ICS67.050CCSICS67.050CCSX04內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標準DB15/T2785—2022食用向日葵品種純度鑒定SNP標記法Varietalverificationoftheconfectionsunflower(HelianthusannuusL.)SNPmarkertechnology2022-08-302022-08-302022-09-30內(nèi)蒙古自治區(qū)市場監(jiān)督管理局發(fā)布前 言本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)業(yè)標準化技術委員會（SAM/TC20）歸口。本文件主要起草人：JIUHUANFENG（馮九煥）、唐順學、陳海軍、李昊佼、李新、劉劼、鄔冬梅、秀芳、侯敏、魏志恒、白君君、王祉諾、賈向春、靳存旺。食用向日葵品種純度鑒定SNP標記法范圍（SingleNucleotideannuusL.）本文件適用于食用向日葵品種的純度鑒定。（GB/T3543.2農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程扦樣GB/T3543.5農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程真實性和品種純度鑒定GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法3術語和定義3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。品種純度varietalpurity品種在特征特性或DNA分子標記基因型方面一致性的程度。通常用供檢樣品中本品種的個體數(shù)占檢測樣品個體總數(shù)的百分率表示。異型個體off-typeindividual供檢樣品中，與本品種在DNA標記位點或一個或多個遺傳性狀上存在差異的個體。單核苷酸多態(tài)性singlenucleotidepolymorphism（SNP）基因組中基于單個核苷酸的變異引起的DNA序列多態(tài)性。推薦標記recommendedmarkers品種純度鑒定中優(yōu)先選用的具有良好基因型分型質(zhì)量的標記組合。競爭性等位基因特異性聚合酶鏈式反應kompetitiveallelespecificPCR（KASP）通過引物末端特異性堿基競爭性匹配DNA模板，實現(xiàn)SNP基因型分型的聚合酶鏈式反應?；蛐头中蚲enotyping通過檢測方法確定某品種(或遺傳材料)的基因、DNA區(qū)段或遺傳標記的基因型。原理（ACG(SNP)KASP主要儀器設備及耗材為：PCR——96孔深孔板、384孔PCR板（白色）、微量離心管、普通槍頭、封板膜、鋼珠等。GB/T6682（Na2EDTA?2H2O）（Tris-base）Mix2mol/LTris-HCl（pH8.0）Tris242.8g850mLpH至8.0，定容至1000mL，高壓滅菌。0.25mol/LEDTA（pH84.06g900mLNaOH（約20g）調(diào)pH至8.0，加水定容至1000mL，高壓滅菌。10%SDS100gSDS1000mL。I2mol/LTris-HCl（pH8.0）0.25mol/LEDTA（pH8.0）、10%SDS100mL，900mLpH8.01000mL2%（M/V）K30（PVP-K30）500g860mL42×KASPMasterTaqDNAdNTPROXKASP10μMPrimer_AlleleX10μMPrimer_AlleleY10μMPrimer_AlleleC。樣品準備500。GB/T3543.2GB/T3543.59596%9899100200400DNA提取DNA提取采用下列方法，其它能達到后續(xù)操作質(zhì)量要求的DNA提取方法均適用于本文件：1/3（）0.5cm～1cm9614mm100μLI50Hz60s2～34000rpm3min（500μL6530min～50min；——加300μL溶液II，顛倒搖勻后，于3600rpm離心20min；300μL960.610min4000rpm15minDNA300μL704000rpm15min。70——室溫放置晾干，待DNA充分干燥后，加200μLddH2O充分溶解，4℃保存?zhèn)溆?。PCR檢測總則2DNANTCNTC推薦標記篩選原則及使用要求如下：——選擇遺傳多態(tài)性高、基因組上分布均勻、基因型分型質(zhì)量好、以及重復穩(wěn)定性好的標記；17個SNP（A）173PCRKASPPCRPCR12×KASPMasterMixdNTPTaqDNAROX表1PCR成分原濃度終濃度推薦用量（μL）DNA25ng/μL～50ng/μL7.5ng/μL～15ng/μL1.202×KASPMasterMix2×1×2.00Primer_AlleleX10μM0.15μM0.06Primer_AlleleY10μM0.15μM0.06Primer_C10μM0.40μM0.16ddH2O--0.52總體積--4.00實時熒光定量PCR熒光定量PCR反應通常采用下列程序：——預變性：94℃預變性15min；——梯度PCR：94℃變性20s，65℃退火和延伸60s（每循環(huán)降低0.8℃），10個循環(huán)；——擴增：94℃變性20s，57℃退火和延伸60s，熒光信號讀取，30個循環(huán)。注：以上為推薦的基于實時熒光定量PCR儀檢測平臺的擴增程序，其它如GenomicsSNPLine、ArrayTape、微流控芯片等利用KASP技術實現(xiàn)基因型分型的檢測平臺同樣適用于本文件。數(shù)據(jù)采集PCRSNPNTC2X/Y、YXXYY，雜合基因型記錄為XY；缺失位點記錄為-/-。結果分析22品種純度(%)=(檢測個體總數(shù)-異型個體數(shù))/檢測個體總數(shù)×100%判定雜交種的品種純度是否達到國家規(guī)定的質(zhì)量標準、合同和標簽標注指標要求，使用3543.5（1）T=1.65√??×??/?? （1）式中：T－容許差距；p－品種純度的標準規(guī)定值；q－100-p；N－檢測試樣總數(shù)，單位為個。GB/T3543.5的規(guī)定，使用淘汰值判定。淘汰值可以通過Seedcalc8或如下式（2）計算：R=X+1.65√??+1.8 （2）式中：R－淘汰值（結果舍去所有小數(shù)位數(shù)，不采用四舍五入或六入）；X－標準所換算成的異型個體數(shù)，單位為個。品種純度檢測結果可按下列方式填報：對編為 檢品，用 平臺利個標記行度測結果示在 檢樣中為型個，供樣的度為 ％。具體檢測結果可填入表2。表2品種純度鑒定結果供檢樣品編號供檢樣品類型推薦標記數(shù)供檢樣品數(shù)異型個體數(shù)純度％注：供檢樣品存在遺傳不穩(wěn)定或嚴重分離的標記位點為：附錄A（規(guī)范性）推薦引物序列及基因組位置17個推薦標記的KASP引物序列及基因組位置信息見表A.1。表A.1推薦引物序列及基因組信息標記IDLGaPrimer_AlleleX/Y(5’-3’)Primer_AlleleC(5’-3’)b基因組位置PCP011GCACACGCAGAGCACCTACTTGCACACGCAGAGCACCTACTCGTGTAAGATGTGGTAGACGCAGCTT144989472PCP022GCATATTAACAGGCAAGAACACTTGTGCATATTAACAGGCAAGAACACTTGCGTCTGTAATGATCTTGCAGCTGCGAA144865512PCP033GAAATTCCGGTCCCGCATTCCATAAATTCCGGTCCCGCATTCCACGGACTTTGGTTTTGAGGATCGGTGAA113166971PCP044GGCTTACCATCTTGACATTATGGGTTGCTTACCATCTTGACATTATGGGTGTATGGCATCAACGAGGTATCCAGATAATA456506PCP055CAAGGGTTGTATACAACACAAAGGCAAAGGGTTGTATACAACACAAAGGCGCAAGCTGCAAGTTTCTTTAGCAAATCCAA154220962PCP066ATGTTGTGTTATGCAAGTGAGAGAGTTGTTGTGTTATGCAAGTGAGAGAGTGCACCTTAACGATATTAACCCGATGGTTAT38051242PCP077TACGATGACGTTGTGGAACGACTTCGATGACGTTGTGGAACGACTCGCCTGATTTTAGATGGATCGTCTAAGTTT115935118PCP088GAGAGCGAGTTCACCAACATAATGTAGAGCGAGTTCACCAACATAATGCCCACGGTTGAACCCTGATACTTGTT48738858PCP099GCATCATCAAAGAATCGAGCTAGCACATCATCAAAGAATCGAGCTAGCGAATTAAATTTCATTATGCTAGCTGACT137888783PCP1010CAAGTTCATAACAGAGAAGATTTTCAGAATAAGTTCATAACAGAGAAGATTTTCAGAACCGAAACCTTGTGAAACTTGTTGGTTACTA27896920PCP1111ATCTTTGACACCACCAAACTCTAGTATCTTTGACACCACCAAACTCTAGTACGTACATCCAAGGTTATGAAGACGCGAT17635352PCP1212GATAATGGTTTCCCGGTCGAAGAAAATAATGGTTTCCCGGTCGAAGAAGACCGAACCGGCTCCTCCGTAAT26783877PCP1313GATAACGAAAGATCACACCGGGATATAACGAAAGATCACACCGGGACCACTGGACCCACCGTGAGACTT156633180PCP1414GGCCGTGAAGTTGAAGGATAGGTGCCGTGAAGTTGAAGGATAGGCCCATCTAACCTATCCCTGATCCCAT132691300PCP1515GTTAGACGAAGACGATAAGGTTATGTTAAGACGAAGACGATAAGGTTATGTTCGAAACTGGCAGCTTCATGACCCAAT6702056PCP1616CAGCTCCCTGCAACTCAACCTAAGCTCCCTGCAACTCAACCTGGATAGAGGTGC