RNAExtractionProtocol實(shí)驗(yàn)原理異硫氤酸胍/苯酚法-----目前實(shí)驗(yàn)室使用的方法！?細(xì)胞在變性劑異硫氤酸胍的作用下被裂解，同時(shí)核蛋白體上的蛋白變性，核酸釋放?釋放出來(lái)的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分別位于整個(gè)體系中的中間相和水相，從而得以分離1.樣品裂解1.樣品裂解2.分離總RNA傳統(tǒng)方法：有機(jī)溶劑抽提，得率高柱純化法：純度高保存尸等體積異丙醇沉淀一向％乙醇洗滌沉淀一.晾干溶解疝RNARNA吸附柱一＞去蛋白液一＞漂洗柱純化法：純度高保存總RNA的純化及獲得實(shí)驗(yàn)試劑與器材2.1實(shí)驗(yàn)試劑RNA提取試劑Trizol(Invitrogen)、氯仿、異丙醇、75%乙醇、無(wú)水乙醇、DEPC水，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas),cDNA純化試劑盒(Promega)，末端加尾酶TdT(Thermo)。2.2實(shí)驗(yàn)器材微量移液器(Eppendorf),電泳儀，電泳槽，超凈工作臺(tái)，4°C低溫離心機(jī)(Eppendorf),常溫離心機(jī)(Eppendorf),勻漿機(jī)(IKA),高壓蒸汽滅菌鍋，通風(fēng)櫥，紫外分光光度計(jì)(Eppendorf),PCR儀(Takala)，剪刀，鑷子，0.2mL、1.5mL離心管，槍頭。實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備工作實(shí)驗(yàn)前將要用到的試劑配好(75%乙醇：75mL的無(wú)水乙醇+25mL的去離子水；DEPC水：在1000ml雙蒸水中加入DEPC原液1ml,然后搖勻過(guò)夜)，與離心管、槍頭、剪刀、鑷子(用DEPC水處理過(guò)的，浸泡過(guò)夜)一起滅菌(126C,90min),之后剪刀和鑷子最好在紫外燈下照射半小時(shí)。提前20min打開(kāi)低溫離心機(jī)預(yù)冷。準(zhǔn)備兩幅手套，一個(gè)口罩，塑膠手套不能離開(kāi)通風(fēng)櫥，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程盡量降低外源RNA酶對(duì)樣品中RNA的降解。實(shí)驗(yàn)步驟4.1取樣組織樣品：將組織在RNA保護(hù)液中用剪刀剪碎，每50?100mg組織加入1mlTRIzol，用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過(guò)TRIzol體積10%。貼壁培養(yǎng)細(xì)胞：不須消化，直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。細(xì)胞懸液：300?500g離心10min收集細(xì)胞，每5?10X106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1X107細(xì)菌細(xì)胞加入1mlTRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。RNA提取勻漿：取50?100mg保存在-80°C或保存在RNA保護(hù)液(RNAfixer，百泰克生物公司)中的組織加入800ulTrizol充分勻漿(勻漿機(jī)調(diào)到4或者5檔，一次5s，一共2~3次。勻漿的時(shí)候不要貼著管壁，盡量減少泡沫的產(chǎn)生)，每次勻漿完一個(gè)樣品要用沾有75%酒精的紙擦拭勻漿機(jī)的鉆頭。裂解：加入200ulTrizol，充分劇烈震蕩15s，在冰上靜置5min；4°C，12000g，離心10min。分離：將離心后的上清液轉(zhuǎn)移到另一離心管，加入250ul氯仿(動(dòng)作要快，氯仿見(jiàn)光分解)，劇烈震蕩30s，室溫放置3min；4C，12000g，離心15min。沉淀：將離心后的上清液轉(zhuǎn)移到另一離心管(注：切記不要吸到中下層溶液，寧可少吸一些上清)，加入500ul預(yù)冷的異丙醇(提前在冰上放置)，上下顛倒混勻，于-20C放置15min；4C，12000g，離心10min，棄異丙醇上清，收集沉淀。洗鹽：在收集的沉淀中加入1ml的75%乙醇(預(yù)冷，無(wú)RNase，優(yōu)級(jí)純，RNA提取專(zhuān)用)，上下顛倒混勻(4?5次)；4C，12000g，離心5min，吸出75%乙醇棄去，留下沉淀。保存：在沉淀中加入1ml無(wú)水乙醇，保存于-80C(一般最多可以保存1個(gè)月)。取出3?5ug(芝麻粒大小)保存于無(wú)水乙醇中的RNA,加入30ulDEPC水中，取2ulRNA用于瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性。取2ulRNA用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其A260值、A260/A280值。純凈的RNA的A260/A280應(yīng)在1.8?2.2之間。提完RNA后用酒精清洗勻漿機(jī)的鉆頭，擦干低溫離心機(jī)內(nèi)壁上的水，關(guān)閉電源。cDNA第一條鏈的合成使用Permentas的RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit(#K1622)試劑盒，按照使用說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行，具體如下：在0.2ml的PCR管中加入以下反應(yīng)體系：經(jīng)檢測(cè)合格的0.1ng-5ugRNA(RNA含量較低可以多管合在一起)，1ulOligo(dT)18Primer(0.5ug/ul)，無(wú)RNase的水至12ul，輕微均勻，簡(jiǎn)單離心，65C孵育5min。反應(yīng)結(jié)束后至于冰上冷卻2min；然后按順序加入5XReactionBuffer4ul，RNA酶抑制劑(20U/ul)1ul,10mMdNTPMix2ul,M-MuLVReverseTranscriptase(200U/ul)1ul,使總體積達(dá)到20ul,輕輕混勻，然后離心(掌上離心機(jī)離心8s，將PCR管壁沾染的液體甩凈)，42°C反應(yīng)60min,70°C溫育5min以滅活M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶。對(duì)于隨機(jī)引物擴(kuò)增的cDNA加入上述體系后，先25C,5min.然后42C,60min；70C,5min滅活M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶。擴(kuò)增基因的3’端可以用Oligo(dT)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，擴(kuò)增基因的5’端可以用隨機(jī)引物或者5’RACE特異性引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。注：對(duì)于GC含量較高的模板，反應(yīng)溫度可以升高到45C。4.4cDNA第一條鏈的純化使用Promega的WizardSVGelandPCRClean-UpSysterm(USA,Lot295687)試劑盒，按照使用方法進(jìn)行，具體如下：向PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入20ul(等體積)的MembraneBindingSolution將收集柱插入收集管中，將上述PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到收集柱中，室溫下孵育1min,16000g離心1min，棄收集管中的廢液，將收集柱重新插入收集管中。在收集柱中加入700ul的MembraneWashSolution，16,000g離心1min，棄收集管中的廢液，將收集柱重新插入收集管中。在收集柱中加入500ul的MembraneWashSolution，16,000g,離心5min。將收集管中的廢液棄去，將收集柱重新插入收集柱中再次離心1min，打開(kāi)收集柱的蓋子，使MembraneWashSolution揮發(fā)掉。輕輕將收集柱轉(zhuǎn)移到一個(gè)滅菌的1.5ml離心管中，在收集柱中加入50ul無(wú)核酸酶的蒸餾水中，室溫孵育1min,16,000g離心1min,棄收集管，將收集液保存在-20C,留待cDNA3’末端添加PolyC。4.5純化的cDNA3'末端添加PolyC0.2mlPCR管中加入如下反應(yīng)體系：2ul滅菌雙蒸水，4ul5XTdTBuffer,2.5uldCTP(2mM),10ul純化的反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA第一條鏈，1.5ul末端轉(zhuǎn)移酶(Thermo,USA),終體積20ul?；旌暇鶆颍?jiǎn)單離心后，37C反應(yīng)15min，最后70C,10min使末端轉(zhuǎn)移酶失活。產(chǎn)物可以用來(lái)后續(xù)基因的5’RACE擴(kuò)增。ABI7300/7500system熒光定量PCR操作流程實(shí)驗(yàn)原理所謂的實(shí)時(shí)熒光定量PCR就是通過(guò)對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)檢測(cè)從而實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板定量及定性的分析。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)中，引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣我們就可以通過(guò)熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線(xiàn)圖（如下圖）。1D152Q253Q35-1E循環(huán)效一般而言，熒光擴(kuò)增曲線(xiàn)擴(kuò)增曲線(xiàn)可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段，熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，我們無(wú)法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺(tái)期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加。PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒(méi)有線(xiàn)性關(guān)系，所以根據(jù)最終的PCR產(chǎn)物量不能計(jì)算出起始DNA拷貝數(shù)。只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段，PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線(xiàn)性關(guān)系，我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念：熒光閾值和CT值。熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線(xiàn)上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，但一般我們將熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被

稱(chēng)為CT值(thresholdvalue)。CT值與起始模板的關(guān)系研究表明，每個(gè)模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線(xiàn)性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，CT值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代表Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的化學(xué)原理包括探針類(lèi)和非探針類(lèi)兩種，探針類(lèi)是利用與靶序列特異雜交的探針來(lái)指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，非探針類(lèi)則是利用熒光染料或者特殊設(shè)計(jì)的引物來(lái)指示擴(kuò)增的增加。前者由于增加了探針的識(shí)別步驟，特異性更高，但后者則簡(jiǎn)便易行。SYBRGreen只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光，變性時(shí)，DNA雙鏈分開(kāi)，無(wú)熒光相對(duì)定量分析用來(lái)測(cè)定一個(gè)樣本中目的基因與內(nèi)參基因（持家基因，比如B-actin，18SrRNA）的相對(duì)變化變化，因?yàn)樗鼈兊谋磉_(dá)水平趨于相對(duì)穩(wěn)定。結(jié)果用RQ值來(lái)表示。7300/7500PCR儀系統(tǒng)軟件只使用比較法（CT）來(lái)計(jì)算核酸序列的相對(duì)定量結(jié)果。即RQ值=2A-A△Ct，其中△△Ct=［（待測(cè)組目的基因平均Ct值-待測(cè)組內(nèi)參基因平均Ct值）-（對(duì)照組目的基因平均Ct值-對(duì)照組內(nèi)參基因平均Ct值）］操作之前的準(zhǔn)備：1：提RNA,逆轉(zhuǎn)錄，用普通PCR檢測(cè)引物，PCR反應(yīng)的體系和條件除了引物加0.5ul,其它的與基因克隆的一樣。2：內(nèi)參基因的選擇：多數(shù)物種一般以Betaactin和18SRNA基因?yàn)閮?nèi)參。可參照前人的序列（文獻(xiàn)中有報(bào)道的）。其中貽貝18SRNA的序列是參考Cuberoandcolleagues（2012）的序列。3：加樣可總結(jié)為三個(gè)詞：快，準(zhǔn)，輕柔，無(wú)污染。操作時(shí)帶手套，在96孔板中操作。加好樣定量膜要壓實(shí)，且不能用手直接碰，避免影響后續(xù)熒光的吸收。軟件操作先做擴(kuò)增曲線(xiàn)，等反應(yīng)結(jié)束后再做熔解曲線(xiàn)（7500system要分開(kāi)做，7300system可以將熔解曲線(xiàn)添加到擴(kuò)增曲線(xiàn)后面一起做）。2.1擴(kuò)增曲線(xiàn)的操作選擇File（文件）＞New（新建）。從Assay（實(shí)驗(yàn)）下拉列表中，選擇RelativeQuantification（ddCt）Plate（相對(duì)定量（ddCt）反應(yīng)板），然后單擊Next＞（下一步＞）。

將所要檢測(cè)的基因名添加到反應(yīng)板文件中，然后單擊Next>（下一步>）。（如果沒(méi)有所要的基因名字，可以選擇Newdetector新建一個(gè)基因名）

然后為每個(gè)反應(yīng)孔指定基因和任務(wù)，把內(nèi)參基因的特征改為ENDO（作為校正）然后單擊Finish（完成）。NewDocumentWizardSetUpSamplePlateSetuptlieE：dinpleplatewithtasks:iinlletectors.UseDetectorReporterQuericherTaskColorrISsRNASYBR(none)Target1M48SYBR(none)Target＜上一步（B）|下一步QT]:完成|取消|在WellInspector（反應(yīng)孔設(shè)定）窗口（依次選擇View（視圖）＞W(wǎng)ellInspector（反

應(yīng)孔設(shè)定））中，輸入樣本名（如果較多，也可以先不設(shè)置，等實(shí)驗(yàn)結(jié)束后在再自己的電腦上進(jìn)行設(shè)置）打h選擇Instrument（儀器）選項(xiàng)卡。默認(rèn)情況下，顯示兩步法反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）方法中PCR步驟的標(biāo)準(zhǔn)PCR條件。也可以根據(jù)自己的基因引物的最適條件相應(yīng)的做出更改調(diào)整。設(shè)置程序：95°C10min；95°C15s,60°C20s,68°C35s,40個(gè)循環(huán)（參照天根試劑盒的說(shuō)明），選擇20ul體系進(jìn)行擴(kuò)增，選擇step3進(jìn)行Datacollectiono

選擇File（文件）＞SaveAs（另存為），輸入相對(duì)定量反應(yīng)板文件的文件名，然后單擊Save（保存）。將反應(yīng)板裝入儀器中。單擊Start（開(kāi)始）。＜上一步（B）|下一步QT]:打h選擇File（文件）＞SaveAs（另存為），輸入相對(duì)定量反應(yīng)板文件的文件2.2.熔解曲線(xiàn)的操作擴(kuò)增曲線(xiàn)結(jié)束后繼續(xù)做熔解曲線(xiàn)分析，打開(kāi)7500system，新建new,選擇Discusion,。

選擇要做定量的基因，對(duì)96孔板中每個(gè)樣進(jìn)行基因的選定，不需要對(duì)每個(gè)樣進(jìn)行命名，所有的和擴(kuò)增曲線(xiàn)的對(duì)應(yīng)即可。然后在Instrument選擇20ul體系進(jìn)行擴(kuò)增保存文件。Start，大概需要運(yùn)行37分鐘。

袖辯詢(xún)鬼分析，單一蜂無(wú)非特異柱捷無(wú)，定量融群曲洗分哲，出現(xiàn)奈峰其他產(chǎn)漏出為葬技丹挫捷光1,因此定星不準(zhǔn)確2.3結(jié)果分析選擇File（文件）＞New（新建）。從Assay（實(shí)驗(yàn)）下拉列表中，選擇S3RelativeQuantification（ddCt）Study（相對(duì)定量（ddCt）研究），然后單擊Next＞（下一步＞）。袖辯詢(xún)鬼分析，單一蜂無(wú)非特異柱捷無(wú)，定量融群曲洗分哲，出現(xiàn)奈峰其他產(chǎn)漏出為葬技丹挫捷光1,因此定星不準(zhǔn)確S3NewDocumentWizardDefineDocwientDefineDocwientSelecttheassay.,corLtairLer,andtemplateforthedo>210111ent,:±ndentertheoperatorn：djrie:aridconirrients.單擊Add（添加），將反應(yīng)板添加到研究中，然后單擊Open（在一個(gè)RQ研究中，可添加最多10個(gè)相對(duì)定量反應(yīng)板。）。單擊Finish（完成）。使用AutoCt（自動(dòng)Ct）選項(xiàng)設(shè)置反應(yīng)參數(shù)（口）并分析數(shù)據(jù)。如果知道所作實(shí)驗(yàn)的最佳基線(xiàn)和閾值設(shè)置，可選擇ManualCt（手動(dòng)Ct）和ManualBaseline（手動(dòng)基

線(xiàn)）選項(xiàng)。Ansl^isSertings-ddCtStudy單擊或選擇Analysis（分析）＞Analyze（執(zhí)行分析）以再次分析數(shù)據(jù)。在RQResults（相對(duì)定量結(jié)果）窗口中單擊一個(gè)選項(xiàng)卡，以查看分析結(jié)果。如果需要，保存此相對(duì)定量研究（RQStudy）文件。LightCycler480熒光定量PCR儀操作規(guī)程基本操作樣本處理，在PCR實(shí)驗(yàn)室的樣本處理區(qū)進(jìn)行，可使用各種符合各實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊蟮姆椒ㄟM(jìn)行提取核酸的處理。實(shí)驗(yàn)員必須戴上一次性PE手套、口罩和帽子，穿上該處理區(qū)的白大褂。將提取的核酸溶液通過(guò)傳物通道轉(zhuǎn)移至PCR實(shí)驗(yàn)室的試劑配制區(qū)，進(jìn)行試劑盒的配液和加樣操作。在操作過(guò)程中，切忌戴乳膠手套接觸光學(xué)透性封板膜。試劑加完樣，封膜完畢后，在板式離心機(jī)中1500Xg(3000rpm)離心兩分鐘，以排除氣泡。1.4.打開(kāi)總電源，打開(kāi)LightCycler480儀器后方的電源開(kāi)關(guān)，然后打開(kāi)連接LightCycler480熒光定量PCR儀的電腦，并打開(kāi)LightCycler480Software軟件，此時(shí)儀器會(huì)在與電腦軟件接通后進(jìn)行自檢，儀器正面右邊兩盞桔黃色的燈會(huì)閃爍。自檢完畢后，左邊的燈會(huì)變綠，右邊的燈仍為桔黃色。這時(shí)按一下燈右邊帶雙箭頭的開(kāi)關(guān)，儀器的載板器會(huì)自動(dòng)伸出，將準(zhǔn)備好的反應(yīng)板放入載板器中(反應(yīng)板的切角方向應(yīng)與載板器的切角方向相應(yīng)才能將反應(yīng)板正確放入，切勿用裸手接觸反應(yīng)板的光學(xué)透性封板膜)。再按一下帶雙箭頭的開(kāi)關(guān)，儀器的載板器會(huì)自動(dòng)縮入儀器內(nèi)，此時(shí)儀器能自動(dòng)檢測(cè)到反應(yīng)板，原來(lái)呈桔黃色的燈會(huì)變綠，LightCycler480Software中StartRun按鈕也同時(shí)變?yōu)榧せ顮顟B(tài)。1.5.設(shè)定完實(shí)驗(yàn)程序并編輯完樣本后，點(diǎn)擊軟件中StartRun按鈕，運(yùn)行實(shí)驗(yàn)。.軟件界面上出現(xiàn)RunComplete-.標(biāo)識(shí)時(shí)，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)運(yùn)行完畢，按一下儀器上帶雙箭頭的按鈕，使載板器伸出，取下反應(yīng)板，再按一下帶雙箭頭的按鈕，使載板器縮回，關(guān)閉LightCycler480儀器后方的電源開(kāi)關(guān)，在電腦上分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。.分析完實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)后保存結(jié)果，打印報(bào)告，并關(guān)閉電腦，關(guān)閉總電源。實(shí)驗(yàn)員在離開(kāi)PCR擴(kuò)增區(qū)時(shí)帶走用完的反應(yīng)板。儀器維護(hù)LightCycler480是一臺(tái)免維護(hù)的儀器。做任何維護(hù)工作前，須確認(rèn)主機(jī)電源已被關(guān)閉。預(yù)防性維護(hù)：1.檢查L(zhǎng)ightCycler480主機(jī)兩側(cè)與背后空間，確保無(wú)任何阻礙空氣流通的物品，包

括書(shū)本、紙張或其他任何物品；若主機(jī)表面和桌面有灰塵，用不起毛的軟布蘸少量清水擦拭干凈。清潔性維護(hù)：若有需要，可用性質(zhì)溫和的商品化清潔劑或70%的乙醇溶液對(duì)LightCycler480主機(jī)表面、熱循環(huán)96孔模塊和熱蓋進(jìn)行清潔。清潔96孔熱循環(huán)模塊：用移液器移取125ul70%乙醇溶液或異丙醇至所有孔內(nèi)；15分鐘后，使用移液器對(duì)孔內(nèi)溶液進(jìn)行多次吹洗；移除孔內(nèi)的液體，并使96孔模塊孔內(nèi)自然風(fēng)干；注意操作時(shí)不要讓清洗液腐蝕熱循環(huán)模塊的涂層。軟件操作3.1啟動(dòng)軟件開(kāi)啟計(jì)算機(jī)，并以正確的使用者名稱(chēng)與密碼登入Windowso開(kāi)啟LightCycler480軟件，并輸入正確的使用者與密碼。Username:adminPassword:LightCycler480

3.2軟件設(shè)定?-開(kāi)啟新實(shí)驗(yàn)設(shè)定新實(shí)驗(yàn)1.軟件開(kāi)啟后，會(huì)進(jìn)入主畫(huà)面。點(diǎn)選“NewExperiment”。出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)設(shè)定窗口。任何時(shí)候需要回主畫(huà)面的話(huà)，點(diǎn)選畫(huà)面右邊的按鈕。Pr蜘細(xì)HaiitieT-ampsirElurfi-TarocHE，L娘nt匚Vt!舊此4盼Sdl^are佗.國(guó)軸E2.U.0625■0-u._tiiPr蜘細(xì)HaiitieT-ampsirElurfi-TarocHE，L娘nt匚Vt!舊此4盼Sdl^are佗.國(guó)軸E2.U.0625■0-u._tii_i.ftWlnrlaw:|NewE>perimen4日1Databau:UyCompulE-r(Tracaabla^,.|UsiarSybusmAnuninRunfjatesRea-ctioviL.i圭|PragiErns1.在實(shí)驗(yàn)設(shè)定畫(huà)面上方，先選擇適當(dāng)?shù)腄etectionFormat。選項(xiàng)包含:DetectionFormatFilterCombinationExcitationEmissionNameFilterFilterSYBRGreen1SYBRGreen1483533SimpleProbeSimplePtobe483533MonoColorFAM483533HydrolysisPtobeMultiColorHydrolysisCyan500450500ProbeFAM483533Hex523568Red610558610Cy5615670MonoColorHybProbeRed640483640MultiColorHybProbeFinos483533Red610483610Red640483640Cy5483670另外可再點(diǎn)選“Customize勾選所需的濾片組合。2.輸入反應(yīng)體積:96wellplate范圍為10-100ul，而384wellplate范圍為5-20ul。Anal拙igUodQCyclesHeltinffCarvesAnal拙igUodQCyclesHeltinffCarves3.設(shè)定實(shí)驗(yàn)步驟(Program)?設(shè)定program，包含有Pre-incubation,Amplification(PCR),Meltingcurve(optional)與Cooling。利用『+』與『一』增加或刪除步驟。?設(shè)定循環(huán)數(shù)目(Cycle)與分析模式。通常Amplification(PCR)program設(shè)定成『Quantification』，而MeltingCurveprogram設(shè)定成『MeltingCurveJ。4.設(shè)定詳細(xì)溫度變化(依照不同實(shí)驗(yàn)方法與設(shè)計(jì)而有所不同)ProgramMam@CyclesAnalysislnlLla.1denaLiLEaLloDNone?己丑011.工［二3匚2011)7:QuaDLiricaLlon?neltingcnive2上MeIcingCurvesTcoDlingNon=TampOfic^tionTemperatureTargetsTarget(*CJAcquisitionModeHold(hh;mnn：3s|RampRate『C閭Acquishions(peraC}SecTarget(^C)StepSitefCJStepDelay{cycles}Noreao：ao：ia馬日▲*司o—j三o』Nore□c：QQ：ia司|oDVQ于|?2:Single□o：oo：ia~t\o0T0:?點(diǎn)選各個(gè)program即可設(shè)定詳細(xì)溫度變化步驟，請(qǐng)根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)來(lái)設(shè)定，利用『+』與『一』增加或刪除步驟。需要設(shè)定的參數(shù)包含Target(°C)目標(biāo)溫度，AcquisitionMode(熒光偵測(cè)模式)，Hold(hh:mm:ss)停留時(shí)間。RampRate(C/s)為升降溫速度，范圍如下：RampRate(C/s)HeatingupCoolingdown96-wellBlock1.0-4.4C/s1.0-2.2C/s384-wellBlock1.0-4.8C/s1.0-2.5C/s若設(shè)定溫度低于50C，請(qǐng)把RampRate調(diào)整成1.5C/s(96well)或2.0C/s(384well)。

將實(shí)驗(yàn)步驟儲(chǔ)存成『Template』以便下次進(jìn)行套用。點(diǎn)選左下角“SaveAsTemplate'9即可把此步驟儲(chǔ)存起來(lái)。若要進(jìn)行套用時(shí)，請(qǐng)直接點(diǎn)選窗口左下角“ApplyTemplate"，選擇欲套用之實(shí)驗(yàn)步驟即可。7.設(shè)定完成后點(diǎn)選“StartRun"開(kāi)始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。8.跳出檔案儲(chǔ)存窗口，請(qǐng)輸入欲儲(chǔ)存之文件名稱(chēng)。?實(shí)驗(yàn)進(jìn)行中會(huì)進(jìn)入另一個(gè)Data窗口，窗口下方按鍵功能如下:EndProgram:結(jié)束此Program,進(jìn)入下一個(gè)Programo+10Cycles:實(shí)時(shí)增加循環(huán)數(shù)目。AbortRun:馬上結(jié)束此實(shí)驗(yàn)，請(qǐng)注意，若按此鍵，則此次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果將不儲(chǔ)存。

將樣品分群點(diǎn)選窗口左邊的“SubsetEditor”。點(diǎn)選“New”新增新的群組，并將其命名。利用鼠標(biāo)選取此群組之樣品位置，點(diǎn)選窗口右下角“Apply”，此時(shí)被選取的樣品位置會(huì)呈現(xiàn)實(shí)心的藍(lán)色，如下圖。-SubtleIDNaiuw以此方式依序?qū)⑺袠悠啡航M編輯完畢。-SubtleIDNaiuw樣品必須分群才能夠獨(dú)立分析，但是樣品是否分群并不影響樣品的Cp值。

編輯樣品名稱(chēng)Window:|NewExperiment點(diǎn)選窗口左邊的“SampleEditor”。輸入每個(gè)位置之樣品名稱(chēng)(Name)與重復(fù)(Repl.Of)。Selii|)DdlSCtidilFormatIsybrGree^IRunEratocolWindow:|Sub&et編輯樣品名稱(chēng)Window:|NewExperiment點(diǎn)選窗口左邊的“SampleEditor”。輸入每個(gè)位置之樣品名稱(chēng)(Name)與重復(fù)(Repl.Of)。Selii|)DdlSCtidilFormatIsybrGree^IRunEratocolWindow:|Sub&etEditor/sample,vlColorPqsNBroeSub&Q[EditorSamples111r17norn1=AbsQuantColorComp|Genotyping|RgIQuant|TmCalling|SetucTest-X：ID|LotID|ColorCompID|PosSampleNameRepLOfSubsetSampletlateSampleID41Sample1<2Sample2i3Sainiple3■1Sample*3-■155-5anple647Sample11詛Sawlc0noAlSai^le1A2SAmcile2ScloctcdFilt&rCombinations409-532Window:|NewExperimentSelectedFilteiCombinations4S3-533SainplesIR?若A1,A2與A3為三重復(fù)，在A2與A3Repl.Of字段上都填上A1即為三重復(fù)。SelectedFilteiCombinations4S3-533SainplesIR?在編輯過(guò)程中，可利用『Ctr1』+『C』復(fù)制文字，『Ctrl』+『V』貼上文字。

4.根據(jù)實(shí)驗(yàn)分析模式，編輯AbsQuant(絕對(duì)定量)，RelQuant(相對(duì)定量)，或Genotyping分頁(yè)，設(shè)定SampleType。絕對(duì)定量(AbsQuant)：SwpleType■Unkinown■UnkrLO'wrLStandard.『Unknown』：未知濃度樣品『Standard』：已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)定量(RelQuant)：etUnknoDin▼TargetUnknownTargetCalibratorTargetStandardUnknownCalibratorStandardNegativeTargetMegativeReferenceRefEreiiceFe￡efen.ceReferenceJ.■_<J_■_!_■I_>『Target』：目標(biāo)基因『Reference』：參考基因『Calibrator』：Control樣品FStandard』：已知濃度的樣品『Unknown』：未知濃度樣品若設(shè)定成IStandard』之樣品請(qǐng)輸入濃度。UnknownCalibratorStandardNegative若想要將此樣品編輯儲(chǔ)存成Template，可點(diǎn)選窗口左下角“SaveAsTemplate”即可，下次實(shí)驗(yàn)時(shí)可點(diǎn)選“ApplyTemplate”進(jìn)行套用。HApplyHTemplate!3ISaveAs[Template」3.4.結(jié)果分析點(diǎn)選左邊的“Analysis”，選取分析模式，并選擇所需分析之群組，如下圖：LZJLZJLi.llbl'CTthr'MMfalhnuEnLcia1SIIJFASLZJLZJAJmlh凸nN霽7ILBW-■Cl-A.lia3W血|Ahh版全ndD?myi■頊iEilk|凸nN霽7ILBW-■Cl-A.lia3W血|Ahh版全ndD?myi■頊iEilk|￡biff學(xué)dOsm/Ti.?Fgii切Col^rCoHpeiwariQXia^xiTiifl>jGaeMyP1JJ3Ha:l*mw11lusEi□:nTnliLL3ngCraal!i9E￥uulgaS?bidl2.ANipJl-T^pq-+|Aba'JUHn-t-'ZHd.[vflybe.*|AH佻5虹L.mplw加底：SupgL;L辛|削si知皿以鹽nd.氐clHElwH序x:CueJU】HMiA:??!■3.分析模式說(shuō)明AbsQuant/2ndDerivativeMax絕對(duì)定量（自動(dòng)法）絕對(duì)定量（手動(dòng)法）AbsQuant/FitPoints

ColorCompensationGeneScanning色差校正（多色實(shí)驗(yàn)校正用）基因掃描（適用于HighResolutionMeltingCurve,HRM分析）基因分型（適用于HybProbe之Genotyping基因分型實(shí)驗(yàn)）RelativeQuantification相對(duì)定量TmCallingTm分析絕對(duì)定量(AbsoluteQuantification)絕對(duì)定量（自動(dòng)法）絕對(duì)定量（手動(dòng)法）ColorCompensationGeneScanning1.點(diǎn)選下方的“Calculate”即可得到樣品之Cp與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。irt^irawifeill:ViirBuifilOJghtC|Rdlar4^D3E4*INoGQMHririsctadMndow：Ip^mov^ijhSYBRGreenI(1J己|fr：irt^irawifeill:ViirBuifilOJghtC|Rdlar4^D3E4*INoGQMHririsctadMndow：Ip^mov^ijhSYBRGreenI(1J己|fr：嶼Campuln-rfTr?c制由白I咽]iE^emAdmin,|g|x|Unknawjib前舊犧e等Cniei3it/2ndDerivativeKa.?forSt-nndeitTiEandEiiqeOJTl^EfYkW^j1.33S,Apflyw/LtoesCalculafeFillerCortib^'CtitaCtitiji力」23.33i網(wǎng)餉-I1.K1-a.35i24Ba1012Hiaig202224ffi2S30323t3^0^StdOifve*[InnmjS/X：各個(gè)樣品之Cp值與濃度重復(fù)樣品平均后之Cp值與濃度，并自動(dòng)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差2.數(shù)值之?dāng)?shù)據(jù)輸出：在數(shù)值分析表上按鼠標(biāo)右鍵，點(diǎn)選“Export”即可輸出成.txt檔案格式?？芍苯右訫icrosoftExcel軟件開(kāi)啟。形檔案格式。3.圖形輸出：在圖形上按鼠標(biāo)右鍵，點(diǎn)選“Export”即可輸出成各種圖形檔案格式。iStdCuive(Inrun)01Std€uive|(Eg『麗1)1■L4J!HSave踮&^Kt^rnalj4.標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)儲(chǔ)存：點(diǎn)選窗口下方StdCurve之“Saveasexternal”，輸入適合檔名后即可儲(chǔ)存在數(shù)據(jù)庫(kù)中。相對(duì)定量(RelativeQuantification)在選擇相對(duì)定量分析后，出現(xiàn)下面窗口:?ReferenceSampleLocation:若Reference(Housekeepinggene)之樣品在同一盤(pán)上請(qǐng)選擇“In-Run”，否則請(qǐng)選擇“External”可輸入另一次實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)一起分析。?建議將AutoPair打勾讓計(jì)算機(jī)自動(dòng)將樣品配對(duì)。2.進(jìn)入『Target』與『Reference』分頁(yè)，右下角顯示“Eff=2”表示將目標(biāo)基因與參考基因的PCR效率以2.0來(lái)計(jì)算。3.若需要校正目標(biāo)基因與參考基因之PCR效率，則需要輸入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。在『Target』與『Reference』分頁(yè)之右下角，輸入（import）標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。Eff=20UseinrunUseexleiSavemexternal...Usein①^輸入（import）同一盤(pán)上之標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。Useexternal：輸入（import）之前已儲(chǔ)存于數(shù)據(jù)庫(kù)中之標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。點(diǎn)選『Pairing』分頁(yè)，檢查計(jì)算機(jī)自動(dòng)配對(duì)結(jié)果是否正確。其中，紅色表示Unknown樣品，綠色表示Calibrator樣品。若欲外加配對(duì)，則可直接以鼠標(biāo)點(diǎn)選樣品后按“Add”即可增加配對(duì)。點(diǎn)選『Results』分頁(yè)，點(diǎn)選“Calculate,’即可得到計(jì)算結(jié)果。

[ir^riimFRint^hrlualLlqhlCycIsrISO3H4『Nd1Comii藩d:田日D曰繇生Comply1:(Tracu^blD-)三|Usrr:鈕世eiAdmin..環(huán)■Ccrwritr-atai[ir^riimFRint^hrlualLlqhlCycIsrISO3H4『Nd1Comii藩d:田日D曰繇生Comply1:(Tracu^blD-)三|Usrr:鈕世eiAdmin..環(huán)■Ccrwritr-atai|Ehnni(i[Rrill(^uandInfforraatinapEamparuHtL-an:0￡￡￡■f-hx-hiv=hEKpncimnt:IncanTranpei^|A^rBiicGiPalnrbg|CtiartsL....R?taIlIbesudtsetS-nnijili!TypePgSajrifilE-NsunrCpLancB-nrirariltiriinEein^radgi!HsarmalEredBonim-aEzB-dlsildplicariicn.i'CtiiiEcliii■*■訪(fǎng)初ms偵TargetC9.11011^tELmrafcDT30.07□.DZ4.33E-Ele￡ei:eiiCECPllj