分子生物學(xué)復(fù)習(xí)提綱H克隆載體H1質(zhì)粒載體的設(shè)計(jì)1、線性載體片段自身環(huán)化所形成空質(zhì)粒載體。自環(huán)化載體可以通過(guò)轉(zhuǎn)化克隆中銷量提取質(zhì)

粒，然后進(jìn)行酶解以及隨后的瓊脂糖凝膠電泳分析，但是不方便進(jìn)行大規(guī)模篩選。2、pBR322是最早開發(fā)出來(lái)的質(zhì)粒載體，其包含兩個(gè)抗生素基因，如果目的DNA片段插入到這兩個(gè)基因的任意一個(gè)編碼區(qū)內(nèi)，就會(huì)發(fā)生插入失活，繼而可以通過(guò)由轉(zhuǎn)化子所顯示的抗生素抗性來(lái)鑒定重組體。3、通過(guò)在轉(zhuǎn)化和鋪板的操縱中對(duì)于不同抗生素敏感性的菌株來(lái)進(jìn)行重組型檢測(cè)，過(guò)程較常規(guī)。4、藍(lán)白斑篩選（重點(diǎn)）：利用一種藍(lán)色化合物的形成作為指示劑，在此情況下失活的基因是lacZ,which編碼B-半乳糖苷酶，受乳糖啟動(dòng)子的調(diào)控。當(dāng)大腸桿菌表達(dá)lac阻抑物的時(shí)候，載體上的lacZ基因由IPTG（異丙基-B-D-硫代半乳糖昔）誘導(dǎo)表達(dá)，形成的酶可以利用底物（X-gal）形成一種藍(lán)色化合物。但如果重組質(zhì)粒中的lacZ位點(diǎn)發(fā)生了插入失活，那么就不能形成藍(lán)色菌落。具體操作見書上92頁(yè)。5、多克隆位點(diǎn)，第一個(gè)部分有多個(gè)限制酶酶切位點(diǎn)，這一個(gè)區(qū)域稱作MCS（藍(lán)色斑就是沒有插入片段，白色斑就是插入片段。）目的DNA的插入在這些多克隆位點(diǎn)中的任意一個(gè)位點(diǎn)或者兩個(gè)位點(diǎn)之間，都會(huì)使lacZ'基因失活，并且在適宜的平板上產(chǎn)生白色菌落。所以MCS讓選擇位點(diǎn)用于克隆的限制酶有一定的靈活性。6、pUC載體附近有啟動(dòng)子，所以可以用來(lái)轉(zhuǎn)錄插入的DNA，從而可以表達(dá)插入基因的表達(dá)效果。7、為了表達(dá)插入的目標(biāo)基因，需要有相同定位（和lacZ‘基因）的可讀框，并且是連續(xù)不間斷的，這樣在表達(dá)之后就會(huì)產(chǎn)生融合蛋白。H2噬菌體載體1、侵染大腸桿菌的人噬菌體可以用作科倫載體，噬菌體顆粒將他的線性DNA注入細(xì)胞，DNA從而連成環(huán)狀然后DNA復(fù)制組裝成噬菌體顆粒并且隨細(xì)胞裂解釋放到細(xì)胞外面，造成細(xì)胞死亡（裂解期），但如果是通過(guò)特異性位點(diǎn)進(jìn)行整合進(jìn)宿主基因組，就可以進(jìn)行長(zhǎng)期的插入表達(dá)（溶原性方2、為了防止片段之間相互連接可以用堿性磷酸酶進(jìn)行處理，目標(biāo)是為了入臂和目的片段在較高的濃度下進(jìn)行相互連接，形成較長(zhǎng)的線性產(chǎn)物。3、相對(duì)于利用質(zhì)粒的方法轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，利用噬菌體顆粒的侵染性：在DNA文庫(kù)的構(gòu)建方面有更有效的利用，入基因在體內(nèi)復(fù)制產(chǎn)生多拷貝的人基因線性分子并且這些多聯(lián)體在cos位點(diǎn)處切開，產(chǎn)生單個(gè)的人基因組，再包裝進(jìn)噬菌體顆粒。其中：噬菌體外殼蛋白以及噬菌體DNA加工酶的混合液被稱作包裝提取液，而包裝提取液可以感染不同的包裝缺陷型（突變。4、利用瓊脂平板上進(jìn)行連續(xù)菌苔的細(xì)胞涂布，由于反復(fù)感染和細(xì)胞的裂解循環(huán)，會(huì)形成空白區(qū)域也就是噬菌斑。which類似于細(xì)菌的單菌落可以從噬菌斑中分理出噬菌體顆粒，再純化出重組的人DNA，或者從用特異重組噬菌體感染的培養(yǎng)物的上清液中進(jìn)行純化。5、M13噬菌體是需要單鏈片段的時(shí)候，用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒操作法將片段亞克隆進(jìn)M13RF,用重組DNA轉(zhuǎn)染大腸桿菌細(xì)胞然后涂布平板會(huì)形成像人噬菌體感染相同的噬菌斑但噬菌斑是由于侵染細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢形成的而不是裂解所形成的。同樣可以進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。因?yàn)閺?fù)制起始點(diǎn)決定了包裝進(jìn)噬菌體的鏈，所以可以根據(jù)目的片段的哪條鏈需要被裝入噬菌體來(lái)決定使用哪種載體。6、M13噬菌體是通過(guò)感染感受性的大腸桿菌后合成互補(bǔ)鏈，形成雙鏈環(huán)狀DNA，也就是復(fù)制型。H3黏粒、YAC與BAC1、為了解決龐大基因組的生物構(gòu)建DNA文庫(kù)的問題，開發(fā)出了具有大DNA容量的載體。PFGE（脈沖場(chǎng)凝膠電泳）能夠分離大片段的DNA，并且能夠作圖和分析。傳統(tǒng)的瓊脂糖凝膠電泳是不能夠分離DNA大片段的。2、黏粒載體因?yàn)槠滟|(zhì)粒分子的形式，利用了人噬菌體cos位點(diǎn)的特性，吧體外的DNA包裝進(jìn)入人顆粒，并且要求在線性DNA上游正確的距離（距離入cos位點(diǎn)方3、最簡(jiǎn)單的黏粒載體是一個(gè)正常的小質(zhì)粒，需要復(fù)制起點(diǎn)（or。選擇性標(biāo)記、cos位點(diǎn)、用于克隆的限制性位點(diǎn)。用限制酶降解并與目的DNA片段連接，DNA被包裝進(jìn)入噬菌體顆粒，然后通過(guò)cos點(diǎn)的退火配對(duì)就可以使DNA重新環(huán)化并且使其正常擴(kuò)增。4、實(shí)際克隆采用更精細(xì)的方法以防止載體的多個(gè)開唄或者DNA的多個(gè)拷貝進(jìn)入某個(gè)重組體。5、YAC是酵母人工染色體，學(xué)習(xí)圖H3.3YAC載體的結(jié)構(gòu)。其構(gòu)建方法類似于黏粒，開發(fā)成了能夠攜帶巨大克隆片段的載體，并能夠組合到大腸桿菌的質(zhì)粒上。YAC載體的容納量很大，可以用來(lái)克隆完整的人類基因。6、為了確保YAC的正確重組在酵母細(xì)胞中正確生存,SUP4在重組體中插入失活功能，然后進(jìn)行一個(gè)關(guān)于紅白顏色測(cè)試的實(shí)驗(yàn)，其實(shí)驗(yàn)原理和藍(lán)白斑篩選差不多。7、釀酒酵母選擇性標(biāo)記不能夠賦予大腸桿菌物質(zhì)抗性，但能夠使其在某種選擇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，因?yàn)榭梢允範(fàn)I養(yǎng)缺陷型酵母發(fā)生基因重組從而有生活能力（例如生產(chǎn)色氨酸。8、BAC是細(xì)菌人工染色體，which客服了在用YAC克隆非常大的基因組片段的時(shí)候所遇到的問題。BAC能夠容納約325kb左右的插入序列，雖然沒有YAC長(zhǎng)，但是BAC更加穩(wěn)定并且容易轉(zhuǎn)化，在大腸桿菌宿主中生長(zhǎng)迅速。H4真核生物載體1、遺傳工程的許多應(yīng)用需要能在各種真核物種中表達(dá)外源基因的載體。2、對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染DNA（植物細(xì)胞需要破解細(xì)胞壁，太難了），可以較低效率吸收與磷酸鈣一起沉積在細(xì)胞表面的DNA。用高電壓處理細(xì)胞可以提高轉(zhuǎn)染的效率，因?yàn)楦唠妷嚎梢栽诩?xì)胞膜上打開臨時(shí)的孔道，這個(gè)過(guò)程我們稱之為電穿孔。3、用物理方法如微注射或者基因槍進(jìn)行顯微注射也可以把DNA注入培養(yǎng)中的單個(gè)動(dòng)物或者植物細(xì)胞中（甚至可以注入到細(xì)胞核內(nèi)。用基因槍把包被著DNA的金屬微粒打入靶細(xì)胞。4、2以載體是在釀酒酵母中用于基因克隆與表達(dá)的載體設(shè)計(jì)的，which有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)和兩個(gè)涉及復(fù)制的基因，并編碼一個(gè)位點(diǎn)特異性的重組蛋白FLP,基于2以的質(zhì)粒載體都被稱作酵母附加型質(zhì)粒（YEp）,這些通常像質(zhì)粒一樣被復(fù)制（從2以復(fù)制起點(diǎn)復(fù)制），但是Yep也可以通過(guò)與選擇基因的缺陷性基因組拷貝進(jìn)行重組從而整合進(jìn)酵母染色體。5、我們侵染植物細(xì)胞的時(shí)候一般用Ti質(zhì)粒，侵染的時(shí)候Ti質(zhì)粒的部分T-DNA會(huì)一起整合進(jìn)植物染色體DNA，所以這個(gè)T-DNA基因可能會(huì)造成細(xì)胞的時(shí)空生長(zhǎng)，甚至形成冠癭瘤或者根瘤。6、Ti質(zhì)粒很大，很難操作，所以為了不使T-DNA轉(zhuǎn)錄進(jìn)植物細(xì)胞，我們會(huì)先在標(biāo)準(zhǔn)的大腸桿菌質(zhì)粒上構(gòu)建重組的T-DNA，然后再刪除形成根瘤的基因，從而形成卸甲T-DNA穿梭質(zhì)粒。7、桿狀病毒有一個(gè)極強(qiáng)的啟動(dòng)子，which同樣可以驅(qū)動(dòng)重組進(jìn)桿狀病毒基因組的外源基因的過(guò)量表達(dá)，通過(guò)這個(gè)方法可以培養(yǎng)感染的昆蟲細(xì)胞來(lái)大量量產(chǎn)目的蛋白。因?yàn)槔ハx細(xì)胞可以產(chǎn)生許多翻譯后修飾的動(dòng)物蛋白，但是細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)做不到這一點(diǎn)。8、病毒同樣可以作為載體轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如SV40，which可以感染多種哺乳動(dòng)物。但是不能夠轉(zhuǎn)移大片段的DNA。9、反轉(zhuǎn)錄病毒是一條單鏈RNA基因組，改DNA可以經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)位機(jī)制穩(wěn)定整合進(jìn)入宿主基因組，因?yàn)橛袕?qiáng)啟動(dòng)子，所以被當(dāng)做基因治療中的良好載體，因?yàn)橥庠碊NA也可以以穩(wěn)定的方式整合進(jìn)入宿主的基因組。K原核生物的轉(zhuǎn)錄K1轉(zhuǎn)錄的基本原則1、轉(zhuǎn)錄由RNA聚合酶催化，which需要雙鏈DNA模板與前體核糖核苷酸ATP、GTP、CTP.和UTP；2、一條DNA鏈稱為有義鏈，RNA的序列就是有義鏈上脫氧核昔酸序列的直接拷貝（U代替T）;另一條鏈稱為反義鏈也就是模板鏈，它用作RNA合成過(guò)程中核糖核苷酸堿基配對(duì)的模板；3、轉(zhuǎn)錄時(shí)RNA聚合酶（多亞基酶）結(jié)合到雙鏈DNA上，并在啟動(dòng)子部位起始轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子在編碼區(qū)5’端的上游。4、不同基因間啟動(dòng)子的差別會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄起始效率的差異并且和調(diào)控有關(guān)，啟動(dòng)子內(nèi)短的保守序列是聚合酶或者其他DNA結(jié)合蛋白的結(jié)合位點(diǎn)以起始或者調(diào)控轉(zhuǎn)錄；5、結(jié)合到DNA模板上的RNA聚合酶以及輔助因子通常被稱作轉(zhuǎn)錄復(fù)合物；6、聚合酶沿5’至3’端方向延伸正在增長(zhǎng)的RNA鏈，同時(shí)酶自身沿著模板鏈反向移動(dòng)，并

在移動(dòng)時(shí)局部解旋；7、發(fā)生轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的解體和RNA合成終止發(fā)生在特定的DNA序列也就是終止子處，這些序列有一些自身互補(bǔ)區(qū)，能夠在RNA產(chǎn)物上形成莖環(huán)或發(fā)夾二級(jí)結(jié)構(gòu)，which使聚合酶停頓并終止轉(zhuǎn)錄；8、有一些終止子可以不需要輔助因子而獨(dú)立終止轉(zhuǎn)錄，有一些需要p蛋白作輔助因子。在終止反應(yīng)中，RNA-DNA雜交體分開然后重新形成雙鏈DNA，同時(shí)RNA聚合酶和所合成的RNA從DN鏈被解放；K2大腸桿菌K2大腸桿菌RNA聚合士1、全酶的完整酶分子有2個(gè)a亞基，一個(gè)B亞基，一個(gè)B'亞基，一個(gè)亞基以及一個(gè)。亞基；其中。亞基對(duì)于轉(zhuǎn)錄延伸不是必須的，在轉(zhuǎn)錄起始后就會(huì)從轉(zhuǎn)錄復(fù)合物上釋放下來(lái)。接下來(lái)剩下的酶沿著DNA酶進(jìn)行移動(dòng)，which被稱作核心酶；2、結(jié)合孔道的大小表明它可以直接結(jié)合16bp的DNA,while整個(gè)聚合酶所結(jié)合的DNA區(qū)域覆蓋了大概60bp；3、兩個(gè)相同的a亞基由rpoA基因編碼，這種亞基對(duì)于核心酶的組裝是必須的，同時(shí)有可能在啟動(dòng)子識(shí)別中也發(fā)揮一定的作用；4、B亞基被認(rèn)為是RNA聚合酶的催化中心，利福平是RNA聚合酶的強(qiáng)抑制劑，能組織起始但是不影響延伸?？梢员砻鰾亞基被這種抑制劑抑制，B亞基由兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄的起始和延伸；5、B'亞基由rpoC基因編碼，這個(gè)亞基結(jié)合了兩個(gè)鋅離子，which被認(rèn)為參與了酶的催化功能。5亞基可能負(fù)責(zé)酶與模板DNA的結(jié)合；6、大腸桿菌中最常見的是。70因子（因?yàn)榉肿恿渴?0kDa）,與。因子結(jié)合可以使DNA聚合酶從核心酶變成全酶。所以。因子在啟動(dòng)子識(shí)別中起到最為重要的作用。7、RNA鏈延伸到8~9nt的時(shí)候，。因子就會(huì)從RNA聚合酶中釋放出來(lái)了；K3大腸桿菌。70啟動(dòng)子1、啟動(dòng)子通常位于被稱為+1位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的上游，所以啟動(dòng)子的編號(hào)是負(fù)數(shù)，反應(yīng)的是在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的距離；2、070啟動(dòng)子由40~60bp的序列組成。-55到+20的區(qū)域都被聚合酶結(jié)合，其中-20到+20的區(qū)域被強(qiáng)有力地保護(hù)起來(lái)。這樣的緊密結(jié)合可以阻止核酸酶接近DNA。其中-40區(qū)域?qū)τ趩?dòng)子功能仍然是需要的；3、070啟動(dòng)子中最保守的序列是一個(gè)普遍存在的6bp的序列。這段序列在-10位置，我們稱它為Pribnow框，這段共有序列是：TATAAT,這段序列在各個(gè)位置上最常出現(xiàn)；其中TA和最后的T是最保守的，這段序列是聚合酶啟動(dòng)DNA解旋的序列；4、在-35區(qū)域也有一段重要的共有6bp序列——TTGACA5、90%基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)是瞟吟，其中G比A更常見。在起始點(diǎn)核苷酸兩側(cè)分別是C和T堿基(suchasCGT或者CAT)6、不同啟動(dòng)子序列有很大差異，which導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄效率高達(dá)1000倍，作用如下——)-35序列組成增強(qiáng)與聚合酶o因子相互識(shí)別和相互作用的識(shí)別區(qū))-10序列對(duì)于DNA解旋很重要7、最初轉(zhuǎn)錄的30個(gè)堿基序列也會(huì)影響轉(zhuǎn)錄，有時(shí)候會(huì)有特殊的啟動(dòng)子序列來(lái)影響轉(zhuǎn)錄效率比如什么什么操控子之類的，請(qǐng)自行學(xué)習(xí)；K4轉(zhuǎn)錄的起始、延伸&終止1、RNA聚合酶的核心酶對(duì)DNA的非特異性的親和力被稱作松散結(jié)合；2、。因子使全酶結(jié)合到正確啟動(dòng)子位點(diǎn)的能力增強(qiáng)100倍，聚合酶與處于堿基配對(duì)狀態(tài)的啟動(dòng)子DNA所形成的的最初的復(fù)合物被稱為閉合復(fù)合物；3、聚合酶作用可以促進(jìn)解旋（負(fù)超螺旋能夠增強(qiáng)許多基因的轉(zhuǎn)錄），DNA的初始解旋導(dǎo)致DNA與聚合酶形成開放復(fù)合物，這一過(guò)程被稱為緊密結(jié)合；4、聚合酶在合成開始首先摻入最初的兩個(gè)核苷酸，并形成一個(gè)磷酸二酯鍵。最初的9個(gè)堿基一次加上，酶并不沿DNA鏈移動(dòng)；在起始轉(zhuǎn)錄后，釋放出。因子，形成聚合酶-DNA-新生RNA的三元復(fù)合物，這個(gè)時(shí)候已經(jīng)允許另一RNA聚合酶全酶從啟動(dòng)子再度起始轉(zhuǎn)錄。DNA的解旋區(qū)（成為轉(zhuǎn)錄泡），隨聚合酶一起沿DNA鏈移動(dòng)。解旋DNA區(qū)域穩(wěn)定保持在17bp大小。學(xué)習(xí)P142的示意圖加深理解5、最常見的一個(gè)終止信號(hào)是RNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其中的RNA轉(zhuǎn)錄物因?yàn)樽陨砘パa(bǔ)所以可以形成一個(gè)穩(wěn)定的、帶一個(gè)莖和一個(gè)環(huán)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。莖部富含G-C有利于堿基配對(duì)的穩(wěn)定性。其后的一串U殘基和反義DNA鏈的相應(yīng)的A殘基配對(duì)作用弱，which有利于RNA與模板DNA鏈的解離，所以RNA就能夠從轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中解放出來(lái)了！6、有的終止位點(diǎn)不能形成強(qiáng)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，需要輔助因子p蛋白來(lái)幫助終止。p是六聚體蛋白質(zhì)which在有單鏈RNA存在時(shí)可以水解ATP。這個(gè)蛋白質(zhì)似乎能結(jié)合RNA上的遺傳核苷酸，即通過(guò)識(shí)別一種特定的結(jié)構(gòu)來(lái)進(jìn)行終止。7、p蛋白沿新生RNA鏈向復(fù)合物移動(dòng)能夠讓RNA聚合酶在p依賴的終止子處停止轉(zhuǎn)錄。這些信號(hào)是在新合成的RNA鏈上（識(shí)別的終止子），而不在DNA鏈上。有時(shí)p依賴性的終止子有發(fā)夾結(jié)構(gòu)，但缺少之后的一串不依靠p終止所必要的遺傳U殘基；L原核生物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控：L1色氨酸操縱子：.其包括了色氨酸合成途徑中相關(guān)的五個(gè)結(jié)構(gòu)基因trpEDCBA;當(dāng)然也有Ptrp和Otrp;.其意義是當(dāng)細(xì)胞內(nèi)缺乏生物合成途徑的產(chǎn)物色氨酸的時(shí)候使這些基因協(xié)同表達(dá)的進(jìn)化系統(tǒng)；.色氨酸阻抑物與色氨酸操縱子的操縱基因相互作用，且只有色氨酸阻抑物與色氨酸形成復(fù)合物之后才能結(jié)合到操縱基因上；.阻抑物是含有兩個(gè)亞基的二聚體，和CRP蛋白結(jié)構(gòu)相似。.色氨酸作為共阻抑物起作用，通過(guò)終產(chǎn)物抑制的合成，從而影響轉(zhuǎn)錄。（色氨酸多，便抑制色氨酸的合成）；.在Otrp（操縱基因）和trpE之間有一段序列的缺失會(huì)影響轉(zhuǎn)錄水平（導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄水平上升），成為弱化子。.是一個(gè)不依靠p因子的終止子區(qū)域。通過(guò)在RNA轉(zhuǎn)錄物中形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)從而作為一個(gè)高效的轉(zhuǎn)錄終止子，影響轉(zhuǎn)錄物的合成。.在Otrp和TrpE之間有前導(dǎo)RNA結(jié)構(gòu)4個(gè)序列互補(bǔ)區(qū)，形成不同的堿基配對(duì)的RNA結(jié)構(gòu)。弱化子就是序列3和序列4配對(duì)的結(jié)果。序列1、2;3、4也是互補(bǔ)的，同時(shí)2、3也可以互補(bǔ)，如果2和3形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)那么3、4就不會(huì)形成，轉(zhuǎn)錄就不會(huì)終止；.前導(dǎo)肽的作用就是決定色氨酸的含量并且控制轉(zhuǎn)錄的終止。.色氨酸（色氨酸操縱子編碼的酶的最終合成產(chǎn)物）是翻譯過(guò)程中所必須的，細(xì)胞對(duì)于它的含量非常敏感，決定了3、4序列間的發(fā)卡結(jié)構(gòu)是否形成。.弱化作用：在色氨酸含量很高的情況下核糖體迅速在兩個(gè)色氨酸密碼子中插入色氨酸，這樣翻譯直達(dá)前導(dǎo)肽末端，當(dāng)RNA聚合酶到達(dá)終止序列的時(shí)候，因?yàn)楹颂求w封閉了序列2，所以能夠形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄的終止。.當(dāng)色氨酸缺乏的時(shí)候，翻譯過(guò)程將缺少氨酰tRNA，核糖體將在兩個(gè)色氨酸密碼子上滯留，封閉1。所以在2和3上形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，這樣就不會(huì)形成終止子，就可以繼續(xù)轉(zhuǎn)錄。.色氨酸含量的高低決定了轉(zhuǎn)錄是提早終止（弱化作用）還是繼續(xù)轉(zhuǎn)錄。.色氨酸弱化作用可以弱化10倍，阻抑物是70倍。兩者結(jié)合最多就可以抑制七百倍。有一些操縱子只有弱化作用沒有阻抑物的作用，比如his操縱子。L2不同。因子對(duì)于轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié).。因子亞基是識(shí)別啟動(dòng)子序列的關(guān)鍵元素.轉(zhuǎn)錄起始后。因子就會(huì)從核心酶上釋放，。既能夠結(jié)合到核心RNA酶上，同時(shí)也能夠識(shí)別DNA上特殊的啟動(dòng)子序列。.。因子識(shí)別不同的大約在-35和-10位點(diǎn)為中心的序列組成的啟動(dòng)子，其中-10區(qū)域更加重要。.070是大腸桿菌中最為普遍的。因子，負(fù)責(zé)識(shí)別共有元件35和-10的一般啟動(dòng)子。.大腸桿菌中對(duì)于不同的o因子的使用而發(fā)生改變的實(shí)例就是熱休克反應(yīng)：在一般溫度是一般是070結(jié)合啟動(dòng)子區(qū)域較多，當(dāng)升溫到42度時(shí)，就會(huì)變成032的全酶負(fù)責(zé)識(shí)別熱休克蛋白的啟動(dòng)子，結(jié)合不同的序列。（大部分主要序列在此溫度下已經(jīng)不能夠進(jìn)行合成）,當(dāng)溫度升到50度的時(shí)候，大腸桿菌便已經(jīng)不能生長(zhǎng)。.菌種中有很多中不同的o因子，這是細(xì)胞分化最基本的例子。通過(guò)o因子的活性特殊性，可以使細(xì)胞產(chǎn)生共同協(xié)調(diào)的分化過(guò)程。7.噬菌體中的o因子也是一樣的，有028因子的全酶結(jié)合。通過(guò)這種方法，噬菌體能夠運(yùn)用宿主的RNA聚合酶按一定的順序表達(dá)他們自己的基因。M真核生物的轉(zhuǎn)錄M1:三種RNAM1:三種RNA聚合士的性質(zhì)和功能1、真核生物轉(zhuǎn)錄機(jī)制因?yàn)橛写罅慷嚯牡膮⑴c使真核生物RNA聚合酶更加復(fù)雜。2、RNA聚合酶I轉(zhuǎn)錄大部分rRNA的基因，存在于核仁；RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄所有的編碼蛋白的基因和一些snRNA基因，存在于核質(zhì)；RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄tRNA、5SrRNA和U6snRNA的基因以及其他一些小分子RNA，也存在于核質(zhì)中。3、編碼同一RNA聚合酶兩個(gè)兩個(gè)大亞基具有同源性M2：RNAM2：RNA聚合士I基因：核糖體重復(fù)1、其負(fù)責(zé)rRNA在分裂間期的連續(xù)合成，rRNA的重復(fù)基因在不同的染色體上游5簇，其中有40個(gè)拷貝，RNA的多基因拷貝的連續(xù)轉(zhuǎn)錄是產(chǎn)生足夠量的已加工rRNA所必需的的基礎(chǔ)物質(zhì)（包裹進(jìn)入rRNA）2、UCE是rRNA啟動(dòng)子上游大學(xué)100bp處的上游控制元件，使轉(zhuǎn)錄效率提高了10-100倍3、UBF是一種特意的DNA結(jié)合蛋白，可以和UCE結(jié)合。（通過(guò)結(jié)合還可以使UBF缺乏的時(shí)候刺激UBF的生成）4、選擇因子1是RNA聚合酶I轉(zhuǎn)錄所必須的，SL1結(jié)合并穩(wěn)定UBF-DNA復(fù)合物。結(jié)合使得RNA聚合酶I能與上述復(fù)合物結(jié)合并起始轉(zhuǎn)錄，非常重要。5、SL1中的TBP的蛋白質(zhì)亞基是三種真核生物RNA聚合酶起始所必須的，是真核生物轉(zhuǎn)錄中的一個(gè)非常關(guān)鍵的因子。

M3:RNA聚合酶III基因：5S基因與tRNA基因的轉(zhuǎn)錄1、III位于核質(zhì)里面，負(fù)責(zé)5SrRNA的前體、tRNA以及其他snRNA和胞質(zhì)RNA的合成。2、在編碼tRNA的DNA中有兩個(gè)高度保守的序列，A框和B框。改序列也是編碼tRNA自身的重要序列。所以tRNA內(nèi)高度保守序列的同時(shí)也是高度保守的啟動(dòng)子DNA序列。3、TFIIIC可以與tRNA啟動(dòng)子的A框和B框結(jié)合TFIIIB可以與A框上游50bp序列結(jié)合。4、TFIIIB由三個(gè)亞基組成，其中一個(gè)就是TBP，是三種RNA聚合酶的通用轉(zhuǎn)錄因子。而第二個(gè)亞基是BRF，和TFIIB同源。第三個(gè)亞基稱作B‘o5、TFIIIC是一個(gè)為起始因子TFIIIB定位的裝配因子。6、特意DNA結(jié)合蛋白TFIIIA結(jié)合在5SrRNA啟動(dòng)子的C框，并作為裝配因子使得TFIIIC和5SrRNA相互作用。一旦TFIIIC發(fā)生結(jié)合，TFIIB就能夠和復(fù)合體起作用并且開始轉(zhuǎn)錄（募集RNA聚合酶III）o（看書上159和160頁(yè)的圖，好理解多了）7、RNA聚合酶III的終止僅需要聚合酶識(shí)別一個(gè)簡(jiǎn)單的核苷酸序列which由成簇的dA殘疾構(gòu)成，并且其終止效率受到周圍序列的影響。M4:M4:RNA聚合II基因：?jiǎn)?dòng)子和增強(qiáng)子1、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄所有的編碼蛋白的基因和一些snRNA基因，存在于核質(zhì)；2、在啟動(dòng)起始位點(diǎn)上游25-35bp的時(shí)候有一個(gè)稱為TATA框的序列，與TBP進(jìn)行結(jié)合，包括一堆額外的下游堿基。其決定了RNA聚合酶II的位置并正確起始轉(zhuǎn)錄。大約50%的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)是瞟吟堿基；3、SP1框在很多基因的上游單獨(dú)存在或者和TATA框一同存在，還有CCAAT。稱為上游調(diào)控元件（URE）,能夠確保啟動(dòng)子有效轉(zhuǎn)錄方面起到了非常重要的作用。4、增強(qiáng)子是遠(yuǎn)離轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)數(shù)千個(gè)堿基的調(diào)控元件。大概100-200bp長(zhǎng)，含有多個(gè)對(duì)增

強(qiáng)子總體活性起作用的序列元件，有廣譜的或者細(xì)胞類型特異性的。增強(qiáng)子特性：賦予相連基因從正確的起始位點(diǎn)的強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性；不管位于連接基因的上游或者是下游任意方向上均可以激活轉(zhuǎn)錄；上游或是下游都可以在遠(yuǎn)離起始位點(diǎn)1kb以上發(fā)揮作用；優(yōu)先激活兩個(gè)串聯(lián)啟動(dòng)子中距離較近的一個(gè)；M5：通用轉(zhuǎn)錄因子與RNAM5：通用轉(zhuǎn)錄因子與RNA聚合士II1、TF是轉(zhuǎn)錄因子transcribefactor2、TFIID負(fù)責(zé)和含有TATA框的啟動(dòng)子序列相結(jié)合，在形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的早期。學(xué)習(xí)164頁(yè)的示意圖；3、TFIIA和TFIID結(jié)合能夠增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子D和TATA框的結(jié)合，穩(wěn)定其復(fù)合體，轉(zhuǎn)錄因子A能夠抵消抑制因子，阻止抑制因子和TFIID的結(jié)合讓組裝過(guò)程能夠進(jìn)行穩(wěn)定的發(fā)生。4、轉(zhuǎn)錄因子D結(jié)合后，轉(zhuǎn)錄因子B就會(huì)和D結(jié)合，并且B可以和RNA聚合酶結(jié)合，這是轉(zhuǎn)錄中非常關(guān)鍵的一步；然后E、H、J就會(huì)進(jìn)行陸續(xù)結(jié)合復(fù)合物，形成一個(gè)至少由五個(gè)亞基組成的大復(fù)合體。5、其中轉(zhuǎn)錄因子TFIIH在轉(zhuǎn)錄延伸上起到非常重要的作用6、在不含TATA框的DNA序列上，RNA聚合酶II含有和起始位點(diǎn)重疊的起始元件，在這些啟動(dòng)子上TBP就可以和另一個(gè)結(jié)合蛋白形成而添加到啟動(dòng)子上接著以一種類似在含有TATA框的啟動(dòng)子上的方式來(lái)吸收別的轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶。N真核生物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控N1真核生物的轉(zhuǎn)錄因子1、轉(zhuǎn)錄因子能夠特異地和DNA結(jié)合位點(diǎn)相結(jié)合然后激活轉(zhuǎn)錄，并且這些活性可以獨(dú)立分配給特定的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，為激活結(jié)構(gòu)與和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。2、轉(zhuǎn)錄因子很多以同型或異型的二聚體形式存在，有一些轉(zhuǎn)錄因子有配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，可以通過(guò)附加的小分子來(lái)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子自身的活性。3、DNA的特殊的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋-結(jié)構(gòu)在被稱為識(shí)別的螺旋部分處在大溝中，并與DNA發(fā)生作用。4、關(guān)于各個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的基本結(jié)構(gòu)見書上的要點(diǎn)5、堿性結(jié)構(gòu)域：與亮氨酸拉鏈以及螺旋-環(huán)-螺旋二聚體結(jié)構(gòu)域相結(jié)合的，堿性結(jié)構(gòu)域一般以二聚體的形式和DNA結(jié)合。6、亮氨酸拉鏈：每隔7個(gè)殘基就會(huì)有一個(gè)疏水的亮氨酸殘基，這些殘基位于DNA結(jié)合域C端的a螺旋上，這樣側(cè)面每?jī)扇蜁?huì)出現(xiàn)一個(gè)亮氨酸，形成一個(gè)疏水的表面，疏水表面之間就可以相互作用并且形成二聚體，這種相互作用形成一個(gè)卷曲的卷曲結(jié)構(gòu)。7、酸性激活結(jié)構(gòu)域有很高比例的酸性氨基酸，同時(shí)谷氨酰胺結(jié)構(gòu)域中谷氨酰胺的殘基比例也很大，甚至比總體結(jié)構(gòu)更加重要。8、轉(zhuǎn)錄的阻抑針對(duì)激活因子功能的干擾：阻斷激活因子的DNA結(jié)合位點(diǎn)形成非DNA結(jié)合復(fù)合體從而導(dǎo)致其不能結(jié)合形成正確的DNA結(jié)合體掩蓋激活結(jié)構(gòu)域使之不能夠識(shí)別并且結(jié)合N2轉(zhuǎn)錄調(diào)控舉例1、SP1是一段富含GC的保守序列GGGCGG相連，結(jié)合在許多持家基因的啟動(dòng)子中，SP1富含谷氨酰胺結(jié)構(gòu)域并且和TAFII發(fā)生過(guò)特異性作用，TAFII因?yàn)槟軌蚝蚑BP發(fā)生特異性組合形成TFIID，所以這樣能夠調(diào)控起始轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。2、許多轉(zhuǎn)錄因子由激素激活，比如類固醇激素就能夠穿越細(xì)胞膜并且和被稱為類固醇激素受體的轉(zhuǎn)錄因子相互作用。受體平時(shí)一般和抑制蛋白相結(jié)合，當(dāng)和類固醇激素結(jié)合后，受體就可以從抑制蛋白上游離出來(lái)形成受體二聚化并且轉(zhuǎn)錄進(jìn)細(xì)胞核。3、STAT蛋白通過(guò)和細(xì)胞表面的受體結(jié)合并通過(guò)稱為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的過(guò)程將信號(hào)傳遞給細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)；4、HIV能夠編碼一種稱為Tat的激活蛋白，這種蛋白質(zhì)是HIV基因大量表達(dá)所必須的。Tat與RNA上一段稱為TAR的苯環(huán)結(jié)構(gòu)相結(jié)合。TAR是HIV的5‘端轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)后一段不翻譯的區(qū)域，其作用一般是為了延伸，如果沒有tat，轉(zhuǎn)錄復(fù)合體會(huì)因?yàn)檫M(jìn)城很慢而使HIV的轉(zhuǎn)錄過(guò)程終止。5、細(xì)胞決定：在機(jī)體能夠通過(guò)細(xì)胞分化形成骨骼肌肉細(xì)胞之前，由體節(jié)負(fù)責(zé)肌肉細(xì)胞的生成，6、myoD是在成肌細(xì)胞未分化之前進(jìn)行表達(dá)并負(fù)責(zé)肌肉形成與執(zhí)行細(xì)胞決定的基因，其過(guò)量表達(dá)可以使成纖維細(xì)胞便成肌細(xì)胞特異基因的累計(jì)肉細(xì)胞和類生肌節(jié)。同時(shí)myoD激活p21waf1/cip1的表達(dá)，which是一個(gè)依賴細(xì)胞周期蛋白的激酶小分子抑制因子，能夠抑制CDK的活性并且使細(xì)胞周期停留在G1。7、（在胚胎發(fā)育中起作用）同源框是一段保守的DNA序列編碼一種稱為同源異型域的螺旋轉(zhuǎn)交螺旋的DNA結(jié)合蛋白（前面剛剛提到。保守同源異型基因所編碼的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域是轉(zhuǎn)錄因子的特征，而轉(zhuǎn)錄因子在胚胎發(fā)育中優(yōu)固定的功能。ORNA加工與核糖核蛋白復(fù)合體O1rRNA加工與核糖體1、RNA加工是對(duì)初生轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行修飾的總稱，一般包括1）內(nèi)切核酸酶和外切核酸酶對(duì)于核苷酸的切除；2）向初生RNA轉(zhuǎn)錄物或者剪切產(chǎn)物的3‘端和5’端添加核苷酸；3）在堿基或者糖苷上進(jìn)行某些核昔酸修飾；2、在原核生物大腸桿菌中優(yōu)7種不同的rRNA操縱子分散在整個(gè)基因組中，還包含1-4個(gè)tRNA的編碼序列。這些初生轉(zhuǎn)錄物經(jīng)過(guò)加工生成rRNA和tRNA分子。同時(shí)又證據(jù)表明RNA酶III參加了rRNA的加工過(guò)程。3、原核生物轉(zhuǎn)錄物通過(guò)內(nèi)部互補(bǔ)序列間的堿基配對(duì)折疊形成一些莖環(huán)結(jié)構(gòu)，。這些莖環(huán)狀的二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成可以使一些蛋白質(zhì)和他們結(jié)合形成核蛋白復(fù)合體。然后蛋白質(zhì)和RNA保持結(jié)合并且成為核糖體的一部分。在結(jié)合之后便開始修飾4、真核生物的rRNA也是由一個(gè)長(zhǎng)的單鏈前體分子經(jīng)過(guò)特定的修飾和剪切步驟之后形成，他們?cè)诤巳手杏蒖NA聚合酶I轉(zhuǎn)錄，在各種生物中前體的大小不盡相同。真核生物中的5SrRNA由RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄散在基因產(chǎn)生出的121nt的轉(zhuǎn)錄物，而且基本上不需要加工。5、對(duì)于哺乳動(dòng)物的前rRNA，前體經(jīng)歷了一系列剪切，最初切掉外部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1和2，再切去內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)并且釋放出32S和20S的兩個(gè)前RNA，并且進(jìn)一步修建這兩個(gè)片段。6、5.8S片段必須和28SrRNA完成堿基配對(duì)才能夠產(chǎn)生成熟的RNA分子7、rRNA的折疊和蛋白質(zhì)復(fù)合都是和轉(zhuǎn)錄同一時(shí)間發(fā)生的，并且都在核仁中進(jìn)行。8、甲基化是由聚集在一起的一系列核內(nèi)小分子核糖核蛋白顆粒在核仁內(nèi)進(jìn)行。which通過(guò)

配對(duì)來(lái)決定甲基化修飾的位置。9、RNA分子通常和蛋白復(fù)合存在，并且是特異性的結(jié)合，我們稱之為核糖核蛋白（RNP）核糖體就是最大的RNP，由rRNA和特定的核糖體蛋白復(fù)合形成；X、70S核糖體由一個(gè)50S的大亞基和一個(gè)30S的小亞基組成，后者由一個(gè)16SrRNA的分子和21種蛋白質(zhì)組成，大亞基包含一個(gè)5S和一個(gè)23SrRNA分子以及31種不同的蛋白質(zhì)。XI、真核生物中的rRNA要大一些，在相當(dāng)大程度上保留了各自RNA分子二級(jí)結(jié)構(gòu)的保守性，由于其復(fù)雜性，真核生物核糖體亞基還無(wú)法重新裝備成為有功能的復(fù)合體，且結(jié)構(gòu)也不是十分的清楚。O2tRNA的加工、RNAO2tRNA的加工、RNAP和核士1、大腸桿菌的rRNA操縱子包含了tRNA的編碼區(qū)域，which被間隔序列相隔。tRNA分子從這些操縱子的前體轉(zhuǎn)錄物加工，經(jīng)過(guò)RNaseD、E、E、P按照順序進(jìn)行一系列的加工步驟。2、轉(zhuǎn)錄物前體經(jīng)過(guò)折疊形成特征莖環(huán)結(jié)構(gòu)后內(nèi)切核酸酶在3’端切除一個(gè)側(cè)翼序列，并在前體的3’端留下一個(gè)額外的九核苷酸，然后外切酶RNaseD依次切去3’端區(qū)域的7個(gè)核昔酸，接著RNaseP內(nèi)切出成熟的tRNA5'端，然后RNaseD再切去3’端剩余的兩個(gè)核苷酸，就是成熟的3’端了，然后開始?jí)A基修飾。3、堿基修飾對(duì)于各種特定的RNA類型都是獨(dú)特的4、真核生物和原核生物主要不同點(diǎn)是原核生物成熟tRNA3‘端的5'-CCA-3'序列是基因編碼的，但真核生物核編碼tRNA不屬于這種情況。真核生物中的tRNA加工還涉及切除內(nèi)含子的步驟，由內(nèi)切酶將內(nèi)含子兩段切除后，再將兩個(gè)半個(gè)的tRNA分子連接在一起。5、真核生物tRNA加工機(jī)制在進(jìn)化中是高度保守的；6、RNaseP由一個(gè)RNA分子和一個(gè)蛋白質(zhì)組成的一種內(nèi)切酶，一種簡(jiǎn)單的RNP。這種酶能夠修剪tRNA前體分子產(chǎn)生成熟的5’端。存在于原核生物和真核生物中。并且單獨(dú)的RNA組分就能夠行使內(nèi)切核酸酶的功能，which是具有催化活性的RNA，即使沒有蛋白質(zhì)也可以催化化學(xué)反應(yīng)。7、核酶是一種可以催化特定生化反應(yīng)的RNA分子。在四膜蟲的rRNA大亞基中有一個(gè)內(nèi)含子，在無(wú)蛋白質(zhì)的條件下也可以對(duì)轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行體外自我剪接。一般在體外的反應(yīng)效率很低。8、微小RNA，以及短干涉RNA（siRNA）。在人體中大約有250種不同的miRNA。miRNA和siRNA的一條鏈均可以和蛋白質(zhì)結(jié)合形成一種名為RISC（RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體）的核糖核蛋白復(fù)合體，which可以抑制其中RNA組分互補(bǔ)的特定基因表達(dá)。9、RISC可以通過(guò)匹配引起互補(bǔ)mRNA的降解，但當(dāng)基因序列和RNA不完全匹配，RISC中的RNA可以抑制翻譯過(guò)程RISC中的RNA還可以間接引起編碼互補(bǔ)mRNA的基因啟動(dòng)自的甲基化；O3mRNA加工、hnRNP和snRNP1、mRNA轉(zhuǎn)錄物很少需要加工（一般一邊轉(zhuǎn)錄就一邊開始翻譯了），第一個(gè)順反子（蛋白質(zhì)編碼區(qū)）的翻譯被限制在很短的時(shí)間內(nèi)。甚至一些內(nèi)部順反子在3’和5’端形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)形成局部保護(hù)，形成對(duì)于外切酶的暫時(shí)性的屏障保證增加翻譯頻率。2、mRNA前體——那些即將被加工成mRNA分子的轉(zhuǎn)錄物3、mRNA前體分子經(jīng)過(guò)5’端加帽、3’端剪切以及加poly（A）尾、剪接和甲基化加工產(chǎn)生出成熟的mRNA分子4、hnRNA由RNA聚合酶II合成并主要作為mRNA的前提，很快被蛋白質(zhì)包裹形成核內(nèi)不均一RNA（這就是hnRNPbhnRNP蛋白被認(rèn)為有助于幫助hnRNA的單鏈狀態(tài)，輔助各種RNA的加工反應(yīng)。5、RNA聚合酶也轉(zhuǎn)錄大部分的snRNA，which常與特定蛋白質(zhì)形成snRNP，這些RNA富含尿嘧啶。有一些會(huì)參加mRNA的前體剪接，大部分好像參與了rRNA前體加工中甲基化位點(diǎn)的確定，所以存在于核仁中。6、snRNP的構(gòu)成過(guò)程：由RNA聚合酶II在核內(nèi)合成，具有一個(gè)正常的5’端帽子結(jié)構(gòu)，然后進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，與核心蛋白質(zhì)以及其他的特定蛋白質(zhì)結(jié)合，在5’端帽子結(jié)構(gòu)上得到兩個(gè)甲基然后再轉(zhuǎn)運(yùn)如核內(nèi)行使剪接功能。7、在轉(zhuǎn)錄開始后不久，在RNA鏈長(zhǎng)度超過(guò)30nt之前，5’端經(jīng)過(guò)修飾加上了帽子結(jié)構(gòu)（7-甲基尿苷殘基）bwhich通過(guò)一個(gè)GMP核苷酸以反方向加到新生的RNA轉(zhuǎn)錄物上產(chǎn)生，從而形成5‘-5‘三磷酸橋。mRNA鳥昔轉(zhuǎn)移酶催化這一核昔酸添加反應(yīng)。8、帽子結(jié)構(gòu)對(duì)5’外切核酸酶形成屏障，起到穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄物的作用，同時(shí)對(duì)mRNA及其前體的其他反應(yīng)，比如剪接、轉(zhuǎn)運(yùn)和翻譯都十分重要。9、成熟的mRNA分子3’端是經(jīng)過(guò)剪切再加上一串poly（A）殘基（被稱作polyA尾）后而形成。利用這一個(gè)特征可以講mRNA分子從其他類型RNA中純化出來(lái)，用于cDNA文庫(kù)的構(gòu)建，進(jìn)而分離特定基因、分析功能。剪切和聚腺昔酸化需要DNA和mRNA前體轉(zhuǎn)錄物上特定的序列，有一串聚腺苷酸化信號(hào)序列，其后跟著一個(gè)5'-YA-3'結(jié)構(gòu)，其中Y為嘧啶，其下游常有