DNA氧化損傷標志物8-羥基脫氧鳥苷檢測方法及其臨床意義史華旭;吳子一;陳世奇;劉天依;倪月秋【摘要】8-羥基脫氧鳥苷(8-OH-dG)是活性氧(ROS)攻擊DNA分子中的鳥嘌呤堿基第8位碳原子而產(chǎn)生的一種氧化性加合物，在體內(nèi)穩(wěn)定存在，易于檢測，其含量可反映DNA氧化損傷程度，是目前公認的一種評價DNA氧化損傷和氧化應(yīng)激狀態(tài)的生物標志物.本文對8-OH-dG的常用檢測方法及其在相關(guān)疾病中的作用進行綜述以期為臨床相關(guān)疾病的診斷和治療提供依據(jù).【期刊名稱】《沈陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報》【年(卷)，期】2019(021)001【總頁數(shù)】4頁(P79-82)【關(guān)鍵詞】8-羥基脫氧鳥苷;檢測;DNA氧化損傷【作者】史華旭;吳子一;陳世奇瀏天依;倪月秋【作者單位】沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧沈陽110034;沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧沈陽110034;沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧沈陽110034;沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,遼寧沈陽110034;沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，遼寧沈陽110034【正文語種】中文［中圖分類】R446.1活性氧(reactiveoxgenspecies，ROS)是需氧細胞在代謝過程中產(chǎn)生一系列活性氧簇，包括超氧自由基(?O2-)、過氧化氫(H2O2)、羥自由基(?OH)等［1］。機體在正常情況下會清除體內(nèi)多余的活性氧，維持機體氧化還原平衡。一旦該平衡被打破，就會使ROS積聚，引起DNA氧化損傷，導(dǎo)致基因突變、細胞癌變和個體衰老等。8-羥基脫氧鳥苷(8-hydroxy-2-deoxyguanosine,8-OH-dG)是ROS攻擊DNA分子中的鳥嘌呤堿基第8位C原子結(jié)合-OH而產(chǎn)生的一種氧化性加合物，在體內(nèi)穩(wěn)定存在，一旦形成，不再被機體進一步代謝，且其生成不受飲食等因素影響，可被特異性DNA修復(fù)酶剪切清除，經(jīng)腎臟隨尿液排出［2］。8-OH-dG是目前公認的一種評價DNA氧化損傷和氧化應(yīng)激狀態(tài)的生物標志物，對許多疾病的診斷評估具有重要意義［2］。本文對8-OH-dG的檢測方法及其與相關(guān)疾病如職業(yè)暴露疾病、糖尿病腎病、腫瘤、男性不育、心血管疾病、兒童相關(guān)疾病等的相關(guān)性進行了綜述。1常用的檢測方法1.1酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)ELISA法是應(yīng)用單克隆抗體檢測加合物的技術(shù)，是—種半定量的檢測方法，具有靈敏度和特異度高、操作簡單、重復(fù)性好、測定時間短且生物樣品不需要預(yù)處理、不需要昂貴的儀器等優(yōu)點，市面上可直接購買到檢測8-OH-dG的ELISA試劑。ELISA法是目前臨床研究普遍采用的檢測方法，可用來檢測組織、細胞、尿液和血液中的8-OH-dG。許海棠等［3］用ELISA法檢測30例川崎病患兒急性期、30例恢復(fù)期、12例正常對照組兒童及12例發(fā)熱組兒童的血清8-OH-dG水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)川崎病急性期患兒血清8-OH-dG水平顯著高于恢復(fù)期、正常對照組和發(fā)熱組(P<0.05),ROC曲線分析顯示，血清8-OH-dG的診斷界值為57.02pg/ml,敏感度為90%，特異性為75%，陽性預(yù)測值64.3%,陰性預(yù)測值93.8%，表明8-OH-dG可作為早期預(yù)測川崎病血管損傷的標志物。1.2高效液相色譜-電化學(xué)法(HPLC-ECD)HPLC-ECD法是將DNA酶水解樣品用HPLC分離后用ECD測定，是一種定量檢測方法，具有較高的靈敏度，需要的樣品量少，檢測線性范圍寬等特點［2］。HPLC-ECD法可同時檢測多種氧化產(chǎn)物，也可直接檢測組織細胞DNA、尿液和血液中的8-OH-dG濃度。魯文紅等［4］利用HPLCECD法測定HepG2細胞內(nèi)8-OH-dG的水平，發(fā)現(xiàn)8-OH-dG峰與雜質(zhì)峰分離良好，8-OH-dG濃度在1~25ng/ml之間呈良好線性，最低檢測濃度為0.39ng/ml,表明該方法檢測HepG2細胞內(nèi)8-OH-dG靈敏、準確、重復(fù)性好。Shimoi等［5］對ELISA和HPLC-ECD檢測8-OH-dG的對比分析發(fā)現(xiàn)，120份原始尿液樣本用HPLC-ECD檢測8-OH-dG的平均值為（4.46±2.03）pg/g肌酐，ELISA檢測8-OH-dG的平均值為（9.33±3.23川g/g肌酐，ELISA檢測值比HPLC-ECD高約2倍，而對HPLC純化的尿液樣品進行檢測，兩種方法的檢測平均值差異無統(tǒng)計學(xué)意義，因此，使用ELISA法進行檢測時，需要對樣品進行預(yù)純化處理，以確定樣品中8-OH-dG水平。HPLA-ECD法存在DNA酶解不完全、干擾物質(zhì)同時被洗出，導(dǎo)致測量值高于真實值的缺點。1.3高效毛細管電泳法（HPCE）HPCE是利用8-OH-dG與其他脫氧鳥苷泳動的方向和速度不同而進行分離，通過比較保留時間來定性，夕卜標法定量，分離效率高，較HPLC快，保留時間短［6］。顏流水等［7］利用納米金在線富集-毛細管電泳法測定尿樣中8-OH-dG水平，8-OH-dG與dG在10min內(nèi)可實現(xiàn)基線分離，8-OH-dG濃度在0.5-50.0pmol/L范圍內(nèi)呈線性，檢出限為39nmol/L,所得加標回收率在90.0%~104.6%。除了上述三種常用的檢測方法，氣相色譜-質(zhì)譜法（GC/MS）法、32P后標記法、免疫雜交法等也用來檢測8-OH-dG［2］。28-OH-dG與相關(guān)疾病8-OH-dG與職業(yè)暴露一些職業(yè)經(jīng)常接觸鎳、鉻、汞等金屬，長期職業(yè)暴露可能會影響工人的身體健康。研究顯示，職業(yè)性鎳接觸工人尿中8-OH-dG及尿鎳、尿鉻均高于對照組，鎳、鉻接觸工人的尿中鎳、鉻含量與8-OH-dG含量呈正相關(guān)（P<0.05），提示職業(yè)性的鎳、鉻接觸對工人產(chǎn)生一定的氧化損傷作用，且鎳、鉻接觸工人的工齡與尿中8-OH-dG及鉻、鎳含量均呈正相關(guān)（PV0.05），表明職業(yè)性鎳、鉻接觸危害程度與鎳、鉻暴露時間和接觸劑量有關(guān)［8］。8-OH-dG含量提高是由于鎳、鉻化合物可引起氧化應(yīng)激和DNA、蛋白質(zhì)的氧化損傷［9］。鐘麗［10］研究發(fā)現(xiàn)，空氣中汞濃度與工人尿汞濃度呈正相關(guān)（r=0.624,P<0.01），接觸汞者的尿8-OH-dG中位數(shù)為3.94pg/g肌酐，顯著高于非接觸汞者2.60pg/g肌酐，表明接觸汞可引起DNA氧化損傷。在焦炭生產(chǎn)工藝過程中產(chǎn)生的焦爐逸散物含有大量致癌性的多環(huán)芳烴，其在代謝過程中可產(chǎn)生大量ROS，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生氧化應(yīng)激。王艷華等［11］對低水平焦爐逸散物接觸與焦爐作業(yè)工人尿中8-OH-dG的劑量-效應(yīng)關(guān)系進行研究，發(fā)現(xiàn)接觸組人群尿中8-OH-dG水平高于對照組（P<0.01），且焦爐逸散物接觸水平與尿中8-OH-dG水平呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。焦爐逸散物已被國際癌癥組織列為確認人類致癌物，焦爐工肺癌亦已被列為我國法定職業(yè)性腫瘤［12］。此外，高藝等［13］研究發(fā)現(xiàn)，汽車制造廠工人長期低濃度苯系物暴露可引起人體內(nèi)自由基清除能力下降，引起機體氧化應(yīng)激損傷，表現(xiàn)為暴露組血清中氧化應(yīng)激損傷產(chǎn)物丙二醛（MDA）和8-OH-dG濃度顯著高于非暴露組（P<0.05）。上述重金屬對人體的危害不容小覷，8-OH-dG的含量在一定程度上可以提示身體健康狀況，并有望成為職業(yè)病體檢指標。8-OH-dG與糖尿病腎病糖尿病腎病是糖尿病常見的并發(fā)癥之一，也是終末期導(dǎo)致腎功能衰竭的主要原因。目前我國糖尿病腎病患病率已經(jīng)超過慢性腎小球腎炎，成為城市居民慢性腎病的重要病因［14］，但該病起病隱匿，故其早期診斷尤為重要。在高血糖狀態(tài)下，細胞內(nèi)氧化應(yīng)激加劇，導(dǎo)致8-OH-dG增加，其中尿8-OH-dG增加與糖尿病并發(fā)癥嚴重程度相一致［15］。吳孟水等［16］通過觀察不同時期糖尿病腎病患者血清8-OH-dG的水平發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病患者8-OH-dG濃度顯著高于健康對照組，而糖尿病腎病患者8-OH-dG濃度顯著高于單純2型糖尿病患者（P<0.01）,Logistic回歸分析顯示8-OH-dG是糖尿病腎病發(fā)生的獨立危險因素，表明血清8-OH-dG水平可以反映糖尿病腎病嚴重程度。Waris等［17］研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比，2型糖尿病患者血漿8-OH-dG濃度增加2倍，尿中8-OH-dG濃度增加28倍；2型糖尿病患者中，腎病與血漿8-OH-dG增加有關(guān)。因此8-OH-dG有望成為糖尿病腎病的早期診斷指標。8-OH-dG與腫瘤8-OH-dG能夠引起堿基配對錯誤，從而導(dǎo)致基因突變，進而誘發(fā)癌變。8-OH-dG的表達與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［18］。彭昭等［19］用HPLC法測定8-OH-dG在胃癌及癌周組織的含量，發(fā)現(xiàn)8-OH-dG水平在胃癌組織中明顯上調(diào)，與胃癌組織分化程度、臨床分期相關(guān)。劉志勇等［20］檢測了173例乳腺癌患者血清和150例乳腺癌患者癌組織中8-OH-dG的表達水平，并以HPLC-ECD法測定尿液中8-OH-dG水平，發(fā)現(xiàn)血清中8-OH-dG水平與組織中8-OH-dG水平的表達呈正相關(guān)(r=0.163,P<0.05)；在乳腺癌患者中，淋巴管及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的血清8-OH-dG水平較低；8-OH-dG免疫組化染色陰性患者生存率更低(P<0.01)；乳腺癌患者尿液中8-OH-dG濃度顯著高于健康婦女(P<0.01)，結(jié)果表明血清及癌組織中8-OH-dG低表達與乳腺癌的浸潤性相關(guān)，8-OH-dG染色陰性可能是乳腺癌患者的一個獨立預(yù)后因子，利用尿中8-OH-dG濃度可預(yù)測乳腺癌所產(chǎn)生的DNA損害，對乳腺癌產(chǎn)生的人體早期危害提供良好的生物指標。唐毅等［21］利用ELISA法檢測了100例肝癌患者的尿8-OH-dG水平，發(fā)現(xiàn)肝癌患者尿8-OH-dG水平顯著高于健康人群，表明DNA氧化損傷與肝癌發(fā)生發(fā)展具有密切的關(guān)系，測定尿8-OH-dG水平有助于肝癌的診治。徐興農(nóng)等［22］利用HPLC法檢測31例肺癌患者術(shù)前尿液樣本和術(shù)后樣本的8-OH-dG水平，發(fā)現(xiàn)肺癌術(shù)前組的尿液8-OH-dG水平顯著高于肺癌術(shù)后人群和健康人群，表明尿液8-OH-dG的含量檢測對于肺癌的診斷具有特異性，在肺癌的治療效果評估方面具有一定的實用價值°Pyl"s-Eerola等［23］利用ELISA法測定上皮樣卵巢癌(EOC)患者血清8-OH-dG水平，發(fā)現(xiàn)血清8-OH-dG水平高與較差的總生存期（OS）（P=0.019），較差的無病生存期（DFS）（P=0.020）,鉑耐藥性（P=0.002）相關(guān)，特別是在子宮內(nèi)膜樣EOC組中，患者血清8-OH-dG水平與較差DFS（P=0.005）和鉑耐藥性（P=0.007）顯著相關(guān)，表明血清8-OH-dG水平升高是EOC患者預(yù)后不良的重要預(yù)測因子。以上研究結(jié)果表明，8-OH-dG可作為一種腫瘤標志物來反映因癌變而產(chǎn)生的DNA氧化損傷程度，通過測定機體8-OH-dG含量，可對與氧化應(yīng)激損傷相關(guān)疾病進行早期監(jiān)測與預(yù)后評估。8-OH-dG與男性不育甄錦壯等［24］研究發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的男性不育患者精漿MDA和8-OH-dG濃度顯著升高（P<0.01），表明患者存在精子DNA氧化損傷，8-OH-dG可對精子DNA氧化損傷準確評價，是抗氧化治療的依據(jù)。8-OH-dG與心血管疾病DiMinno等［25］對8-OH-dG水平與心血管疾病之間的關(guān)系進行了Meta分析，納入14個研究，包括810例心血管疾病患者和1106例對照組，發(fā)現(xiàn)心血管疾病患者的8-OH-dG水平顯著高于對照組（SMD:1.04,95%CI:1.04-1.47,P<0.01），年齡、高血壓和男性性別顯著影響8-OH-dG水平。靳鈺［26］研究發(fā)現(xiàn)，缺血性心肌病患者的血清8-OH-dG水平顯著高于正常對照組。吳文翔［27］研究發(fā)現(xiàn)，冠心病合并阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（OSAHS）患者血清8-OH-dG水平顯著升高，提示患者的氧化應(yīng)激反應(yīng)偏高，檢測血清8-OH-dG水平對其有一定的臨床預(yù)警作用。8-OH-dG與兒童相關(guān)疾病缺血缺氧性腦病（HIE）是各種原因引起的腦組織缺血缺氧導(dǎo)致的腦部病變，最常見的是新生兒HIE。胎兒宮內(nèi)窘迫，如臍帶繞頸、羊水異常等，可導(dǎo)致新生兒HIE,其嚴重時可產(chǎn)生嚴重后遺癥。李曉梅等［28］研究發(fā)現(xiàn)，HIE患兒出生后第3天血清8-OH-dG水平明顯高于出生后第1、7天，相同時間點HIE患兒血清8-OH-dG水平明顯高于對照組，血清8-OH-dG水平與HIE嚴重程度相關(guān)，重度HIE患兒的8-OH-dG水平最高，表明8-OH-dG水平可作為判斷新生兒是否發(fā)生HIE的指標。早產(chǎn)兒腦損傷發(fā)病機制尚不完全清楚，圍產(chǎn)期窒息、缺氧、缺血和宮內(nèi)感染等有關(guān)，氧化應(yīng)激損傷是重要發(fā)病機制之一。劉海霞[29]以腦損傷早產(chǎn)兒為研究對象，觀察8-OH-dG在腦損傷早產(chǎn)兒血液的表達變化情況，發(fā)現(xiàn)腦損傷患者血和尿8-OH-dG表達水平顯著高于對照組，表明血和尿8-OH-dG是診斷早產(chǎn)兒腦損傷的早期指標，并推測氧化應(yīng)激損傷(DNA氧化損傷)可能是早產(chǎn)兒腦損傷的發(fā)病機制之一。侯小霞[30]研究發(fā)現(xiàn)，7~8歲組兒童尿液8-OH-dG水平顯著高于3~4歲組兒童(Pv0.05)，表明高年齡兒童處于一個較高的氧化應(yīng)激水平，并可能對兒童生長發(fā)育造成影響。前文提到的DNA氧化損傷與肝癌發(fā)生發(fā)展具有密切的關(guān)系，及某些重金屬暴露會引起機體氧化損傷，這兩點在兒童相關(guān)疾病上也有體現(xiàn)，8-OH-dG水平可作為評價兒童罹患肝癌風(fēng)險、兒童慢性鉛暴露等兒童相關(guān)疾病的發(fā)病風(fēng)險的標志物[31]?！鞠嚓P(guān)文獻】[1]于順，倪月秋啟噬、氧化應(yīng)激與2型糖尿病的關(guān)系[J].沈陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2018,20(1):93-96.[2]徐鵬琛，孫超.8-羥基脫氧鳥苷研究進展[J].淮海醫(yī)藥，2018,36(1):126-128.[3]許海棠，吳蓉洲，榮星.血清8-羥基脫氧鳥苷在川崎病患兒合并冠脈損害中的變化及意義[J].醫(yī)學(xué)研究雜志，2017,46(8):139-141,156.[4]魯文紅，來瑞平，張裕曾.HepG2細胞DNA損傷中8-OH-dG含量測定的高效液相色譜-電化學(xué)法[J].職業(yè)與健康，2011,27(19):2197-2199.[5]ShimoiK,KasaiH,YokotaN,etal.Comparisonbetweenhighperformanceliquidchromatographyandenzyme-linkedimmunosorbentassayforthedeterminationof8-hydroxy-2-deoxygusnosineinhumannrine[J].CancerEpidemiolBiomarkersPrev,2002,11(8):767-770.[6]劉勝林.8-羥基脫氧鳥苷檢測方法的研究進展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2006,12(17):1073-1074.[7]顏流水，任艷，郭會琴，等.基于納米金在線掃集-毛細管電泳法測定尿樣中8-羥基-2'脫氧鳥嘌吟核苷[J].理化檢驗(化學(xué)分冊)，2011,47(11):1253-1255.[8]左春雨，商慧珍，孫建婭，等.職業(yè)性鎳鉻接觸工人尿中8-羥基脫氧鳥苷的研究[J].中國藥物與臨床，2014,14(4):468-469.[9]剛葆琪，莊志雄.我國鎳毒理學(xué)研究進展[J].衛(wèi)生毒理學(xué)雜志，2000,14(3):129-135.[10]鐘麗.職業(yè)性汞接觸人群健康狀況及尿中8-羥基脫氧鳥苷影響因素調(diào)查分析[D].南京：南京醫(yī)科大學(xué)，2014.[11]王艷華，劉仲，趙紅偉，等.低水平焦爐逸散物對接觸人群尿中8-羥基脫氧鳥苷影響分析[J].中國職業(yè)醫(yī)學(xué)，2015,42(3):245-250.[12]鄧華欣，張望珍，黃坤，等.焦化作業(yè)環(huán)境空氣中顆粒物的污染特征研究[J].中華勞動衛(wèi)生職業(yè)病雜志，2012,30(12):898-901.[13]高藝，蔡木蔚，羅潘婷，等.長期低濃度苯系物暴露對汽車制造廠工人血清氧化應(yīng)激水平的影響[J].河南預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2017,28(5):329-331.[14]ZhangL,LongJ,JiangW,etal.TrendsinchronickidneydiseaseinChina[J].NEnglJMed,2016,375(9):905-906.[15]馬曉梅，馬璐婭.2型糖尿病與8羥基脫氧鳥苷[J].中國老年學(xué)雜志，2012,32(21):4851-4853.[16]吳孟水，李貞貞，寧翠利，等.8-羥基脫氧鳥苷水平與2型糖尿病腎臟病的相關(guān)性及危險因素分析[J].疑難病雜志，2016,15(5):460-464.[17]WarisS,Winklhofer-RoobBM,RoobJM,etal.IncreasedDNAdicarbonylglycationandoxidationmarkersinpatientswithtype2diabetesandlinktodiabeticnephropathy[J].JDiabetesRes,2015,2015:915486.[18]于晨，董超然，張照輝，等.8-羥基脫氧鳥嘌吟作為DNA氧化損傷標志物的研究現(xiàn)狀[J].中國臨床藥理學(xué)雜志,2017,33(13):1267-1270.[19]彭昭，田翠時，高會斌，等.PCNA、8-OHdG在胃癌組織中的表達及意義[J].實用醫(yī)學(xué)雜志,2016,32(8):1274-1276.[20]劉志勇，易堅，劉鳳恩.8-羥基脫氧鳥苷在乳腺癌患者血液、尿液及癌組織中的表達及意義[J].贛南醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2015,35(3):356-360[21]唐毅，李辛平，唐振勇，等.原發(fā)性肝癌患者尿8-羥基脫氧鳥苷水平的觀察[J].中國實驗診斷學(xué)，2013,17(10):1804-1806[22]徐興農(nóng)，曾慧慧，張照輝.基于HPLC法的人尿液8羥基脫氧鳥苷檢測在臨床腫瘤診斷中的應(yīng)用[J].臨床醫(yī)藥文獻電子雜志，2018,5(28):139,149.[23]Pylvas-EerolaM,KarihtalaP,PuistolaU.Preoperativeserum8-h