第四章基因工程（一）目的與要求了解基因工程基本原理和基本操作過程，為進(jìn)一步學(xué)習(xí)生物技術(shù)相關(guān)知識和從事基因工程工作打下基礎(chǔ)。對基因工程的發(fā)展動態(tài)有初步的了解。（二）教學(xué)知識要點1.基因工程概述(基因、基因工程概念及原理，研究技術(shù)操作過程，DNA復(fù)制特點)2.DNA重組(掌握限制性內(nèi)切酶、連接酶等在基因工程的應(yīng)用。外源DNA如何體外重組，需要酶及反應(yīng)條件

)3.基因克隆載體

(了解基因工程中常用的三種載體所具備的特性及選擇方法

)4.目的基因的獲得(基因組文庫、cDNA文庫等庫的構(gòu)建方法和目的基因的獲取途徑。)５.目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞(掌握感受態(tài)細(xì)胞制備原理，重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞的方法。)6.重組子的篩選與鑒定(掌握重組子的各種檢測方法，怎樣根據(jù)試驗?zāi)康拇_定不同的檢測方法)7.基因工程的應(yīng)用和安全性問題2.1基因工程(Geneengineering)概述A定義：基因工程又叫做基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)。是在生物體外，通過對DNA分子進(jìn)行人工“剪切”和“拼接”，對生物的基因進(jìn)行改造和重新組合，然后導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行無性繁殖，使重組基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品?；A(chǔ)理論

和技術(shù)的發(fā)展

催生了基因工程閱讀課本第2章B基因工程研究的理論依據(jù)1）不同基因具有相同的物質(zhì)基礎(chǔ)（同一性）2）基因是可以切割的（分離性）3）基因可以轉(zhuǎn)移的（飄流性）4）多肽與基因之間存在對應(yīng)關(guān)系（對應(yīng)性）5）遺傳密碼是通用的（穩(wěn)定性）6）基因經(jīng)復(fù)制能把遺傳信息傳遞給下一代（可遺傳性）1、與基因組有關(guān)的知識生命的最小功能單位—細(xì)胞遺傳物質(zhì)的載體—染色體遺傳信息的載體—DNA遺傳信息傳遞的傳遞規(guī)律—中心法則遺傳信息的基本單位—基因(gene)遺傳信息的總和—基因組遺傳信息的表達(dá)—蛋白質(zhì)組生命的最小功能單位—細(xì)胞人類染色體圖示DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)的形成5′3′5′3′5′3′5′3′磷酸核糖堿基T-A堿基對C-G堿基對真核生物染色體DNA組裝不同層次的結(jié)構(gòu)

DNA（2nm）核小體鏈（11nm，每個核小體200bp）纖絲（30nm，每圈6個核小體）突環(huán)（150nm，每個突環(huán)大約75000bp）玫瑰花結(jié)（300nm，6個突環(huán)）螺旋圈（700nm，每圈30個玫瑰花）染色體（1400nm，每個染色體含10個玫瑰花200bp）遺傳信息傳遞的中心法則

（central-dogma）

中心法則總結(jié)了生物體內(nèi)遺傳信息的流動規(guī)律，揭示遺傳的分子基礎(chǔ)，不僅使人們對細(xì)胞的生長、發(fā)育、遺傳、變異等生命現(xiàn)象有了更深刻的認(rèn)識，而且以這方面的理論和技術(shù)為基礎(chǔ)發(fā)展了基因工程，給人類的生產(chǎn)和生活帶來了深刻的革命。多肽鏈蛋白質(zhì)mRNADNADNA轉(zhuǎn)錄復(fù)制翻譯翻譯后加工DNA序列和遺傳信息

規(guī)定各種蛋白質(zhì)和RNA結(jié)構(gòu)的信息規(guī)定各種基因選擇性表達(dá)的信息

DNA的核苷酸序列通過mRNA規(guī)定蛋白質(zhì)的氨基酸序列，同時信息的轉(zhuǎn)換還要通過蛋白質(zhì)以外的因子,如tRNA、核糖體等來完成儲存在DNA的精細(xì)結(jié)構(gòu)中，直接表現(xiàn)為特定的空間結(jié)構(gòu)，即“密碼結(jié)構(gòu)域”，通過DNA有關(guān)序列形成特異性結(jié)構(gòu)與有關(guān)蛋白質(zhì)因子結(jié)合來體現(xiàn)順式行為元件反式行為元件1.1DNA重組技術(shù)的基本工具是在生物體外，通過對DNA分子進(jìn)行人工“剪切”和“拼接”，對生物的基因進(jìn)行改造和重新組合，然后導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行無性繁殖，使重組基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品分析概念：工具為什么要加工什么是表達(dá)用什么導(dǎo)入基因操作的工具

基因的剪刀（分子手術(shù)刀）——限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶）

基因的針線（分子縫合針）——DNA連接酶

基因的運輸工具（分子運輸車）——運載體

到哪里去尋找這種酶（1）限制酶

①分布：主要在原核生物中。②作用特點:專一性，識別特定核苷酸序列，切割特定切點。

③結(jié)果：產(chǎn)生黏性未端和平末端

④舉例：EcoR1限制酶、Sma1限制酶

與我們學(xué)過的DNA酶相同嗎？識別序列的特點作用是什么兩者的區(qū)別這兩種酶切的特點切斷的是什么鍵（2）DNA連接酶

①連接的部位：磷酸和脫氧核糖之間的鍵：磷酸二酯鍵（梯子的扶手）②結(jié)果：兩個相同的未端的連接。③舉例：E·coliDNA連接酶

T4DNA連接酶

與DNA聚合酶相同嗎二者在性質(zhì)上的區(qū)別（3）運載體

①作用：將外源基因送入受體細(xì)胞。

②具備的條件：能在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并穩(wěn)定地保存。

具有多個限制酶切點。

具有某些標(biāo)記基因?qū)κ荏w細(xì)胞無害

③舉例：質(zhì)粒、噬菌體和動植物病毒。

為什么要具備這些條件第一步：獲取目的基因

方法：

1.從基因文庫中獲取目的基因?；蛭膸斓臉?gòu)建模式圖通過對受體菌的培養(yǎng)而儲存基因第一步：獲取目的基因

方法：

1.從基因文庫中獲取目的基因。2.利用PCR技術(shù)合成DNA

PCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng).是以DNA變性、復(fù)制的某些特性為原理設(shè)計的.前提條件是必須對目的基因有一定的了解，需要設(shè)計引物。

PCR原理圖

PCR的過程（1）以DNA片段作模板，在90℃高溫下，分開成為單鏈DNA。

（2）以DNA小段寡聚核苷酸做引物，在50℃的溫度下，找到可以配對的正鏈和負(fù)鏈，形成互補結(jié)合（3）在70℃高溫下，合成一條與模板DNA單鏈（正鏈或負(fù)鏈）互補結(jié)合的DNA新鏈。

（4）以上三個步驟周而復(fù)始，即反應(yīng)體系的溫度從90oC-50oC-75oC，目的基因的量不斷增加反應(yīng)體系中經(jīng)歷：變性——淬火——合成——重復(fù)。結(jié)果：目的基因的量成指數(shù)形式擴增（2n)高溫的作用是？引物是怎樣獲得的？四種脫氧核苷三磷酸（4XdNTP)酶高溫DNA聚合酶（Taq酶），原料第一步：獲取目的基因

方法：

1.從基因文庫中獲取目的基因。2.利用PCR技術(shù)合成DNA

3.mRNA差異顯示法獲得目的基因（反轉(zhuǎn)錄）由mRNA反轉(zhuǎn)錄形成cDNAmRNADNA單鏈DNA單鏈RNA–DNA雜交分子RNA–DNA雜交分子單鏈DNA單鏈DNA雙鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄使RNA降解復(fù)制核酸酶H??形成氫鍵第一步：獲取目的基因

方法：

1.從基因文庫中獲取目的基因。2.利用PCR技術(shù)合成DNA

3.mRNA差異顯示法獲得目的基因（反轉(zhuǎn)錄）4.采用DNA合成儀人工合成長度不是很大的DNA片段。5.用機械的方法，如超聲波把打成片段。原核生物基因表達(dá)的調(diào)控乳糖代謝基因表達(dá)調(diào)控圖解：(有乳糖時)ＲＰＯ

lacZlacY

lacA調(diào)節(jié)基因啟動子操縱基因結(jié)構(gòu)基因RNA聚合酶信使RNA轉(zhuǎn)錄翻譯阻抑物與乳糖結(jié)合后構(gòu)象發(fā)生了改變，因而不能與操縱基因結(jié)合，使得結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。阻抑物乳糖轉(zhuǎn)錄半乳糖苷酶酶酶第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建核心目的基因與載體結(jié)合成為重組基因需要哪兩種工具總結(jié)：表達(dá)載體需由哪幾部分組成復(fù)制原點啟動子目的基因終止子標(biāo)記基因它們的作用是？第三步：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞

將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞什么叫轉(zhuǎn)化常用的轉(zhuǎn)化方法有哪些？具體過程？第四步：目的基因的檢測與鑒定首先：其次：最后：還要：檢測與鑒定哪些環(huán)節(jié)具體方法？DNA分子雜交技術(shù)基因探針：核酸分子探針是指特定的已知核酸片段，能與互補核酸序列退火雜交，用于對待測核酸樣品中特定基因順序的探測。滿足：（1）必須是單鏈，（2）帶有容易被檢測出來的標(biāo)記物。編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游RNA聚合酶結(jié)合位點RNA聚合酶結(jié)合位點編碼蛋白質(zhì)調(diào)控調(diào)控原核細(xì)胞真核細(xì)胞真核細(xì)胞2、3基因工程的應(yīng)用轉(zhuǎn)基因生物目的基因目的基因來源抗蟲植物Bt毒蛋白基因蘇云金芽胞桿菌（如：抗蟲蛋白酶抑制劑基因植物棉）淀粉酶抑制劑基因植物凝集素基因抗病植物病毒外殼蛋白基因（如：轉(zhuǎn)基病毒的復(fù)制酶基因因煙草）幾丁質(zhì)酶基因請繼續(xù)把表格完成抗逆轉(zhuǎn)基因植物抗凍蛋白基因魚抗除草劑基因轉(zhuǎn)基因玉米富含賴氨酸的蛋白質(zhì)編碼基因轉(zhuǎn)基因延熟番茄控制番茄果實成熟的基因轉(zhuǎn)基因矮牽牛植物花青素代謝有關(guān)的基因轉(zhuǎn)基因鯉魚外源生長激素基因人轉(zhuǎn)基因牛腸乳糖酶基因人轉(zhuǎn)基因牛（羊）抗凝血酶基因、血清白蛋白基因、生長激素基因、a-抗胰蛋白酶轉(zhuǎn)基因煙草發(fā)光基因螢火蟲工程菌細(xì)胞因子、抗體、疫苗、激素、白細(xì)胞介素-2、干擾素、乙肝疫苗基因治療腺苷酸脫氨酶基因功能正常的基因反義基因自殺基因器官移植的供體動物被導(dǎo)入某種調(diào)節(jié)因子的器官供體基因組創(chuàng)造新生物，并給新生物特殊功能的過程

基因工程基因工程與建筑工程

制造稀少珍貴的蛋白質(zhì)藥物1982年，美國食品與藥物管理局批準(zhǔn)了首例基因工程產(chǎn)品——人胰島素投放市場，它標(biāo)志著基因工程產(chǎn)品正式進(jìn)入到商業(yè)化階段人生長激素、表皮生長因子、腫瘤壞死因子、α-干擾素、纖維素酶、抗血友病因子、紅細(xì)胞生成素、尿激酶原、白細(xì)胞介素-2、集落刺激因子、乙肝疫苗等等轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物轉(zhuǎn)基因蔬菜轉(zhuǎn)基因果樹轉(zhuǎn)基因花卉轉(zhuǎn)基因草類轉(zhuǎn)基因林木1983年世界上第一個問世的轉(zhuǎn)基因植物就是抗除草劑煙草。全球第一個被批準(zhǔn)商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因植物是番茄。轉(zhuǎn)基因動物轉(zhuǎn)基因魚轉(zhuǎn)“全魚”GH基因黃河鯉（左）及其對照魚圖片轉(zhuǎn)基因魚國大生物系宮知遠(yuǎn)博士花了4年時間研究轉(zhuǎn)基因魚。他的做法是把來自水母的綠熒光蛋白基因和?？募t熒光蛋白基因，注射入斑馬魚的早期胚胎。

轉(zhuǎn)基因蠶圖為轉(zhuǎn)基因蠶所結(jié)出的熒光繭和從繭中抽取的生絲轉(zhuǎn)基因蝴蝶美UniversityatBuffalo的科學(xué)家研制出世界上第一只轉(zhuǎn)基因蝴蝶(圖)有意思的是，這只蝴蝶的一些基因是來自水母的。

世界上首例轉(zhuǎn)基因靈長類動物—轉(zhuǎn)基因猴“安迪”00月２日出生名叫安迪的小猴目前健康地生活在俄勒崗保健科學(xué)大學(xué)的實驗室里。

２２４只猴子的卵母細(xì)胞,４０個轉(zhuǎn)基因卵母細(xì)胞進(jìn)行人工受精植入２０只代孕猴媽媽的子宮中，結(jié)果有５只猴媽懷孕,３只小猴夭折，一只未獲成功.

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