土壤中分解尿素細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)知識(shí)清單土壤中分解尿素細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)知識(shí)清單土壤中分解尿素細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)知識(shí)清單xxx公司土壤中分解尿素細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)知識(shí)清單文件編號(hào)：文件日期：修訂次數(shù)：第1.0次更改批準(zhǔn)審核制定方案設(shè)計(jì)，管理制度第2課土壤中分解尿素細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)知識(shí)清單一、研究思路1．篩選菌株(1)實(shí)驗(yàn)室中微生物篩選的原理人為提供有利于________________生長(zhǎng)的條件(包括營(yíng)養(yǎng)、溫度、pH等)，同時(shí)________或________其他微生物生長(zhǎng)。(2)選擇培養(yǎng)基在微生物學(xué)中，將允許__________種類(lèi)的微生物生長(zhǎng)，同時(shí)________或________其他種類(lèi)微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，稱(chēng)做選擇培養(yǎng)基。(3)分離分解尿素的細(xì)菌的選擇培養(yǎng)基①在該培養(yǎng)基配方中，為微生物的生長(zhǎng)提供碳源的是____________，提供氮源的是________，瓊脂的作用是凝固劑。②該培養(yǎng)基對(duì)微生物具有選擇作用。其選擇機(jī)制是________________________________才能在該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。③土壤中的細(xì)菌之所以能分解尿素，是因?yàn)樗鼈凅w內(nèi)能合成________，將尿素分解的反應(yīng)式是________________________________________________________。Taq細(xì)菌能忍受93℃左右的高溫，是在美國(guó)黃石國(guó)家公園的一個(gè)熱泉中發(fā)現(xiàn)的，這說(shuō)明，在尋找目的菌株時(shí)，要根據(jù)____________________________________________。2．統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的方法(1)稀釋涂布平板法(也叫活菌計(jì)數(shù)法)①原理：當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)的一個(gè)菌落，來(lái)源于樣品稀釋液中的____________，通過(guò)統(tǒng)計(jì)平板上的________，就能推測(cè)出樣品中大約含有多少活菌。______________是成功地統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的關(guān)鍵。②操作第一，設(shè)置__________組，增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的說(shuō)服力與準(zhǔn)確性。將待測(cè)樣品經(jīng)一系列10倍稀釋?zhuān)缓筮x擇________稀釋度的菌液，分別取mL接種到已制備好的平板上，然后用無(wú)菌涂布器將菌液涂布整個(gè)平板表面，放在適宜的溫度下培養(yǎng)并計(jì)算菌落數(shù)。為使結(jié)果接近真實(shí)值，可將同一稀釋度涂布到三個(gè)或三個(gè)以上的平板上，培養(yǎng)并計(jì)算出__________。第二，為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在________的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，若設(shè)置的重復(fù)組中結(jié)果相差太遠(yuǎn)，意味著操作有誤，需重新實(shí)驗(yàn)。③計(jì)算公式：每克樣品中的菌株數(shù)＝×M，其中C代表___________________________，V代表________________________________(mL)，M代表____________。(2)設(shè)置重復(fù)和對(duì)照①設(shè)置重復(fù)：培養(yǎng)過(guò)程中應(yīng)設(shè)置重復(fù)組，同一稀釋度下應(yīng)涂布________個(gè)平板，才能增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的說(shuō)服力與準(zhǔn)確性。②設(shè)置對(duì)照：實(shí)驗(yàn)中應(yīng)設(shè)置對(duì)照，主要目的是排除________________________對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。如__________對(duì)照組，觀察培養(yǎng)物中是否有雜菌污染；設(shè)置________培養(yǎng)基，觀察選擇培養(yǎng)基是否具有________作用。二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)步驟1．土壤取樣：從肥沃、濕潤(rùn)的土壤中，用無(wú)菌小鐵鏟鏟去表層土3cm左右，迅速取土壤并裝入____________密封或事先準(zhǔn)備好的________中。2．制備培養(yǎng)基：①制備________________培養(yǎng)基作為對(duì)照組，尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基作為_(kāi)_______，用來(lái)判斷選擇培養(yǎng)基是否具有____________。②放寬稀釋范圍，如稀釋倍數(shù)為103～107范圍內(nèi)的要分別涂布，而每個(gè)稀釋度下需要______個(gè)選擇培養(yǎng)基、________個(gè)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，因此需要15個(gè)選擇培養(yǎng)基和5個(gè)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。③兩種培養(yǎng)基應(yīng)各有一個(gè)作為_(kāi)_______對(duì)照，此外還需準(zhǔn)備8個(gè)滅菌的試管和1個(gè)滅菌的移液管。3．樣品的稀釋與涂布平板：參考下面的實(shí)驗(yàn)流程示意圖，將10g土樣加入盛有90mL無(wú)菌生理鹽水的錐形瓶中(錐形瓶體積為250mL)，充分搖勻，吸取上清液1mL，轉(zhuǎn)移至盛有________mL生理鹽水的無(wú)菌大試管依次等比稀釋至107稀釋度，并按照由107～103稀釋度的順序分別吸取______mL進(jìn)行平板涂布操作。按照濃度從_____到______的順序涂布平板，不必更換移液管。說(shuō)明：圖中的1、2、3平板是____________，4為_(kāi)___________________作對(duì)照，判斷選擇培養(yǎng)基是否具篩選作用，還有兩個(gè)空白對(duì)照，即不涂布稀釋后菌液的選擇培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，驗(yàn)證培養(yǎng)基中是否____________。4．將涂布好的培養(yǎng)皿放在30℃溫度下培養(yǎng)，及時(shí)觀察和記錄。5．挑選選擇培養(yǎng)基上不同形態(tài)的菌落接入含____________培養(yǎng)基的斜面中，觀察能否產(chǎn)生顏色反應(yīng)。6．細(xì)菌的計(jì)數(shù)當(dāng)菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)，選取菌落數(shù)在________的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。在同一稀釋度下，至少對(duì)3個(gè)平板進(jìn)行重復(fù)計(jì)數(shù)，然后求出____________，并根據(jù)平板所對(duì)應(yīng)的稀釋度計(jì)算出樣品中細(xì)菌的數(shù)目。同時(shí)仔細(xì)觀察所分離到的菌落，并記錄菌落特征。7．統(tǒng)計(jì)表格注：一般來(lái)說(shuō)，在一定的培養(yǎng)條件下(相同的培養(yǎng)基、溫度及培養(yǎng)時(shí)間)，____________表現(xiàn)出________的菌落特征。三、操作提示1．取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的信封在使用前都要________。2．應(yīng)在________旁稱(chēng)取土壤。在火焰附近將稱(chēng)好的土樣倒入________中，塞好棉塞。3．在稀釋土壤溶液的過(guò)程中，每一步都要在________旁操作。4．實(shí)驗(yàn)時(shí)要對(duì)________做好標(biāo)記。注明________________________________________等。5．為了提高效率，在操作時(shí)更加有條不紊，應(yīng)當(dāng)________________。四、結(jié)果分析與評(píng)價(jià)五、課題延伸在細(xì)菌分解尿素的化學(xué)反應(yīng)中，細(xì)菌合成的________將尿素分解成了________。氨會(huì)使培養(yǎng)基的堿性增強(qiáng)，________升高。因此，我們可以通過(guò)檢測(cè)培養(yǎng)基____________來(lái)判斷該化學(xué)反應(yīng)是否發(fā)生。在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入________指示劑，培養(yǎng)某種細(xì)菌后，如果pH升高，指示劑將________，這樣，我們就可以準(zhǔn)確地鑒定該種細(xì)菌能夠分解尿素。知識(shí)清單一、1.(1)目的菌株抑制阻止(2)特定抑制阻止(3)①葡萄糖尿素②只有能夠以尿素作為氮源的微生物③脲酶CO(NH2)2＋H2OCO2＋2NH3它對(duì)生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找2．(1)①一個(gè)活菌菌落數(shù)恰當(dāng)?shù)南♂尪娶谥貜?fù)三個(gè)菌落平均數(shù)30～300某一稀釋度下平板上生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積稀釋倍數(shù)(2)①至少3②實(shí)驗(yàn)組中非測(cè)試因素空白完全篩選二、1.(1)無(wú)菌信封燒杯(2)①牛肉膏蛋白胨實(shí)驗(yàn)組選擇作用②31③空白(3)9低高