細(xì)菌分離培養(yǎng)及移植在細(xì)菌學(xué)診斷中，分離培養(yǎng)是不可缺少的一環(huán)。分離培養(yǎng)的目的主要是在含多種細(xì)菌的病料或培養(yǎng)物中挑選出某種細(xì)菌。在分離培養(yǎng)時(shí)應(yīng)注意：選擇適合于所分離細(xì)菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、氣體條件等。同時(shí)應(yīng)嚴(yán)格按無(wú)菌操作程序進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并做好標(biāo)記。［目的要求］掌握細(xì)菌分離培養(yǎng)的基本要領(lǐng)和方法。掌握厭氧菌培養(yǎng)的原理及其方法。［實(shí)驗(yàn)材料］菌種：大腸桿菌斜面、大腸桿菌與金黃色葡萄球菌混合培養(yǎng)肉湯等。器械：剪刀、記號(hào)筆(以上小組共用)。培養(yǎng)基：普通肉湯和普通瓊脂斜面、普通瓊脂和鮮血瓊脂平板、酒精燈、接種環(huán)(以上每人一套)。［需氧性細(xì)菌分離培養(yǎng)法］1．劃線分離培養(yǎng)法此法為常用的細(xì)菌分離培養(yǎng)法。平板劃線培養(yǎng)的方法甚多，可按各人的習(xí)慣選擇應(yīng)用，其目的都是達(dá)到使被檢材料適當(dāng)?shù)南♂?，以求獲得獨(dú)立單在的菌落，防止發(fā)育成菌苔，以致不易鑒別其菌落性狀。劃線培養(yǎng)時(shí)須注意以下幾點(diǎn)：圖5-1瓊脂平板上各種方式的劃線培養(yǎng)法圖5-1瓊脂平板上各種方式的劃線培養(yǎng)法左手持皿，用左手的拇指、食指及中指將皿蓋揭開呈20。左右的角度(角度愈小愈好，以免空氣中的細(xì)菌進(jìn)入皿中將培養(yǎng)基污染)。右手持接種環(huán)，從大腸桿菌與金黃色葡萄球菌混合培養(yǎng)肉湯中取少許材料涂布于培養(yǎng)基邊緣，然后將接種環(huán)上多余的材料在火焰中燒毀，待接種環(huán)冷卻后，再與所涂材料的地方輕輕接觸，開始劃線，方法如圖(5T)。劃線前先將接種環(huán)稍稍彎曲，這樣易和平皿內(nèi)瓊脂面平行，不致劃破培養(yǎng)基。劃線中不宜過多地重復(fù)舊線，以免形成菌苔。接種完畢，在皿底上作好菌名、日期和接種者等標(biāo)記，平皿倒扣，置37°C培養(yǎng)。2．純培養(yǎng)的獲得與移植法將劃線分離培養(yǎng)37C24h的平板從溫箱取出，挑取單個(gè)菌落，經(jīng)染色鏡檢，證明不含雜菌，此時(shí)用接種環(huán)挑取單個(gè)菌落，移植于瓊脂斜面培養(yǎng)，得到的培養(yǎng)物，即為純培養(yǎng)物，再作其他各項(xiàng)試驗(yàn)檢查和致病性試驗(yàn)等。具體操作方法如下：（1）兩試管斜面移植時(shí)，左手斜持菌種管和被接種瓊脂斜面管，使管口互相并齊，管底部放在拇指和食指之間，松動(dòng)兩管棉塞，以便接種時(shí)容易拔出（圖5—2）。右手持接種棒，在火焰上滅菌后，用右手小指和無(wú)名指并齊同時(shí)拔出兩管棉塞，將管口進(jìn)行火焰滅菌，使其靠近火焰（圖5—3）。將接種環(huán)伸入菌種管內(nèi)，先在無(wú)菌生長(zhǎng)的瓊脂上接觸使之冷卻，再挑取少許細(xì)菌后拉出接種環(huán)立即伸入另一管斜面培養(yǎng)基上，勿碰及斜面和管壁，直達(dá)斜面底部。從斜面底部開始劃曲線，向上至斜面頂端為止，管口通過火焰滅菌，將棉塞塞好（圖5—4）。接種完畢，接種環(huán)通過火焰滅菌后放下接種棒。最后在斜面管壁上注明菌名、日期和接種者，置37°C溫箱中培養(yǎng)。（2）從平板培養(yǎng)基上選取可疑菌落移植到瓊脂斜面上作純培養(yǎng)時(shí)，則用右手執(zhí)接種棒，將接種環(huán)火焰滅菌，左手打開平皿蓋，挑取可疑菌落，左手蓋上平皿蓋后立即取斜面管，按上述方法進(jìn)行接種、培養(yǎng)。3．肉湯增菌培養(yǎng)為了提高由病料中分離培養(yǎng)細(xì)菌的機(jī)會(huì)，在用平板培養(yǎng)基做分離培養(yǎng)的同時(shí)，多用普通肉湯做增菌培養(yǎng)，病料中即使細(xì)菌很少，這樣做也多能檢查出。另外用肉湯培養(yǎng)細(xì)菌，以觀察其在液體培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)表現(xiàn)，也是鑒別細(xì)菌的依據(jù)之一。其操作方法與斜面純培養(yǎng)相同：無(wú)菌取病料少許接種增菌培養(yǎng)基或普通肉湯管內(nèi)于37C下培養(yǎng)。4．穿刺培養(yǎng)半固體移植用穿刺法接種。方法基本上與純培養(yǎng)接種相同，不同的是用接種針挑取菌落，垂直刺人培養(yǎng)基內(nèi)。要從培養(yǎng)基表面的中部一直刺入管底，然后按原方向退出即可。5?傾注培養(yǎng)法取3支融化后冷卻至45C左右的瓊脂管，用接種環(huán)取一環(huán)培養(yǎng)物移至第一管內(nèi)，搖勻。從第一管取一接種環(huán)至第2管，振蕩。再由第2管取一接種環(huán)至第3管，混勻。將3管含有培養(yǎng)物的瓊脂分別倒入3個(gè)滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)做成平板，凝固后倒放于37C恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，24h后觀察結(jié)果。第一管的平板菌數(shù)甚多，而第2、第3管之平板則漸漸減少，此法現(xiàn)在應(yīng)用較少。6．芽孢需氧菌分離培養(yǎng)法若懷疑材料中有帶芽孢的細(xì)菌，先將檢查材料接種于一個(gè)含有液體培養(yǎng)基的試管中，然后將它置于水浴箱，加熱到80°C，維持15?20min,再行培養(yǎng)。材料中若有帶芽抱的細(xì)菌，其仍能存活并發(fā)育生長(zhǎng)，不耐熱的細(xì)菌繁殖體則被殺滅。7．利用化學(xué)藥品的分離培養(yǎng)法抑菌作用：有些藥品對(duì)某些細(xì)菌有極強(qiáng)的抑制作用，而對(duì)另一些細(xì)菌則無(wú)效，故可利用此種特性來(lái)進(jìn)行細(xì)菌的分離，例如通常在培養(yǎng)基中加入結(jié)晶紫或青霉素抑制革蘭氏陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)，以分離革蘭氏陰性菌。殺菌作用：將病料如結(jié)核病病料加入15％硫酸溶液中處理，其他雜菌皆被殺死結(jié)核菌因具有抗酸活性而存活。鑒別作用：根據(jù)細(xì)菌對(duì)某種糖具有分解能力，通過培養(yǎng)基中指示劑的變化來(lái)鑒別某種細(xì)菌。例如SS瓊脂培養(yǎng)基可以用做鑒別大腸桿菌與沙門氏桿菌。8．通過實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分離法當(dāng)分離某種病原菌時(shí)，可將被檢材料注射于敏感性高的實(shí)動(dòng)物體內(nèi)，如將結(jié)核菌材料注射于豚鼠體內(nèi)，雜菌不發(fā)育，而豚鼠最終患慢性結(jié)核病而死。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死后，取心血或臟器用以分離細(xì)菌。有時(shí)甚至可得到純培養(yǎng)。［厭氧性細(xì)菌的分離培養(yǎng)法］厭氧菌需有較低的氧化一還原勢(shì)能才能生長(zhǎng)（例如破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌需氧化一還原電勢(shì)降低至0.1lV時(shí)才開始生長(zhǎng)），在有氧的環(huán)境下，培養(yǎng)基的氧化一還原電勢(shì)較高，不適于厭氧菌的生長(zhǎng)。為使培養(yǎng)基降低電勢(shì)，降低培養(yǎng)環(huán)境的氧壓是十分必要的。現(xiàn)有的厭氧培養(yǎng)法甚多，主要有生物學(xué)、化學(xué)和物理學(xué)3種方法，可根據(jù)各實(shí)驗(yàn)室的具體情況而選用。1．生物學(xué)方法培養(yǎng)基中含有植物組織（如馬鈴薯、燕麥、發(fā)芽谷物等）或動(dòng)物組織（新鮮無(wú)菌的小片組織或加熱殺菌的肌肉、心、腦等），由于組織的呼吸作用或組織中的可氧化物質(zhì)氧化而消耗氧氣（如肌肉或腦組織中不飽和脂肪酸的氧化能消耗氧氣，碎肉培養(yǎng)基的應(yīng)用，就是根據(jù)這個(gè)原理），組織中所含的還原性化合物如谷胱甘肽也可以使氧化一還原電勢(shì)下降。另外，將厭氧菌與需氧菌共同培養(yǎng)在一個(gè)平皿內(nèi)，利用需氧菌的生長(zhǎng)將氧消耗后，使厭氧菌能生長(zhǎng)。其方法是將培養(yǎng)皿的一半接種吸收氧氣能力強(qiáng)的需氧菌（如枯草桿菌），另一半接種厭氧菌，接種后將平皿倒扣在一塊玻璃板上，并用石蠟密封，置37C恒溫箱中培養(yǎng)2?3d后，即可觀察到需氧菌和厭氧菌均先后生長(zhǎng)。2．化學(xué)方法利用還原作用強(qiáng)的化學(xué)物質(zhì)，將環(huán)境或培養(yǎng)基內(nèi)的氧氣吸收，或用還原氧化型物質(zhì)，降低氧化一還原電勢(shì)。李伏夫（B.M.JIbbob）法此法系用連二亞硫酸納（Sod~Lkrnhydrosulphite）和碳酸鈉以吸收空氣中的氧氣，其反應(yīng)式如下：Na2S204+Na2C03+02Na2S04+Na2S03+C02ft如打貯門卞圖ft如打貯門卞圖5-5李伏夫氏厭氧培養(yǎng)法取一有蓋的玻璃罐，罐底墊一薄層棉花，將接種好的平皿重疊正放于罐內(nèi)(如系液體培養(yǎng)基，則直立于罐內(nèi))，最上端保留可容納1?2個(gè)平皿的空間(視玻罐的體積而定)，按玻罐的體積每1000cm3空間用連二亞硫酸鈉及碳酸鈉各30g，在紙上混勻后，盛于上面的空平皿中，加水少許使混合物潮濕，但不可過濕，以免罐內(nèi)水分過多。若用無(wú)蓋玻罐，則可將平皿重疊正放在淺底容器上，以無(wú)蓋玻罐罩于皿上，罐口周圍用膠泥或水銀封閉(如圖5-5)。焦性沒食子酸法焦性沒食子酸在堿性溶液中能吸收大量氧氣，同時(shí)由淡棕變?yōu)樯钭厣慕剐詻]食橙(Purpurgallin)。每100cm3空間用焦性沒食子酸1g及10%氫氧化納或氫氧化鉀10ml，其具體方法主要有下列幾種：(1)單個(gè)培養(yǎng)皿法：將厭氧菌接種于血瓊脂平板。取方形玻璃板一塊，中央置紗布或棉花或重疊濾紙一片，在其上放焦性沒食子酸0.2g及10%NaOH溶液0.5mL。迅速拿去皿蓋，將培養(yǎng)皿倒置于其上，周圍以融化石蠟或膠泥密封。將此玻璃板連同培養(yǎng)皿放入37°C溫箱培養(yǎng)24?48h后，取出觀察。Buchner氏試管法(圖5—6):取一大試管，在管底放焦性沒食子酸0.5g及玻璃珠數(shù)個(gè)或放一螺旋狀鉛絲。將已接種的培養(yǎng)管放人大試管中，迅速加入20%NaOH溶液0.5ml,立即將管口用橡皮塞塞緊，必要時(shí)周圍封以石蠟°37°C培養(yǎng)24?48h后觀察。玻罐或干燥器法：置適量焦性沒食子酸于一干燥器或玻罐的隔板下面，將培養(yǎng)皿或試管置于隔板上，并在玻罐內(nèi)置美藍(lán)指示劑一管，從罐側(cè)加入氫氧化鈉溶液放于罐底，將焦性沒食子酸用紙或紗布包好，用線系住，暫勿與氫氧化鈉接觸，待一切準(zhǔn)備好后，將線放下，使焦性沒食子酸落入氫氧化納溶液中，立即將蓋蓋好，封緊，置溫箱中培養(yǎng)。

瑞(wright)氏法：將已接種細(xì)菌的培養(yǎng)管的脫脂棉塞在火焰中燒灼滅菌后，塞入管中離培養(yǎng)基1?1.5cm處，置適量焦性沒食子酸于其上，加入10%Na0H溶液2ml,迅速用橡皮塞將管口塞緊，以膠泥或石蠟嚴(yán)密封閉置溫箱中培養(yǎng)(圖5—7)。史(Spray)氏法：用圖5—8所示的厭氧培養(yǎng)皿，在皿底一邊置焦性沒食子酸,另一邊置氫氧化鈉溶液，將已接種的平皿翻蓋于皿上，并將接合處用膠泥或石蠟密封完全，然后搖動(dòng)底部，使氫氧化鈉溶液與焦性沒食子酸混合，置溫箱中培養(yǎng)。平皿法：置一片中有小圓孔的金屬板于兩平皿之間，上面的平皿接種細(xì)菌，下面的平皿盛焦性沒食子酸及氫氧化鈉溶液，用膠泥封固后，置溫箱中培養(yǎng)(圖5—9)。硫乙醇酸鈉法硫乙醇酸鈉(HSCH2COONa)是一種還原劑，加入培養(yǎng)基中，能除去其中的氧或還原氧化型物質(zhì)，促使厭氧菌生長(zhǎng)。其他可用的還原劑包括葡萄糖、維生素C、半胱氨酸等。(1)液體培養(yǎng)基法：將細(xì)菌接種入含0.1％的硫乙醇酸鈉液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)24?48h后觀察，本培養(yǎng)基中加美藍(lán)液作為氧化還原的指示劑，在無(wú)氧條件下，美藍(lán)被還原成無(wú)色。(2)固體培養(yǎng)基法：常采用特殊構(gòu)造的Brewer氏培養(yǎng)皿，可使厭氧菌在培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)而形成孤立的菌落。操作過程是先將Brewer-氏皿干熱滅菌，將熔化且冷卻至50C左右的硫乙醇酸鈉固體培養(yǎng)基傾入皿內(nèi)。待瓊脂冷凝后，將厭氧菌接種于培養(yǎng)基的中央部分。蓋上皿蓋，使皿蓋內(nèi)緣與培養(yǎng)基外圍部分相互緊密接觸(圖5—10)。此時(shí)皿蓋與培養(yǎng)基中央部分留在空隙間的少量氧氣可被培養(yǎng)基中的硫乙醇酸鈉還原，故美藍(lán)應(yīng)逐漸褪色，而外緣部分，因與大氣相通，故仍呈藍(lán)色。將Brewer氏培養(yǎng)皿置于37C恒溫箱內(nèi)，經(jīng)過24?48h后觀察。3．物理學(xué)方法利用加熱、密封、抽氣等物理學(xué)方法，以驅(qū)除或隔絕環(huán)境及培養(yǎng)基中的氧氣，使其形成厭氧狀態(tài)，有利于厭氧菌的生長(zhǎng)發(fā)育。厭氧罐法常用的厭氧罐有Brewer-氏罐、Broen氏罐和Mclntosh-Fildes二氏罐(圖5-11)。將接種好的厭氧菌培養(yǎng)皿依次放于厭氧罐中，先抽去部分空氣，代以氫氣至大氣壓。通電，使罐中殘存的氧與氫經(jīng)鉑或鈀的催化而化合成水，使罐內(nèi)氧氣全部消失。將整個(gè)厭氧罐放入孵育箱培養(yǎng)。本法適用大量的厭氧菌培養(yǎng)。真空干燥器法將欲培養(yǎng)的平皿或試管放入真空干燥器中，開動(dòng)抽氣機(jī)，抽至高度真空后，替代以氫、氮或二氧化碳?xì)怏w。將整個(gè)干燥器放進(jìn)孵育箱培養(yǎng)。高層瓊脂法加熱融化高層瓊脂，冷至45°C左右接種厭氧菌，迅速混合均勻。冷凝后37C培養(yǎng)，厭氧菌在近管底處生長(zhǎng)。加熱密封法將液體培養(yǎng)基放在阿諾氏蒸鍋內(nèi)加熱lOmin,驅(qū)除溶解于液體中的空氣，取出，迅速置于冷水中冷卻。接種厭氧菌后，在培養(yǎng)基液面覆蓋一層約0.5cm的無(wú)菌凡士林石蠟，置37C培養(yǎng)。此外，尚有搖振培養(yǎng)法，此處從略。［二氧化碳培養(yǎng)法］少數(shù)細(xì)菌如布氏桿菌（牛型）等，孵育時(shí)，需大氣中添加5%?10%二氧化碳，方能使之生長(zhǎng)繁殖旺盛。常用的方法是置于C02培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；最簡(jiǎn)單的二氧化碳培養(yǎng)法是在盛放培養(yǎng)物的有蓋玻璃缸內(nèi)，燃點(diǎn)蠟燭，當(dāng)火焰熄滅時(shí)，該缸的大氣中，就約增加了5%?10%的二氧化碳。也可用化學(xué)物質(zhì)作用后生成二氧化碳，如碳酸氫鈉與硫酸鈉或碳酸氫鈉與硫酸作用即可生成二氧化碳。若各用0.4%NaHC02與30%H2S041mL，則可產(chǎn)生22.4mL的二氧化碳?xì)怏w。［思考題］1．分離培養(yǎng)的目的是什么?何謂純培養(yǎng)?2．在挑取固體培養(yǎng)物上的細(xì)菌作平板分區(qū)劃線時(shí)，為什么在每區(qū)之間都要將接種環(huán)上剩余的細(xì)菌燒掉?3．培養(yǎng)皿培養(yǎng)時(shí)為什么要倒置?、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵蟆靶竽廖⑸飳W(xué)”課程實(shí)驗(yàn)教學(xué)的目的在于配合該課程的課堂教學(xué)，幫助學(xué)生驗(yàn)證和鞏固課堂教學(xué)的某些重要內(nèi)容，培養(yǎng)他們具備無(wú)菌操作技能和微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室基本操作技能等的良好素質(zhì)。畜牧微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)是以微生物（包括病原微生物）、免疫血清等進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)。微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)要求嚴(yán)謹(jǐn)、細(xì)心、無(wú)菌操作，才能獲得可靠的結(jié)果。在微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，除須注意一般實(shí)驗(yàn)的共同項(xiàng)外，須特別注意無(wú)菌操作，防止一般微生物的污染、散布，并防止病原微生物的實(shí)驗(yàn)室感染。實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格要求學(xué)生，弄通實(shí)驗(yàn)原理，聽從老師指導(dǎo)，嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)操作程序進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，才能培養(yǎng)好他們進(jìn)行無(wú)菌操作和微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的良好素質(zhì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，要求學(xué)生全面熟悉總結(jié)本次實(shí)驗(yàn)所涉及的內(nèi)容、儀器、材料、方法及操作技能等，認(rèn)真完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告，為打下堅(jiān)實(shí)的微生物學(xué)技術(shù)技能奠定良好的基礎(chǔ)。二、實(shí)驗(yàn)教學(xué)條件“3+1（準(zhǔn)備室，內(nèi)含無(wú)菌間）”標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室1個(gè)，5人實(shí)驗(yàn)臺(tái)6個(gè)，畜牧微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室專用工作服、冒35套，可供每次約30人上實(shí)驗(yàn)課。約9m2的無(wú)菌間1間，超凈操作臺(tái)1個(gè)，微生物光學(xué)顯微鏡30臺(tái)，隔水式恒溫培養(yǎng)箱2個(gè)，厭氧培養(yǎng)箱1個(gè)，普通冰箱、低溫冰箱各1臺(tái)，高壓蒸汽滅菌鍋1個(gè)，干熱滅菌器（干烤箱）1個(gè)，普通離心機(jī)3臺(tái)，可調(diào)溫電爐6個(gè)，電子天平3臺(tái)，恒溫水浴箱1個(gè)，數(shù)碼生物顯微鏡，倒置顯微鏡，CO培養(yǎng)箱，二氧化碳鋼瓶等等。微生物學(xué)專用洗滌、滅菌室。2三、實(shí)驗(yàn)材料微生物示教片，載玻片，蓋玻片，接種環(huán)，酒精燈，酒精棉球，消毒劑，試管，試管架，染色缸，染色架，搪瓷缸，量筒，漏斗及漏斗架，玻璃棒，天平，三角瓶，膠管夾子，硅膠塞，沙布，脫脂棉，電爐，培養(yǎng)皿，吸管，吸耳球，乳頭滴管，搪瓷盤，試管，試管架，打孔器，濕盒，大、中、小試管及試管架，小導(dǎo)管，大、小磨口瓶，擦鏡紙等等；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（小鼠、兔子、雞等），細(xì)菌、真菌多種菌種，染色劑，乳酸石炭酸液，液體石蠟、燈用酒精，蒸餾水，蛋白胨，牛肉膏，NaCl,NaOH,HCl,磷酸鹽，pH試紙，免疫血清學(xué)試驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)抗原、陽(yáng)性血清、陰性血清，0.5%石炭酸生理鹽水等等。

四、實(shí)驗(yàn)課主要內(nèi)容序號(hào)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目學(xué)時(shí)實(shí)驗(yàn)類別實(shí)驗(yàn)類型實(shí)驗(yàn)內(nèi)容具體要求1細(xì)菌形態(tài)和構(gòu)造的觀察細(xì)菌抹片的制備和染色3基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)顯微鏡油鏡的使用和保養(yǎng)，細(xì)菌形態(tài)和構(gòu)造的觀察（示范鏡），細(xì)菌抹片的制備、染色和鏡檢。掌握顯微鏡油鏡的使用，認(rèn)識(shí)細(xì)菌的外形、大小、排列方式及一些特殊構(gòu)造。掌握細(xì)菌抹片的制備方