1糖及其代謝物的測定Biobase1糖及其代謝物的測定

血液中的葡萄糖稱為血糖。血糖測定是臨床生化檢驗(yàn)中歷史最久、占日常工作量比重較大的項(xiàng)目之一。過去測定血糖多采用全血，但目前多采用血清或血漿。測定血糖的方法很多，可分為三大類：氧化還原法、縮合法及酶法。國際上推薦的參考方法是已糖激酶法，但試劑比較昂貴，不適用于常規(guī)分析。我國已淘汰氧化還原法，推薦的方法是葡萄糖氧化酶法，而目前有些基層單位仍沿用鄰甲苯胺法。Biobase2血清(漿)葡萄糖及其代謝的檢測項(xiàng)目

葡萄糖氧化酶法測定血清（漿）葡萄糖

己糖激酶法測定血清（漿）葡萄糖血清(漿)糖化蛋白的測定Biobase3葡萄糖氧化酶法測定血清（漿）葡萄糖(1)【試劑】

1．0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0)稱取無水磷酸氫二鈉8.67g及無水磷酸二氫鉀5.3g溶于蒸餾水800ml中，用1mol/L氫氧化鈉(或1mol/L鹽酸)調(diào)pH至7.0，用蒸餾水定容至1L。

2．酶試劑稱取過氧化物酶1200U，葡萄糖氧化酶1200U，4-氨基安替比林10mg，疊氮鈉100mg，溶于磷酸鹽緩沖液80ml中，用1mol/LNaOH調(diào)pH至7.0，用磷酸鹽緩沖液定容至100ml，置4℃保存，可穩(wěn)定3個(gè)月。

3．酚溶液稱取重蒸餾酚100mg溶于蒸餾水100ml中，用棕色瓶貯存。

4．酶酚混合試劑酶試劑及酚溶液等量混合，4℃可以存放1個(gè)月。5．12mmol/L苯甲酸溶液溶解苯甲酸1.4g于蒸餾水約800ml中，加溫助溶，冷卻后加蒸餾水定容至lL。6．100mmol/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)貯存液稱取已干燥恒重的無水葡萄糖1.802g，溶于12mmol/L苯甲酸溶液約70ml中，以12mmol/L苯甲酸溶液定容至100ml。2h以后方可使用。

7．5mmol/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)貯存液5.0ml放于100ml容量瓶中，用12mmol/L苯甲酸溶液稀釋至刻度，混勻。Biobase5葡萄糖氧化酶法測定血清（漿）葡萄糖(2)【操作步驟】1．自動(dòng)分析法按儀器說明書的要求進(jìn)行測定。2．手工操作法取試管3支，按表8-1操作。

混勻，置37℃水浴中，保溫15min，在波長505nm處比色，以空白管調(diào)零，讀取標(biāo)準(zhǔn)管及測定管吸光度。【計(jì)算】葡萄糖（mmol/L）=標(biāo)準(zhǔn)管（OD)/樣本管（OD）【參考范圍】空腹血清葡萄糖為3.89～6.11mmol/L

?；靹颍?7℃水浴中，保溫15min，在波長505nm處比色，以空白管調(diào)零，讀取標(biāo)準(zhǔn)管及測定管吸光度。Biobase6葡萄糖氧化酶法測定血清（漿）葡萄糖(3)【臨床意義】1．生理性高血糖可見攝入高糖食物后，或情緒緊張腎上腺分泌增加時(shí)。

2．病理性高血糖

(1)糖尿?。翰±硇愿哐浅Ｒ娪谝葝u素絕對(duì)或相對(duì)不足的糖尿病患者。

(2)內(nèi)分泌腺功能障礙：甲狀腺功能亢進(jìn)，腎上腺皮質(zhì)功能及髓質(zhì)功能亢進(jìn)。引起的各種對(duì)抗胰島素的激素分泌過多也會(huì)出現(xiàn)高血糖。注意升高血糖的激素增多引起的高血糖，現(xiàn)已歸入特異性糖尿病中。

(3)顱內(nèi)壓增高：顱內(nèi)壓增高刺激血糖中樞，如顱外傷、顱內(nèi)出血、腦膜炎等。

(4)脫水引起的高血糖：如嘔吐、腹瀉和高熱等也可使血糖輕度增高。

3．生理性低血糖見于饑餓和劇烈運(yùn)動(dòng)。

4．病理性低血糖(特發(fā)性功能性低血糖最多見，依次是藥源性、肝源性、胰島素瘤等)(1)胰島β細(xì)胞增生或胰島β細(xì)胞瘤等，使胰島素分泌過多。

(2)對(duì)抗胰島素的激素分泌不足，如垂體前葉功能減退、腎上腺皮質(zhì)功能減退和甲狀腺功能減退而使生長素、腎上腺皮質(zhì)激素分泌減少。

(3)嚴(yán)重肝病患者，由于肝臟儲(chǔ)存糖原及糖異生等功能低下，肝臟不能有效地調(diào)節(jié)血糖。Biobase7葡萄糖氧化酶法測定血清（漿）葡萄糖(4)【注意事項(xiàng)】1．葡萄糖氧化酶對(duì)β-D葡萄糖高度特異，溶液中的葡萄糖約36%為α型，64%為β型。葡萄糖的完全氧化需要α型到β型的變旋反應(yīng)。國外某些商品葡萄糖氧化酶試劑盒含有葡萄糖變旋酶，可加速這一反應(yīng)，但在終點(diǎn)法中，延長孵育時(shí)間可達(dá)到完成自發(fā)變旋過程。新配制的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液主要是α型，故須放置2h以上(最好過夜)，待變旋平衡后方可應(yīng)用。

2．葡萄糖氧化酶法可直接測定腦脊液葡萄糖含量，但不能直接測定尿液葡萄糖含量。因?yàn)槟蛞褐心蛩岬雀蓴_物質(zhì)濃度過高，可干擾過氧化物酶反應(yīng)，造成結(jié)果假性偏低。

3．測定標(biāo)本以草酸鉀－氟化鈉為抗凝劑的血漿較好。取草酸鉀6g，氟化鈉4g。加水溶解至100ml。吸取0.1ml到試管內(nèi)，在80℃以下烤干使用，可使2～3ml血液在3～4天內(nèi)不凝固并抑制糖分解。

4．本法用血量甚微，操作中應(yīng)直接加標(biāo)本至試劑中，再吸試劑反復(fù)沖洗吸管，以保證結(jié)果可靠。

5．嚴(yán)重黃疽、溶血及乳糜樣血清應(yīng)先制備無蛋白血濾液，然后再進(jìn)行測定。Biobase8己糖激酶法測定血清（漿）葡萄糖（1）

【原理】葡萄糖和三磷酸腺苷(ATP)在己糖激酶(hexokinase，HK)催化下，發(fā)生磷酸化反應(yīng)，生成葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)與二磷酸腺苷(ADP)。G-6-P在葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G-6-PD)的催化下脫氫，生成6-磷酸葡萄糖酸(6-PGA)，同時(shí)使NADP+還原成NADPH＋H+，還原型NADPH的生成速度與葡萄糖濃度成正比，在波長340nm監(jiān)測吸光度升高速率，可計(jì)算血清中葡萄糖濃度。【試劑】

l．酶混合試劑己糖激酶測定葡萄糖，多用試劑盒，目前國外生產(chǎn)試劑盒的廠家很多，但酶混合試劑的配方大同小異。酶混合試劑的組成成分與濃度如下：三乙醇胺鹽酸緩沖液(pH7.5)50mmol/LMgSO42mmol/LATP2mmol/LNADP2mmol/LHK＞1500U/LG-6-PD2500U/L

根據(jù)試劑盒說明書配制，保存于4℃冰箱。

2．100mmol/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)貯存液見實(shí)驗(yàn)39。

3．5mmol/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液見實(shí)驗(yàn)39Biobase10己糖激酶法測定血清（漿）葡萄糖（3）【注意事項(xiàng)】1．HK是關(guān)鍵的工具酶，必須使用高純度產(chǎn)品，其比活性應(yīng)＞140IU/mg酶蛋白(25℃)。雜酶G-6-DP、谷胱甘肽還原酶、6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶均應(yīng)＜0.01%HK活性單位，磷酸葡萄糖異構(gòu)酶＜0.02%HK活性單位。HK的最適pH6.0～9.0，pI為4.5～4.8。Mg2+為HK的激活劑，EDTA為抑制劑。

2．G-6-PD亦是關(guān)鍵的工具酶，其純度要求高，比活性應(yīng)＞140IU/mg酶蛋白(25℃)。雜酶磷酸葡萄糖變位酶和6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶均應(yīng)＜0.01%G-6-PD活性單位，谷胱甘肽還原酶和磷酸葡萄糖異構(gòu)酶均應(yīng)＜0.02%G-6-PD活性單位。以NADP+為輔酶的最適pH＞8.5，以NAD+為輔酶的最適pH為7.8。

3．NAD+或NADP+的純度要求達(dá)98%以上。

4．對(duì)整個(gè)試劑的要求

(1)試劑空白在保溫30min時(shí)吸光度小于0.1，保溫6min與30min間吸光度變化＜0.01。

(2)33.3mmol/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液在保溫30min后的吸光度在1.6～1.8之間，保溫8min與30min吸光度之差＜0.01。

5．如用耐熱的葡萄糖激酶代替HK，即可提高專一性，又可提高穩(wěn)定性。Biobase12血清(漿)糖化蛋白的測定(1)

------果糖胺法測定糖化血清蛋白

【原理】血清蛋白質(zhì)分子中的末端氨基能與葡萄糖經(jīng)非酶促反應(yīng)生成高分子酮胺結(jié)構(gòu)。其生成量直接與血糖濃度有關(guān)，并且和糖化血紅蛋白高度相關(guān)。在堿性溶液中，這種酮胺結(jié)構(gòu)與硝基四氮唑藍(lán)(NBT)發(fā)生還原反應(yīng)，產(chǎn)生紫紅色甲臢然后以具有同樣氨基-1-脫氧-2-酮糖結(jié)構(gòu)的1-脫氧-1-嗎啉果糖(DMF)為標(biāo)準(zhǔn)同時(shí)操作，作比色測定。【試劑】1．0.1mol/L碳酸鹽緩沖液(pH10.8)無水碳酸鈉9.54g，碳酸氫鈉0.84g，溶于蒸餾水并定容至1000ml。

2．0.11mmol/LNBT試劑稱取氯化硝基四氮唑藍(lán)100mg，用上述緩沖液溶解并定容至1000ml。置冰箱保存，至少可穩(wěn)定3個(gè)月。

3．40g/L牛血清白蛋白溶液。

4．4mmol/LDMF標(biāo)準(zhǔn)液稱取DMF99.6mg，溶于40g/L牛血清白蛋白溶液100ml中。Biobase14血清(漿)糖化蛋白的測定(2)

------果糖胺法測定糖化血清蛋白

【操作】1．樣本的測定按表8-5操作?；靹颍?7℃水浴中15min，取出試管在流水中冷卻15min(＜25℃)，于550nm波長處空白管調(diào)零，讀取測定管吸光度，從校正曲線上查出DMF濃度。2．校正曲線制備取4mmol/LDMF標(biāo)準(zhǔn)液用牛血清白蛋白溶液(40g/L)稀釋成1、2、3、4mmol/L，并以40g/L牛血清白蛋白為空白，與測定管同樣操作，讀得各濃度DMF相應(yīng)的吸光度。以DMF濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，制成校正曲線。糖化血清蛋白濃度在4mmol/L內(nèi)與吸光度呈線性關(guān)系。Biobase15血清(漿)糖化蛋白的測定

(3)

------果糖胺法測定糖化血清蛋白【參考范圍】1.90.25mmol/LDMF?！九R床意義】1．血清蛋白半壽期較短(血清白蛋白17天，總蛋白30天，Hb為120天)，本試驗(yàn)可有效地反映患者過去1～2周內(nèi)的血糖控制水平。

2．本試驗(yàn)不受臨時(shí)血糖濃度波動(dòng)的影響，對(duì)糖尿病人的診斷和較長時(shí)間血糖控制水平的觀察，以及同一患者前后連續(xù)檢測結(jié)果的比較具有一定的價(jià)值?！咀⒁馐马?xiàng)】1．必須嚴(yán)格控制pH值、反應(yīng)溫度及反應(yīng)時(shí)間。

2．37℃加溫15min時(shí)間需正確掌握并立即冷卻，否則顏色將繼續(xù)加深影響結(jié)果。所以在測定時(shí)宜加測已知濃度DMF的質(zhì)控管，以觀察與校正曲線的符合程度。有人認(rèn)為改用加入10%乙酸0.1ml，比用物理冷卻終止效果更佳，可使pH降至7.0以下而有效地終止反應(yīng)。

3．DMF的合成方法稱取無水D-葡萄糖90g(0.5mol)，嗎啡啉58g(0.67mol)，加蒸餾水1L，溶解后在60～70℃水浴上攪拌，開始為黃色糊狀物，后顏色逐漸加深。20min后，移去水浴，緩慢地加入丙二酸18g(0.17mol