第二講植物組織培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)基的重要性:1)植物材料生長的營養(yǎng)來源；2)調(diào)節(jié)植物材料生長與分化的主要途徑。第一節(jié)培養(yǎng)基的組成培養(yǎng)基種類比較多共同之處：含有植物生長發(fā)育所必須的營養(yǎng)物質(zhì)和生物活性物質(zhì)(激素）不同之處：配制培養(yǎng)基的化學(xué)試劑、培養(yǎng)基成分的濃度與比例不同成分培養(yǎng)基名稱MSSHB5WPMVW大量元素(mg/L)KNO3190025002500525NH4NO31650400NH4H2PO4300Ca(NO3)2·4H2O556(NH4)2SO4134500K2SO4990MgSO4·7H2O370400250370250CaCl2·2H2O44020015096KH2PO4170170250NaH2PO4150Ca3(PO4)2200有機營養(yǎng)（維生素和氨基酸,mg/L）MSSHB5WPVWNicotinicacid(煙酸)0.55.01.00.5Pyridoxin-HCl(Vt-B6)0.50.51.00.5Thiamine-HCl(Vt-B1)0.15.010.01.0myo-inositol(肌醇)1001000100100Glycine(甘氨酸)2.02.0碳源(sugar,g/L)Sucrose蔗糖3030202020二、無機營養(yǎng)不同培養(yǎng)基的無機鹽（特別是大量元素）的濃度差異很大。

16種必需元素：大量元素：C,H,O,N,P,K,Ca,Mg,S微量元素：Fe,Cl,Cu,Mo,B,Zn,Mn一、

水

要求純凈：蒸餾水、去離子水，雙蒸水三、

有機營養(yǎng)有機營養(yǎng)=有機成分：維生素和氨基酸的總稱。常用：肌醇、煙酸、維生素B6、維生素B1和甘氨酸等。其它的維生素：維生素M（葉酸）、維生素B2（核黃素）、泛酸鈣等。其它氨基酸：谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺等難培養(yǎng)的材料，可增加有機成分的種類。

四、碳源

最常用的糖是蔗糖(sucrose)，但也有用葡萄糖(glucose)、果糖(fructose)或其它的糖，有時幾種糖混用。糖是營養(yǎng)物質(zhì)，但不是越多越好。培養(yǎng)基中糖的用量大多在10-60g/L，一般為20-30g/L。

1.生長素(Auxins)

吲哚乙酸(IAA)

吲哚丁酸(IBA)

120元/1g187元/5gSigma公司2,4-Dichlorophenoxyacetic

acid

(2,4-D)2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)除草劑240元/100gZeatin玉米素(ZT)

（遇高溫不穩(wěn)定）常用2.細胞分裂素

(Cytokinins)

574元/5mg13256元/250mg番茄、楊樹異戊烯基腺嘌呤:2-isopentenyladenine,2iP;遇高溫不穩(wěn)定1226元/1g杜鵑花6-benzylaminopurine

6-芐基氨基嘌呤（6-BA,BA,BAP）

最常用298元/1gKinetin激動素

（KT）

常用688元/1gThidiazuron(TDZ；噻苯隆

):

棉花脫葉劑；后發(fā)現(xiàn)具有強烈的細胞分裂素的作用，比BA的效果高幾十-幾百倍。常用730元/25mg噻苯隆

生長素和細胞分裂素的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用對于植物組織培養(yǎng)技術(shù)的建立起了決定性的作用。1957年：FolkeKarlSkoog和Carlos

Miller發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中生長素和激動素濃度比值決定煙草愈傷組織根或芽的形成。FolkeKarlSkoog(July15,1908–February15,2001)In1962,SkoogandToshioMurashige發(fā)表了最著名的植物組織培養(yǎng)基，MurashigeandSkoogmedium,MS培養(yǎng)基。MurashigeTandSkoog,F.(1962)Arevisedmediumforrapidgrowthandbioassayswithtobaccotissuecultures.PhysiolPlant18:100-127)生長素濃度細胞分裂素濃度生根生芽愈傷組織3、赤霉素

（Gibberellins）

赤霉素種類很多，有七、八十種，其中以赤霉酸3（Gibberellicacid,GA3）用得最普遍。675元/1gGA3赤霉素的生理作用赤霉素最顯著的作用是促進細胞的伸長，也有打破種子休眠的作用。在植物組織培養(yǎng)中使用赤霉素主要用于促進芽或莖的伸長。赤霉素對熱不穩(wěn)定，故不能用高溫法消毒。5、脫落酸（Abscisicacid）ABA

400元/100mg熱不穩(wěn)定促進植物的衰老，植物組織培養(yǎng)很少用。在胚狀體（embryoid）的誘導(dǎo)和培養(yǎng)中常常使用脫落酸，促進胚狀體的成熟。

七、有機附加物

（Organicadditives）

水解酪蛋白、水解乳蛋白、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母提取物：用量為0.1-10g/L，一般為0.5-3g/L。椰子汁：100-200ml/L。這些物質(zhì)的成分復(fù)雜、不明確，統(tǒng)稱為有機附加物。當(dāng)材料生長不好時，加入這些物質(zhì)往往可以會明顯改善材料的生長狀況。

六、凝固劑瓊脂（agar）是最常用的凝固劑，用量為6-12g/L。另外還有phytagel,Gelrite,4g/L。

蝴蝶蘭葉片的褐化山藥褐化活性炭對莖段培養(yǎng)的影響

第二節(jié)培養(yǎng)基的配制

垂吊海棠

芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方：MS+蔗糖30.0g/L+瓊脂8g/L+BA2.0mg/L+NAA0.1mg/LMS培養(yǎng)基大量元素mg/L微量元素mg/LKNO31900MnSO4·4H2O22.3NH4NO31650KI0.83MgSO4·7H2O370H3BO36.2CaCl2·2H2O440ZnSO4·7H2O8.6KH2PO4170CuSO4·5H2O0.025煙酸0.5Na2MO4·2H2O0.25Vt-B60.5CoCl2·6H2O0.025Vt-B10.1FeSO4·7H2O27.8肌醇100Na2EDTA37.3甘氨酸2.0

為了便于培養(yǎng)基的配制，實際操作過程中可以先將常用的成分配成一定濃度的母液（stocksolution），然后在配各種試驗培養(yǎng)基時取一定量的母液稀釋?？梢耘涑赡敢旱氖菬o機鹽、有機成分和植物激素等。

1、無機鹽母液的配制（以MS培養(yǎng)基為例）

1）大量元素母液的配制：大量元素濃度比較高，故母液濃度(倍數(shù))不能過大，否則溶解不完全，容易析出(特別是冬天)，使用很不方便，一般為20、50或100倍。另一個要考慮的問題是高濃度時有些離子之間發(fā)生會發(fā)生相互作用，形成沉淀，如SO42-、PO43-和Ca2+之間。因此，在母液濃度較高時，Ca鹽要與硫酸鹽、磷酸鹽分開。

因此，母液濃度高時MgSO4和CaCl2要分開。如把KNO3和CaCl2·2H2O配在一起（母液I），NH4NO3、MgSO4·7H2O和KH2PO4配在一起（母液II），這樣，即使母液濃度達到100倍也不會出現(xiàn)沉淀。

MS大量元素mg/LKNO31900NH4NO31650MgSO4·7H2O370CaCl2·2H2O440KH2PO4170以MS培養(yǎng)基為例:當(dāng)母液濃度為20倍時，這5種鹽配在一起，不會出現(xiàn)沉淀；但當(dāng)母液濃度達到50倍時就出現(xiàn)沉淀。2）微量元素母液的配制：

除鐵鹽外，其它微量元素可以全部配在一起，濃度常為100~200倍。

Fe2+容易變成Fe3+而形成沉淀，不利于植物材料的吸收，所以把FeSO4同Na2EDTA配在一起，形成絡(luò)合鐵（穩(wěn)定，植物利用度高）。其母液濃度為100-200倍。配法是先分別將FeSO4和Na2EDTA溶解，然后等體積混合，邊混合邊攪拌，混合液為黃色。微量元素母液和鐵鹽要放在冰箱中保存。

2.有機成分母液的配制

一種培養(yǎng)基的有機成分(氨基酸和維生素)可以配在一起,100-200倍。有機成分母液應(yīng)放在冰箱中保存，否則容易生霉、變質(zhì)。

3.植物激素母液的配制

每種植物激素要單獨配一種母液，濃度為0.5-1.0mg/mL。激素不易溶于水，但易溶有機溶劑（乙醇、二甲基亞砜）和稀酸稀堿。70-90%乙醇：溶液無菌，加入培養(yǎng)基后pH不變。稀酸稀堿：需要過濾滅菌；加入培養(yǎng)基后pH會變。

激素母液也應(yīng)在低溫下保存。

第三節(jié)、培養(yǎng)基的制備

1.根據(jù)植物材料、培養(yǎng)目的設(shè)計好試驗培養(yǎng)基的配方（基本培養(yǎng)基，糖、植物激素、瓊脂和其它成分的濃度），并且要準(zhǔn)確無誤的寫在實驗記錄本上2.根據(jù)培養(yǎng)基的體積和母液濃度，求出各種成分的用量3.根據(jù)計算出來的結(jié)果，配成各種培養(yǎng)基誘導(dǎo)垂吊海棠葉片形成不定芽培養(yǎng)基：MS+蔗糖30.0g/L+瓊脂8.0g/L+BA2.0mg/L+NAA0.1mg/L，pH值5.8，體積1000ml。其操作步驟如下：1、計算出各種成分的用量，填寫培養(yǎng)基記錄表2、配制過程

（1）

稱好30.0g蔗糖和8.0g瓊脂，放入搪瓷量杯或其它金屬容器中，加600ml左右（總體積的2/3）蒸餾水，加熱、煮沸5min，至瓊脂完全熔化；（2）

按量加入各種成分，然后用蒸餾水定容至1000ml；(在記錄表上打鉤，防止漏加、多加)（3）

用KOH或NaOH和HCl調(diào)pH值至5.8。非常重要，pH值不僅影響瓊脂培養(yǎng)基的凝固效果，而且也影響培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分的有效性和植物材料的生長狀況（不同植物材料有不同的最佳pH環(huán)境，水稻、杜鵑花、蘭花等喜歡偏酸性）。（4）

分裝到培養(yǎng)容器中，容器盛培養(yǎng)基量為容器體積的1/5-1/3，但不要超過2/3，容器封口。3、培養(yǎng)基的消毒

培養(yǎng)基做好以后，要及時消毒，否則容易滋生細菌和真菌。這不僅會改變培養(yǎng)基的成分，而且菌物還會產(chǎn)生有毒的物質(zhì)。培養(yǎng)基的消毒方法有如下幾種：

1）

高溫滅菌法：簡單、易行；一次可以滅菌大量的培養(yǎng)基，最常用。所用的溫度是121℃，壓力是1.1—1.2大氣壓。高溫消毒時應(yīng)注意的問題：一定要先排氣10min，否則不能消毒不徹底；高溫消毒后，培養(yǎng)基的pH值會下降0.2—0.5個pH單位；高溫消毒過程中，培養(yǎng)基中有些物質(zhì)會被破壞或發(fā)生沉淀。如蔗糖會水解成葡萄糖和果糖，葡萄糖變成葡萄糖酸等；有些物質(zhì)甚至幾乎完全被破壞，如赤霉素、玉米素等。物質(zhì)破壞程度與消毒時間和壓力有關(guān)。

培養(yǎng)基體積與消毒時間的關(guān)系

培養(yǎng)基體積（ml）

消毒時間（min）

20-50

20（121℃）

50-500

25（121℃）

500-5000

35（121℃）

空試管、空瓶，培養(yǎng)皿、濾紙等用具

30（130℃）

2)過濾滅菌法過濾消毒不會破壞培養(yǎng)基的成分和改變培養(yǎng)基的pH值，所以在原生質(zhì)體和單細胞培養(yǎng)時要用過濾消毒法對培養(yǎng)基進行滅菌。熱不穩(wěn)定的物質(zhì)，如ZT、2ip、GA3、核黃素等，也要用過濾消毒法滅菌

無菌微孔濾膜：孔徑0.2-0.45m，比微生物及其孢子直徑小過濾滅菌的操作：

先將微孔濾膜（孔徑0.2-0.45m，用前最好在蒸餾水中浸泡數(shù)小時）裝入濾頭中，用紙或布將其包好，再高溫滅菌；在超凈工作臺上取出濾頭，用注射器吸取培養(yǎng)基或溶液，將注射器接在濾頭入口端，推動注射器使培養(yǎng)基或溶液從濾頭出口處流出，并用無菌容器收集濾液。

過濾滅