關(guān)于練習(xí)血紅蛋白的提取和分離第1頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)46分，星期五思考1分離生物大分子的基本思路是什么？選用一定的物理或化學(xué)的方法分離具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子。思考2蛋白質(zhì)的分離和提取的原理是什么？根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異，如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度和吸附的性質(zhì)和對(duì)其他分子的親和力等等，可以用來(lái)分離不同蛋白質(zhì)。第2頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)46分，星期五一、基礎(chǔ)知識(shí)：㈠凝膠色譜法（分配色譜法）：1、凝膠：一些微小多孔的球體（內(nèi)含許多貫穿的通道，由多糖類構(gòu)成如葡聚糖、瓊脂糖）

2、概念：根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的方法第3頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)46分，星期五3、原理：當(dāng)不同的蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠時(shí)，相對(duì)（）的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程（），移動(dòng)速度（），而（）的蛋白質(zhì)無(wú)法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在（）移動(dòng)，路程（），移動(dòng)速度（），相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)因此得以分離。相對(duì)分子質(zhì)量較小較長(zhǎng)較慢相對(duì)分子質(zhì)量較大凝膠外部較短較快第4頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)46分，星期五用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)時(shí)，分子量大的蛋白質(zhì)(D)A．路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較慢B．路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較快C．路程較短，移動(dòng)速度較慢D．路程較短，移動(dòng)速度較快4、具體過(guò)程第5頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)46分，星期五第6頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)46分，星期五相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)在凝膠中的進(jìn)行過(guò)程可表示為圖中哪一個(gè)B第7頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)46分，星期五㈡緩沖溶液：1、作用：能夠抵制（）對(duì)溶液的（）的影響，維持PH基本不變。外界的酸或堿PH值第8頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)46分，星期五2、緩沖溶液的配制3.為什么在本實(shí)驗(yàn)中實(shí)用緩沖溶液

在血紅蛋白整個(gè)實(shí)驗(yàn)室中用的緩沖液是磷酸緩沖液，目的是利用緩沖液模擬細(xì)胞內(nèi)的PH環(huán)境，保證血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能，便于觀察（紅色）和材料的科學(xué)研究（活性）第9頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)46分，星期五㈢電泳：1、概念：指帶電粒子在電場(chǎng)作用下發(fā)生遷移的過(guò)程。

2、原理：第10頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)46分，星期五3.分類：瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳。測(cè)定（）通常用SDS—聚丙稀酰胺凝膠電泳蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量第11頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)46分，星期五使用SDS-聚丙烯酰胺電泳過(guò)程中，不同蛋白質(zhì)的電泳遷移率完全取決于A電荷的多少B分子的大小C肽鏈的多少D分子形狀的差異第12頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)46分，星期五二實(shí)驗(yàn)操作蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：樣品處理—粗分離—純化—純度鑒定第13頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)46分，星期五思考人們用雞的紅細(xì)胞提取DNA，用人的紅細(xì)胞提取血紅蛋白的原因是什么？雞的紅細(xì)胞具有細(xì)胞核，含有DNA，便于進(jìn)行DNA的提取，人的紅細(xì)胞無(wú)細(xì)胞核，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，血紅蛋白含量豐富便于提取血紅蛋白。第14頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)46分，星期五選用紅細(xì)胞作分離蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)材料，下列是其優(yōu)點(diǎn)的是(ABC)多A．血紅蛋白是有色蛋白B．紅細(xì)胞無(wú)細(xì)胞核C．紅細(xì)胞蛋白質(zhì)含量高D．紅細(xì)胞DNA含量高第15頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)46分，星期五1.樣品處理血液血漿水分固體物質(zhì)血漿蛋白無(wú)機(jī)鹽磷脂葡萄糖等血細(xì)胞白細(xì)胞血小板紅細(xì)胞（最多）血紅蛋白（）90％第16頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)46分，星期五1、樣品處理（1）、紅細(xì)胞的洗滌：（2）、血紅蛋白的釋放：（3）、分離血紅蛋白溶液：第17頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)46分，星期五分離血紅蛋白溶液有機(jī)溶劑（無(wú)色透明的甲苯層）脂類物質(zhì)（白色脂溶性物質(zhì)沉淀層）血紅蛋白溶液（紅色透明液體）紅細(xì)胞破碎物沉（暗紅色沉淀物）第18頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)46分，星期五2.透析(粗分離)a過(guò)程：b目的：c原理：除去樣品中分子量較小的雜質(zhì)透析袋能使小分子自由進(jìn)出，而大分子保留在袋內(nèi)。第19頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)46分，星期五（1）血紅蛋白提取和分離的程度可分為四步：______、______、______和______。（2）實(shí)驗(yàn)前取新鮮的血液，要切記在采血容器中預(yù)先加入檸檬酸鈉，取血回來(lái)，馬上進(jìn)行離心，收集血紅蛋白溶液。①加入檸檬酸鈉的目的是__________。②以上所述的過(guò)程即是樣品處理，它包括______、______、收集血紅蛋白溶液。第20頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)46分，星期五（3）收集的血紅蛋白溶液在透析袋中可以經(jīng)過(guò)透析，這就是樣品的粗分離。①透析的目的是__________________。②透析的原理是__________________。①去除分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)②透析袋能使小分子自由進(jìn)出，而大分子則保留在袋內(nèi)第21頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)46分，星期五（4）然后通過(guò)凝膠色譜法將樣品進(jìn)一步純化，最后經(jīng)SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純度鑒定。①樣品純化的目的是______________________________。②血紅蛋白有什么特點(diǎn)？__________。這一特點(diǎn)對(duì)進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離有什么意義？通過(guò)凝膠色譜法將相對(duì)分子質(zhì)量大的雜質(zhì)蛋白除去血紅蛋白呈現(xiàn)紅色，在凝膠色譜分離時(shí)，可以通過(guò)觀察顏色來(lái)判斷什么時(shí)候應(yīng)該收集洗脫液；這使血紅蛋白的分離過(guò)程非常直觀，大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作。

第22頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)46分，星期五下列操作正確的是（D）A.分離紅細(xì)胞時(shí)采用低速長(zhǎng)時(shí)間離心B.紅細(xì)胞釋放出血紅蛋白只需要加入蒸餾水就可C.分離血紅蛋白溶液是低速短時(shí)間離心D.透析時(shí)要用20mmol/l的磷酸緩沖液，透析12h第23頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)46分，星期五下面關(guān)于對(duì)血紅蛋白提取和分離的樣品的處理措施中，正確的是()多A．采集血樣后要高速短時(shí)問(wèn)離心獲得血細(xì)胞B．洗滌三次后如上清液仍有黃色，可增加洗滌次數(shù)，否則血漿蛋白無(wú)法除凈。C．在蒸餾水和甲苯的作用下，細(xì)胞破裂，釋放出血紅蛋白D．釋放血紅蛋白后再經(jīng)過(guò)離心，就可以使血紅蛋白和其他雜質(zhì)分離開來(lái)BCD第24頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)46分，星期五在蛋白質(zhì)的提取和分離中，關(guān)于對(duì)樣品處理過(guò)程中，分析無(wú)誤的是DA洗滌紅細(xì)胞的目的是去除血漿中的葡萄糖、無(wú)機(jī)鹽B洗滌時(shí)離心速度過(guò)小，時(shí)間過(guò)短，白細(xì)胞等會(huì)沉淀，達(dá)不到分離的效果C洗滌過(guò)程選用0.1%的生理鹽水D透析的目的是去除樣品中相對(duì)分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)D第25頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)46分，星期五3凝膠色譜操作（純化）（1）凝膠色譜柱的制作：第26頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)46分，星期五凝膠色譜柱取長(zhǎng)為40cm，內(nèi)徑為1．6cm，有關(guān)說(shuō)法中，正確的是(ABD)多A．一般凝膠色譜柱直徑的大小不影響分離的效果B．凝膠色譜柱過(guò)高超過(guò)1m，不影響分離的效果C．凝膠色譜柱過(guò)矮，則影響混合物的分離度D．凝膠色譜柱直徑過(guò)大會(huì)耗用過(guò)多洗脫液，樣品的稀釋度過(guò)大ＡＣＤ第27頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)46分，星期五（2）凝膠色譜柱的裝填①凝膠的選擇：A、材料：B、代表意義：“G”表示。75表示②凝膠的前處理：配置凝膠懸浮液：計(jì)算并稱取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后，配成凝膠懸浮液。

③凝膠色譜柱的裝填方法：A、固定：將色譜柱裝置固定在支架上。B、裝填：將凝膠懸浮液一次性的裝填入色譜柱內(nèi)，裝填時(shí)輕輕敲動(dòng)色譜柱，使凝膠填裝均勻。注意：1、凝膠裝填時(shí)盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。2、裝填凝膠柱時(shí)不得有氣泡存在：因?yàn)闅馀輹?huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。第28頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)46分，星期五

④洗滌平衡：裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在50cm高的操作壓下，用300ml的20mmol/l的磷酸緩沖液（pH為7.0）充分洗滌平衡12小時(shí)。注意：1、液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內(nèi)的流動(dòng)與最終生物大分子物質(zhì)的分離效果。2、不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。（2）凝膠色譜柱的裝填50cm高第29頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)46分，星期五（3）樣品加入與洗脫

①調(diào)節(jié)緩沖液面：打開下端出口，使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關(guān)閉出口。

②滴加透析樣品：吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時(shí)，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動(dòng)加樣，同時(shí)注意不要破壞凝膠面。

③樣品滲入凝膠床：加樣后打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口。

④洗脫：小心加入pH=7.0的20mmol/l的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口進(jìn)行洗脫。⑤收集：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液，每5ml收集一試管，連續(xù)收集。（在分離過(guò)程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動(dòng)，說(shuō)明色譜柱制作成功）⑥注意：正確的加樣操作：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)。第30頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)46分，星期五（3）樣品加入與洗脫注意：正確的加樣操作是：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)。第31頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)46分，星期五在裝填凝膠柱時(shí)，不能有氣泡存在的原因是AA、氣泡會(huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果B、氣泡阻礙蛋白質(zhì)的運(yùn)動(dòng)C、氣泡與蛋白質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)D、氣泡在裝填凝膠的時(shí)候，使凝膠不緊密第32頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)46分，星期五樣品的加入和洗脫的操作不正確的是A

A．加樣前，打開色譜柱下端的流出口，使柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液緩慢下降到凝膠面的下面B．加樣后，打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)C．等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口D．用吸管小心的將1ml透析后的樣品加到色譜柱的頂端，不要破壞凝膠面A第33頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)46分，星期五下列是有關(guān)血紅蛋白提取和分離的相關(guān)操作，其中正確的是（A）A．可采集豬血作為實(shí)驗(yàn)材料B．用蒸餾水重復(fù)洗滌紅細(xì)胞C．血紅蛋白釋放后應(yīng)低速短時(shí)間離心