關于細胞凋亡的流式細胞術檢測第1頁，共32頁，2022年，5月20日，18點58分，星期五1.1細胞凋亡細胞凋亡(Apoptosis)是指細胞基因調控的一種自主性的自殺現(xiàn)象?；蛘哒f在一定的生理或病理條件下，細胞遵循自身的程序，自我結束生命的死亡方式。程序性細胞死亡(ProgrammedCellDeath,PCD)

細胞凋亡同細胞分裂、細胞分化一樣，是機體生存和發(fā)育離不開的最基本生物現(xiàn)象，通過凋亡可以平衡機體內細胞的數(shù)目，清除衰老、過剩、有害的細胞。

第2頁，共32頁，2022年，5月20日，18點58分，星期五與細胞凋亡有關的疾病

第3頁，共32頁，2022年，5月20日，18點58分，星期五細胞凋亡的形態(tài)特征

凋亡的起始：微絨毛消失，細胞間接觸消失，與周圍細胞脫離，細胞質中線粒體大體完整，染色質固縮；細胞質密度增加，線粒體膜電位消失，通透性改變，釋放細胞色素C到胞漿，膜內側磷脂酰絲氨酸外翻到膜表面；凋亡小體的形成。核膜核仁破碎，核染色質斷裂為大小不等的片段，與某些細胞器如線粒體一起聚集，為反折的細胞膜所包圍；凋亡小體逐漸被周圍專職或非專職吞噬細胞吞噬。

第4頁，共32頁，2022年，5月20日，18點58分，星期五第5頁，共32頁，2022年，5月20日，18點58分，星期五是細胞受到嚴重損傷或大劑量細胞毒藥物作用后出現(xiàn)的反應。

早期表現(xiàn)為細胞膜破壞，線粒體腫脹。

繼而溶酶體破裂,細胞內容物流出,引起炎癥。1.2細胞壞死第6頁，共32頁，2022年，5月20日，18點58分，星期五細胞凋亡與細胞壞死的區(qū)別——————————————————————————————————————壞死凋亡1.性質2.誘導因素強烈刺激，隨機發(fā)生較弱刺激，非隨機發(fā)生3.生化特點4.形態(tài)變化6.DNA電泳5.炎癥反應7.凋亡小體8.基因調控被動過程，無新蛋白合成，不耗能主動過程，有新蛋白合成，耗能細胞結構全面溶解、破壞、細胞腫脹胞膜及細胞器相對完整細胞皺縮，核固縮彌散性降解，電泳呈均一DNA片狀DNA片段化（180-200bp），電泳呈“梯”狀條帶溶酶體破裂，局部炎癥反應溶酶體相對完整，局部無炎癥反應有病理性，非特異性生理性或病理性，特異性無有無第7頁，共32頁，2022年，5月20日，18點58分，星期五2細胞凋亡的流式檢測方法利用流式儀測定細胞光散射可對凋亡細胞進行分析凋亡早期細胞因體積減小，胞漿及染色質固縮，F(xiàn)SC變小，SSC增大凋亡晚期細胞FSC、SSC均變小壞死細胞則因細胞膜通透性改變，細胞腫脹，F(xiàn)SC、SSC變大，胞膜破裂，胞內含物釋出后FSC、SSC均變小。第8頁，共32頁，2022年，5月20日，18點58分，星期五

2.1PI單染檢測2.2AnnexinV/PI(7-AAD)雙染檢測2.3細胞內鈣離子測定2.4線粒體膜電位檢測2.5Caspases細胞酶的檢測2.6DNA碎片分析：Apo-BrdU2.7凋亡相關蛋白：Fas、Bcl-2、P532細胞凋亡的流式檢測方法第9頁，共32頁，2022年，5月20日，18點58分，星期五與細胞周期相同，利用PI染色，通過檢測DNA含量來同時判定細胞周期和凋亡。凋亡過程中，細胞內核酸酶釋放，細胞DNA發(fā)生有序降解，被降解的低分子量DNA片段從變性細胞膜（經(jīng)乙醇及透膜劑處理）漏出細胞外，使得凋亡細胞內的DNA含量減低，在流式細胞儀測定細胞DNA含量直方圖中G0/G1峰前可出現(xiàn)亞二倍體峰，即凋亡峰通過峰下的面積值可得出凋亡細胞在所測細胞群中所占的比率。2.1PI單染檢測第10頁，共32頁，2022年，5月20日，18點58分，星期五第11頁，共32頁，2022年，5月20日，18點58分，星期五PI單染色法的最大優(yōu)點在于獲得凋亡細胞百分數(shù)的同時可以與細胞周期中其他時相的細胞進行比較該法簡便、標本制備容易、檢測費用低缺點：PI單染色法無法確認來自哪一時相的凋亡，對于S期和G2/M期的細胞發(fā)生凋亡時，凋亡峰有時與G1峰或S峰相互重疊，導致G1峰或S峰增寬而無典型的sub-G1峰出現(xiàn)，所以無法分析來自S期或G2/M期細胞的凋亡，應借助其他方法進行檢測第12頁，共32頁，2022年，5月20日，18點58分，星期五磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine,PS）異位：正常情況下，PS位于細胞膜內層，細胞發(fā)生凋亡時PS從細胞膜內翻轉并暴露在細胞膜外層，是細胞發(fā)生凋亡的早期事件。

2.2AnnexinV/PI(7-AAD)雙染檢測第13頁，共32頁，2022年，5月20日，18點58分，星期五AnnexinV選擇性結合PS。用帶有熒光標記的AnnexinV，就可以用流式細胞儀非常簡單而直接地檢測到磷酯酰絲氨酸的外翻這一細胞凋亡的重要特征。PI(7-AAD)可以染色壞死細胞或凋亡晚期喪失細胞膜完整性的細胞，呈現(xiàn)紅色熒光。對于壞死細胞，由于細胞膜的完整性已經(jīng)喪失，AnnexinV可以進入到細胞漿內，與位于細胞膜內側的磷酯酰絲氨酸結合，從而也使壞死細胞呈現(xiàn)綠色熒光。

第14頁，共32頁，2022年，5月20日，18點58分，星期五此法簡單、可靠，由于凋亡時細胞膜的改變大大早于DNA的改變，因此AnnexinV/PI(或7-AAD)雙染色是檢測早期凋亡細胞的敏感方法。由于該法必須用活細胞，因此檢測時間受到限制，且對凋亡晚期細胞和壞死細胞無法準確區(qū)分。第15頁，共32頁，2022年，5月20日，18點58分，星期五Fluo-3-Am為新型的高度特異性Ca2+熒光指示劑，進入細胞后經(jīng)非特異性酯酶脫去Am酯，成為脂溶Fluo-3留在細胞內，當Fluo-3與胞內游離鈣結合后，其熒光強度是Fluo-3本身的40倍以上，當用480nm波長激發(fā)時，其熒光強度與游離鈣離子濃度成正比。Fluo-4將Fluo-3結構中的Cl替換成F，熒光強度比Fluo-3強1倍Fluo-4與鈣離子的親和力和Fluo-3近似，使用上和Fluo-3也基本相同，可以使用流式細胞儀檢測細胞內鈣離子濃度的變化。Fluo-4-AM是Fluo-4的乙酰甲酯衍生物，通過培養(yǎng)，能夠輕易進入細胞中。AM進入細胞后會被胞內酯酶所水解，產(chǎn)生的Fluo-4隨后會和鈣離子結合并發(fā)出熒光。2.3細胞內鈣離子測定第16頁，共32頁，2022年，5月20日，18點58分，星期五第17頁，共32頁，2022年，5月20日，18點58分，星期五JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位(mitochondrialmembranepotential)ΔΨm的理想熒光探針。線粒體膜電位較高時，JC-1聚集在線粒體的基質(matrix)中，形成聚合物(J-aggregates)，可以產(chǎn)生紅色熒光……正常細胞

線粒體膜電位較低時，JC-1不能聚集在線粒體的基質中，此時JC-1為單體(monomer)，可以產(chǎn)生綠色熒光……凋亡細胞

線粒體膜電位的下降是細胞凋亡早期的一個標志性事件。通過JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉變可以很容易地檢測到細胞膜電位的下降，同時也可以用JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉變作為細胞凋亡早期的一個檢測指標。2.4線粒體膜電位檢測第18頁，共32頁，2022年，5月20日，18點58分，星期五喜樹堿(CPT)誘導HL-60細胞凋亡，3小時后用JC-1檢測線粒體膜電位的改變。可見，凋亡細胞紅色熒光降低。第19頁，共32頁，2022年，5月20日，18點58分，星期五caspases家族在凋亡過程中起到非常重要的作用，其中caspases-3是最重要的指示蛋白酶。研究結果表明，caspases-3可在凋亡發(fā)生的早期被激活，激活的caspases-3繼而使其他caspases裂

解并被激活，同時還可激活細胞質和細胞核中的相關成分。

caspases-3的活性只有在凋亡的早期才能檢測到，隨后在凋亡的過程中持續(xù)升高，在凋亡的晚期快速下降。對caspases-3的連續(xù)監(jiān)測，可動態(tài)觀察凋亡的整個過程。2.5Caspases細胞酶的檢測第20頁，共32頁，2022年，5月20日，18點58分，星期五該法簡單、快速，但不適于常規(guī)多功能流式細胞儀(不具備紫外光源)的檢測。主要有Caspases-3流式細胞檢測試劑盒，Caspases-2/Caspases-4/Caspases-6/Caspases-7/Caspases-9等抗體第21頁，共32頁，2022年，5月20日，18點58分，星期五2.6DNA碎片分析：Apo-BrdU核酸內切酶活化使核小體內DNA斷裂為50~300kb片段，裂解為200bpDNA碎片，暴露出多個3’羥基末端。利用外源性TdT使外源性dUTP或

BrdUTP連接到DNA碎片的3'羥基末端。以熒光標記抗dUTP或抗BrdUTP抗體檢測dUTP或BrdUTP數(shù)量，從而間

接檢測凋亡加PI染色，在定量檢測凋亡細胞同時顯示凋亡細胞在細胞周期中所位置第22頁，共32頁，2022年，5月20日，18點58分，星期五在此法中，細胞固定先用甲醛，再用乙醇因為在凋亡細胞中可以檢測出兩群DNA：一群是低分子量的DNA(100~200bp)，彌散分布在凋亡細胞

另一群是高分子量的DNA或仍然黏附在核基質上的DNA，

乙醇固定后沖洗不能將其從細胞中洗去。第23頁，共32頁，2022年，5月20日，18點58分，星期五用樹堿(CPT)誘導HL-60細胞凋亡，0、120和150分鐘時用TUNEL(BrdUTP)/PI雙染法檢測DNA斷裂，同時分析細胞周期?？梢姷蛲鲭S著誘導時間的增加而增多，且可知凋亡發(fā)生的時相。第24頁，共32頁，2022年，5月20日，18點58分，星期五此方法靈敏度高、特異性好，目前己被廣泛采用。由于DNA斷裂發(fā)生在細胞凋亡的早期階段，先于其形態(tài)學上的改變，可用于早期凋亡的研究。通過與PI雙染色，克服了PI單染色法的缺點，可以鑒定細胞凋亡發(fā)生在細胞周期的具體時相。第25頁，共32頁，2022年，5月20日，18點58分，星期五2.7凋亡相關蛋白：Fas、Bcl-2、P53的檢測在細胞凋亡的研究中，要重視對凋亡相關蛋白的檢測，它們在特定的信號傳導通路中與啟動凋亡的信號分子相互作用。從凋亡的開始到凋亡的結束，許多信號傳導通路都需要或受到特定的蛋白間相互作用的調控。凋亡相關蛋白：主要有Apo-1(Fas)、FasL的相關抗體，Bcl-2相關檢測抗體、p53等調控凋亡的基因蛋白產(chǎn)物第26頁，共32頁，2022年，5月20日，18點58分，星期五注意事項有些蛋白存在于細胞膜表面，如Fas；有些則存在于胞質或細胞核內，如p53、bc1-2標本的處理方法不同破膜是關鍵，最佳的破膜既能使膜通透性增強，又能保持膜的完整性，使膜表面的抗原分子不被破壞。皂角素(saponin)是目前最佳的破膜劑，它優(yōu)于乙醇、甲醇和甲醛等。第27頁，共32頁，2022年，5月20日，18點58分，星期五3.細胞凋亡檢測面臨的問題3.1凋亡假陽性產(chǎn)生原因：PS外翻使凋亡細胞和凋亡小體容易被鄰近細胞所吸附并被吞噬吞噬細胞并非僅為專職的吞噬細胞(如單核和粒細胞)，成纖維細胞或上皮細胞也具吞噬作用。尤其是實體瘤，?？梢娫诘蛲黾毎車哪[瘤和非腫瘤細胞中有含有凋亡小體的吞噬體。

鄰近細胞吞噬凋亡細胞后的殘留物中即包含了變化的細胞膜、

斷裂DNA等凋亡特征物。即使很輕微處理（胰酶消化/機械振蕩/細胞刮取等）均會造成PS

的外翻。第28頁，共32頁，2022年，5月20日，18點58分，星期五3.2區(qū)分凋亡、壞死和凋亡的“壞死期”：產(chǎn)生原因：晚期凋亡與壞死相似

細胞膜破裂，用PI排染和AnnexinV結合實驗無法區(qū)分。胰酶消化時間過長、機械損傷(如細胞刮取、腫瘤細胞分

離或反復離心等)、電穿孔或某些藥物處理時，細胞膜的

通透性和對稱性均會改變。解決方法：形態(tài)學特征是區(qū)分凋亡和壞死的“金標準”。第29頁，共32頁，2022年，5月20日，18點58分，星期五3.3