實時熒光定量PCR技術(shù)的原理及應(yīng)用(RealtimeQuantitativePCR)

分子生物學(xué)技術(shù)平臺江燕瓊realtimepcr絕對定量和相對定量課件提綱：

實時熒光定量PCR原理數(shù)學(xué)原理化學(xué)原理實時熒光定量PCR的方法應(yīng)用絕對定量相對定量定量PCR的實驗要素平臺定量PCR儀器介紹提綱：

實時熒光定量PCR定義：在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實現(xiàn)了實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，對起始模板進(jìn)行定量分析的方法。實時熒光定量PCR定義：

與普通PCR的區(qū)別

普通PCR技術(shù)：在PCR結(jié)束后對終點產(chǎn)物進(jìn)行定量分析。實時定量PCR技術(shù)：實時檢測PCR擴增，在擴增的指數(shù)期對起始模板進(jìn)行定量。

與普通PCR的區(qū)別

realtimepcr絕對定量和相對定量課件realtimepcr絕對定量和相對定量課件realtimepcr絕對定量和相對定量課件熒光閾值是在熒光擴增曲線上人為設(shè)定的一個值，它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴增階段任意位置上，一般熒光域值的設(shè)置是基線（背景）熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為CT值（thresholdvalue）。熒光閾值是在熒光擴增曲線上人為設(shè)定的一個值，它可以設(shè)定在熒光realtimepcr絕對定量和相對定量課件

定量PCR的數(shù)學(xué)原理

定量PCR的數(shù)學(xué)原理

realtimepcr絕對定量和相對定量課件

斜率與擴增效率

斜率與擴增效率realtimepcr絕對定量和相對定量課件

熒光定量PCR化學(xué)原理

非特異性熒光標(biāo)記：

1、SYBRGreen

特異性熒光標(biāo)記：

2、TaqMan

熒光定量PCR化學(xué)原理

非特異性熒光標(biāo)記：1、SYBRGreen法1、SYBRGreen法SYBRGreen熔解曲線分析

SYBRGreen熔解曲線分析

SYBRGreen法優(yōu)缺點優(yōu)點:對DNA模板沒有選擇性適用于任何DNA使用方便--不必設(shè)計復(fù)雜探針非常靈敏便宜SYBRGreen法優(yōu)缺點2、TaqMan探針法

2、TaqMan探針法

TaqMan作用機理

TaqMan作用機理

TaqMan法優(yōu)缺點

TaqMan法優(yōu)缺點

Real-timePCR方法應(yīng)用realtimepcr絕對定量和相對定量課件?絕對定量(AbsoluteQuantification，AQ)

病原體檢測轉(zhuǎn)基因食品檢測基因表達(dá)研究?相對定量(RelativeQuantification，RQ)

基因在不同組織中的表達(dá)差異藥物療效考核耐藥性研究realtimepcr絕對定量和相對定量課件

絕對定量與相對定量的定義

絕對定量與相對定量的定義

絕對定量通過標(biāo)準(zhǔn)品定量絕對定量的標(biāo)準(zhǔn)樣品：已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒DNA，做系列稀釋。標(biāo)準(zhǔn)樣品的種類：?含有和待測樣品相同擴增片段的克隆質(zhì)粒?含有和待測樣品相同擴增片段的cDNA?PCR的產(chǎn)物絕對定量通過標(biāo)準(zhǔn)品定量絕對定量：從熒光到拷貝數(shù)

絕對定量：從熒光到拷貝數(shù)

相對定量通過內(nèi)標(biāo)定量

內(nèi)標(biāo)（EndogenousControl）通常是β-actin、GAPDH基因等看家基因在細(xì)胞中的表達(dá)量或在基因組中的拷貝數(shù)恒定，受環(huán)境因素影響小內(nèi)標(biāo)定量結(jié)果代表了樣本中所含細(xì)胞或基因組數(shù)量

相對定量通過內(nèi)標(biāo)定量

相對定量：參照因子Calibrator

相對定量：參照因子Calibrator

相對定量分析方法1-ΔΔCt

前提：目標(biāo)序列和內(nèi)參序列的擴增效率接近100％且偏差在5％以內(nèi)

1、用內(nèi)參基因的CT值歸一目標(biāo)基因的CT值：

ΔCT（test)=CT（target,test)-CT（ref,test)ΔCT（calibrator)=CT（target,calibrator)-CT（ref,calibrator)2、用校準(zhǔn)樣本的ΔCT值歸一試驗樣本的ΔCT值：

ΔΔCT=ΔCT（test)-ΔCT（calibrator)3、計算表達(dá)水平比率：

2–ΔΔCT=表達(dá)量的比值

相對定量分析方法1-ΔΔCt

前提：目標(biāo)序列和內(nèi)

相對定量分析方法2：雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法

目標(biāo)基因與內(nèi)參基因擴增效率不同

待測樣品目的基因濃度

待測樣品內(nèi)參基因濃度

F=

對照樣品目的基因濃度對照樣品內(nèi)參基因濃度

相對定量分析方法2：雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法

目標(biāo)基因與內(nèi)參基因擴增效

定量PCR的實驗要素

樣品

●DNA純度：OD260/OD280=1.8，1.6~2.0之間●DNA用量：0.05ng–100ng●RNA純度：OD260/OD280=2.0●cDNA用量：1-100ng總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA取1uL

樣品

標(biāo)準(zhǔn)品

標(biāo)準(zhǔn)品

標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋方法

標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋方法

復(fù)管測試●樣品和標(biāo)準(zhǔn)品都要重復(fù)●重復(fù)次數(shù)須遵循統(tǒng)計學(xué)要求realtimepcr絕對定量和相對定量課件平臺PCR儀介紹ABI7500fast特征：使用96孔板，樣品量大，儀器穩(wěn)定，結(jié)果分析直觀ABI試劑ROX校正物理方面的誤差：槍的誤差（如試劑體積）、耗材質(zhì)量（如管蓋厚度、透光性能不一致）所導(dǎo)致的光能損失、儀器穩(wěn)定性（如孔間、批間溫度的波動）Rn=Normalization=Reporter/Referenc平臺PCR儀介紹ABI7500fast特征：Rotorgene6500HRM特征：36孔(普通透明0.2mlPCR管)或者72孔(特殊0.1ml管)離心式檢測可以做HRM。Rotorgene6500HRM特征：MJOpticon2特征：可以使用8連排管或96孔板，軟件操作簡單MJOpticon2特征：

謝謝！

實時熒光定量PCR技術(shù)的原理及應(yīng)用(RealtimeQuantitativePCR)

分子生物學(xué)技術(shù)平臺江燕瓊realtimepcr絕對定量和相對定量課件提綱：

實時熒光定量PCR原理數(shù)學(xué)原理化學(xué)原理實時熒光定量PCR的方法應(yīng)用絕對定量相對定量定量PCR的實驗要素平臺定量PCR儀器介紹提綱：

實時熒光定量PCR定義：在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實現(xiàn)了實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，對起始模板進(jìn)行定量分析的方法。實時熒光定量PCR定義：

與普通PCR的區(qū)別

普通PCR技術(shù)：在PCR結(jié)束后對終點產(chǎn)物進(jìn)行定量分析。實時定量PCR技術(shù)：實時檢測PCR擴增，在擴增的指數(shù)期對起始模板進(jìn)行定量。

與普通PCR的區(qū)別

realtimepcr絕對定量和相對定量課件realtimepcr絕對定量和相對定量課件realtimepcr絕對定量和相對定量課件熒光閾值是在熒光擴增曲線上人為設(shè)定的一個值，它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴增階段任意位置上，一般熒光域值的設(shè)置是基線（背景）熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為CT值（thresholdvalue）。熒光閾值是在熒光擴增曲線上人為設(shè)定的一個值，它可以設(shè)定在熒光realtimepcr絕對定量和相對定量課件

定量PCR的數(shù)學(xué)原理

定量PCR的數(shù)學(xué)原理

realtimepcr絕對定量和相對定量課件

斜率與擴增效率

斜率與擴增效率realtimepcr絕對定量和相對定量課件

熒光定量PCR化學(xué)原理

非特異性熒光標(biāo)記：

1、SYBRGreen

特異性熒光標(biāo)記：

2、TaqMan

熒光定量PCR化學(xué)原理

非特異性熒光標(biāo)記：1、SYBRGreen法1、SYBRGreen法SYBRGreen熔解曲線分析

SYBRGreen熔解曲線分析

SYBRGreen法優(yōu)缺點優(yōu)點:對DNA模板沒有選擇性適用于任何DNA使用方便--不必設(shè)計復(fù)雜探針非常靈敏便宜SYBRGreen法優(yōu)缺點2、TaqMan探針法

2、TaqMan探針法

TaqMan作用機理

TaqMan作用機理

TaqMan法優(yōu)缺點

TaqMan法優(yōu)缺點

Real-timePCR方法應(yīng)用realtimepcr絕對定量和相對定量課件?絕對定量(AbsoluteQuantification，AQ)

病原體檢測轉(zhuǎn)基因食品檢測基因表達(dá)研究?相對定量(RelativeQuantification，RQ)

基因在不同組織中的表達(dá)差異藥物療效考核耐藥性研究realtimepcr絕對定量和相對定量課件

絕對定量與相對定量的定義

絕對定量與相對定量的定義

絕對定量通過標(biāo)準(zhǔn)品定量絕對定量的標(biāo)準(zhǔn)樣品：已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒DNA，做系列稀釋。標(biāo)準(zhǔn)樣品的種類：?含有和待測樣品相同擴增片段的克隆質(zhì)粒?含有和待測樣品相同擴增片段的cDNA?PCR的產(chǎn)物絕對定量通過標(biāo)準(zhǔn)品定量絕對定量：從熒光到拷貝數(shù)

絕對定量：從熒光到拷貝數(shù)

相對定量通過內(nèi)標(biāo)定量

內(nèi)標(biāo)（EndogenousControl）通常是β-actin、GAPDH基因等看家基因在細(xì)胞中的表達(dá)量或在基因組中的拷貝數(shù)恒定，受環(huán)境因素影響小內(nèi)標(biāo)定量結(jié)果代表了樣本中所含細(xì)胞或基因組數(shù)量

相對定量通過內(nèi)標(biāo)定量

相對定量：參照因子Calibrator

相對定量：參照因子Calibrator

相對定量分析方法1-ΔΔCt

前提：目標(biāo)序列和內(nèi)參序列的擴增效率接近100％且偏差在5％以內(nèi)

1、用內(nèi)參基因的CT值歸一目標(biāo)基因的CT值：

ΔCT（test)=CT（target,test)-CT（ref,test)ΔCT（calibrator)=CT（target,calibrator)-CT（ref,calibrator)2、用校準(zhǔn)樣本的ΔCT值歸一試驗樣本的ΔCT值：

ΔΔCT=ΔCT（test)-ΔCT（calibrator)3、計算表達(dá)水平比率：

2–ΔΔCT=表達(dá)量的比值

相對定量分析方法1-ΔΔCt

前提：目標(biāo)序列和內(nèi)

相對定量分析方法2：雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法

目標(biāo)基因與內(nèi)參基因擴增效率不同

待測樣品目的基因濃度

待測樣品內(nèi)參基因濃度

F=

對照樣品目的基因濃度對照樣品內(nèi)參基因濃度

相對定量分析方法2：雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法

目標(biāo)基因與內(nèi)參基因擴增效

定量PCR的實驗要素