(jié)果接近嗎?如果差異很大，可能是什么原因引起的?如果沒有接種的培養(yǎng)基上沒有菌落生長，說明培養(yǎng)基沒有被雜菌污染。如果接種后的完全培養(yǎng)基上的菌落數(shù)明顯多于選擇培養(yǎng)基上的菌落數(shù)，說明選擇培養(yǎng)基篩選出了一些尿素分解菌。如果得到了兩個或多個菌落數(shù)為30～300的平板，說明稀釋度合適，操作比較成功，能夠進(jìn)行菌落的計數(shù)。如果是用同一土樣進(jìn)行的操作，數(shù)據(jù)應(yīng)該比較接近。如果差異很大，就需要從操作是否規(guī)范、培養(yǎng)基配制是否合理等方面查找原因。可以觀察菌落周圍是否出現(xiàn)紅色環(huán)帶，紅色環(huán)帶直徑與菌落直徑比值越大，說明分解能力越強(qiáng)。（5）進(jìn)一步探究——分解尿素細(xì)菌的進(jìn)一步鑒定①原理：

細(xì)菌合成的脲酶將尿素分解為氨，氨會使培養(yǎng)基的堿性增強(qiáng)，pH升高，因此可以通過檢測培養(yǎng)基pH的變化來判斷是否發(fā)生了該化學(xué)反應(yīng)，進(jìn)而判斷該菌是否為尿素分解細(xì)菌。②方法：

在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，培養(yǎng)某種細(xì)菌后，如果pH升高，指示劑將變紅。液體培養(yǎng)基：可以直接看液體的變色情況；固體培養(yǎng)基：平