綜合性設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)-質(zhì)粒載體的選擇以及所 質(zhì)粒DNA的提取與鑒真核表達(dá)載體和RNA干擾載體的此實(shí)驗(yàn)共包括如下三個(gè)部第一部分，質(zhì)粒載體的選擇以及 的外 段序列生物信息學(xué)分析部第二部分，質(zhì)粒DNA第三部分，真核表達(dá)載體和RNA 質(zhì)粒的基本知質(zhì)粒（aid）大小在～2之間，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，大多是具有雙鏈閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的容性，兩種不同的質(zhì)粒不能共存在同一個(gè)宿主細(xì)胞中。質(zhì)?？稍诩?xì)胞間傳遞，其在胞內(nèi)的存在一般對(duì)宿主細(xì)胞的代謝活動(dòng)無(wú)影響。可為抗生素抗性或營(yíng)養(yǎng)缺陷型，這樣能改變宿主細(xì)胞的耐藥性，使宿主細(xì)胞在質(zhì)粒含有啟動(dòng)子序列，能夠自我。不過(guò)質(zhì)粒的和轉(zhuǎn)錄都依賴(lài)于宿主編碼的蛋白和酶，或能在胞質(zhì)中進(jìn)行自我，或整合到細(xì)胞中作為細(xì)胞遺傳物質(zhì)的一部分隨一起。質(zhì)粒的特點(diǎn)使其成為攜帶外源進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或表達(dá)的重要媒介物，這種運(yùn)載工具 工程中具有極廣泛的應(yīng)用價(jià)值質(zhì)粒DNA能從細(xì)菌中提出來(lái)，又能再轉(zhuǎn)入細(xì)菌，這個(gè)過(guò)程稱(chēng)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入的質(zhì)粒DNA仍能進(jìn) 以應(yīng)用 酵母表達(dá)系統(tǒng)的pPIC9載體為例解釋載體的構(gòu)5‘AOX1啟動(dòng)子片段含有AOX1啟動(dòng)子，在甲醇列，能使外源蛋白到發(fā)酵上清中，更利于多克隆位點(diǎn)含多個(gè)酶切位點(diǎn)，為外源HIS4 片段能夠 組 屬抗 達(dá)載體在E.coli中篩選 真核細(xì)胞系統(tǒng) 序列的查詢(xún)與獲輸 名運(yùn)行子使用分輸入DNA啟動(dòng)子區(qū)的分CpG島分第二部分，質(zhì)粒DNA的提取與鑒實(shí)驗(yàn)?zāi)抠|(zhì)粒DNA的提取方 堿裂解法有操作簡(jiǎn)便、快速、得率高的優(yōu)點(diǎn)。概括起來(lái)主要是用非離子型或離子型去污劑 所有分離質(zhì)粒的方法都包括個(gè)基本驟：培養(yǎng)細(xì)使質(zhì)粒擴(kuò)；收集和解細(xì)菌；分離質(zhì)粒有時(shí)還要求純化質(zhì)粒，根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需選擇哪 法主要取決于以下幾個(gè)因素：質(zhì)粒的大小、大腸桿菌菌株、裂解后用于純化的技術(shù)和實(shí)驗(yàn)要求。堿裂解法基本原NaOH主要是為了溶解細(xì)胞，DNA，因?yàn)樵趶?qiáng)堿性的情況下，細(xì)胞膜發(fā)生了從（雙層膜）結(jié)構(gòu)向icell（微囊）結(jié)構(gòu)的變化；但O易和空氣中的2發(fā)生反應(yīng)，形成碳酸鈉，降低了aO的堿性，所以必須用新鮮的O。與O聯(lián)用，其目的是為了增的強(qiáng)堿性同時(shí)能很好結(jié)合蛋白，生沉淀。一步要記兩點(diǎn)：第一，時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，因?yàn)樵谶@樣的堿性條件下 組N 斷會(huì)慢慢斷裂；第二，必溫柔混合，不然 會(huì)斷裂。溶液III中的醋酸鉀是為了使鉀離子置換SDS中的納離子而形成了PDS，因?yàn)槭榛蛩徕c（sodiumdodecylsulfate）（potassiumdodecylsulfate,PDS），而PDS是不溶水的，同時(shí)一個(gè)SDS分子平均結(jié)合兩個(gè)氨基酸，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)沉淀了。2M的醋酸是為了中和因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間的堿性條件會(huì)打斷DNA75%主要是為了鹽份和抑制Dnase在一定電場(chǎng)強(qiáng)度下，分子的遷移取決于分子篩效應(yīng)，分子本身的大小和構(gòu)型相對(duì)分子質(zhì)量不同的N 段泳動(dòng)速度不一樣，且分子的遷移速度與相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)值成反比系。凝膠電不僅可分不同相對(duì)子質(zhì)量的，也可以分離相對(duì)子質(zhì)量相，但構(gòu)型不的分子：般來(lái)說(shuō)，其閉環(huán)結(jié)構(gòu)泳最快，其次為線性結(jié)構(gòu)，最慢的可能是單鏈開(kāi)環(huán)。溴化乙錠B是一種熒光 3,二氨基5乙基苯基菲啶溴鹽，該物質(zhì)含有一個(gè)可以嵌入的堆積堿基之間的一個(gè)平面基團(tuán)，這個(gè)基團(tuán)的固定位置及其與堿基的密切接近，導(dǎo)致 與結(jié)合并呈熒光，其光產(chǎn)率比離 溶液所增加。吸收2處的紫外輻射并傳遞給 ，而被結(jié)合的 本身則在2和3有光吸收。這兩種情況下，被吸收的能量可在可見(jiàn)光譜紅橙區(qū)的0處重新發(fā)射出來(lái)。因此，當(dāng)凝膠中含有游離溴化乙錠時(shí)即可以檢測(cè)到少量的。限制性?xún)?nèi)切酶（restrictionendonuclease）指能識(shí)別堿基構(gòu)成特異的一段（4~8所有的限制性?xún)?nèi)切酶切割DNA均產(chǎn)生含5′磷酸基和3′ 團(tuán)的末端載體的酶切與載體的構(gòu)NGALBgl

酶切位點(diǎn)BglII在該質(zhì)粒上有兩個(gè)，分2bp5622bp處。實(shí)驗(yàn)操將微量質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，挑單克隆于LB二質(zhì)粒提取取1.5ml培養(yǎng)物倒入Eppendorf管中，8000rpm室溫離心1加入150μl 心5min，將上清液轉(zhuǎn)至另一Eppendorf加入等體積（400μl）酚：氯仿溶液，混勻，12,000rpm室溫離心2min，取上清至另一新離心管；向上清液加入2倍體積（約800μl）無(wú)水乙醇，混勻后，室溫放置2min；12000rpm心5min。倒去上清液，把Eppendorf用1ml70%乙醇洗滌質(zhì)粒DNA沉淀，振蕩并同上離心，倒去上清液，空氣中干燥加入50μlTE溶液，使DNA完全溶解，短暫振蕩5分鐘后即可酶切（或-20℃保存）酶切鑒質(zhì)粒溶液110×BufferH110× 1Bgl 0.5無(wú)菌 6.5充分混勻，37℃水浴孵育1-2h電泳操①稱(chēng)1g瓊脂糖置三角瓶中，加100ml②微波爐加熱大約2③熔化的瓊脂糖自然冷卻到60～70℃時(shí)，加入EB5μl①將梳子垂 到膠床的小凹槽內(nèi)，梳齒底端和床面有1mm的間隙鋪膠：將冷卻致60℃的凝膠倒入準(zhǔn)備好的膠床內(nèi)，凝膠厚度約5水平電泳系室溫下靜置1小時(shí)左右，凝 。將帶凝膠的膠床置于電泳槽中，并使樣品孔樣品準(zhǔn)備：向核酸樣品中加入約為樣品體積1/6上樣：用加樣器吸取樣品，輕輕的加入到凝膠的樣品孔中，加樣量為10μl電泳條件：電壓80v；時(shí)間20～25預(yù)期實(shí)驗(yàn)結(jié)6.12.4

62注意事因EB存在，全部操作過(guò)程要帶防護(hù)手凝膠濃度選擇根據(jù)樣品DNA分子大小而定，所以電泳前應(yīng)對(duì) 段大小有瓊脂糖凝膠濃度與DNA分子的有效分離范膠濃度線性DNA分子大小質(zhì)粒 鑒為了檢查載體的外源片段是否與原來(lái)的序列一致，或發(fā)生突變的的方法是。星期內(nèi)就可獲得結(jié)果。可用生物Chromas查看結(jié)果，D