SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第1頁!一.什么是SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳?1.聚丙烯酰胺凝膠:由丙烯酰胺單體(Acr)和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺(Bis)在催化劑過硫酸銨(AP)或核黃素,以及加速劑四甲基乙二胺(TEMED)作用下聚合交聯(lián)而成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠.

形成的凝膠具有穩(wěn)定的親水性,無電離基團,不帶電荷,幾乎無吸附和電滲作用.凝膠孔徑可控制.SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第2頁!*凝膠機械性能和孔徑大小:由總濃度T%控制.即100ml凝膠溶液中含有Acr、Bis的總克數(shù).

T%越大,平均孔徑越小,機械強度大.交聯(lián)度C%:

Acr和Bis的比例.即交聯(lián)劑Bis占單體Acr與Bis總量的百分數(shù).SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第3頁!2.SDS:十二烷基磺硫酸鈉(sodiumdodecylsulfate,SDS)陰離子去污劑在水溶液中以單體（monomer）和分子團（micellae）的混合形式存在.破壞蛋白質(zhì)分子之間以及其他物質(zhì)分子之間的非共價鍵，使蛋白質(zhì)變性(denature)而改變原有的構(gòu)象，保證蛋白質(zhì)分子與SDS充分結(jié)合而形成帶負電荷的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物。SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第4頁!二.SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳基本原理:

SDS與樣品中各蛋白質(zhì)形成的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物帶有大量的負電荷,從而使天然蛋白質(zhì)分子間的電荷差別降低或減至最小,與此同時蛋白質(zhì)在SDS作用下結(jié)構(gòu)變得松散，形狀趨向一致使被測物的泳動速率的大小完全取決與該物質(zhì)的分子量.

SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第5頁!1.SDS陰離子去污劑,變性劑,助溶劑.斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵,分子去折疊,破壞蛋白質(zhì)分子的二級和三級結(jié)構(gòu).

SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第6頁!SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第7頁!蛋白質(zhì)-SDS膠束的特點

（1）形狀像一個長橢圓棒

（2）短軸對不同的蛋白質(zhì)亞基-SDS膠束基本上是相同的.

（3）長軸的長度則與亞基分子量的大小成正比.SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第8頁!*不同的蛋白質(zhì)分子有不同的電泳遷移率mR，自由遷移率m0和阻滯系數(shù)KR值不同蛋白質(zhì)的SDS復(fù)合物的m0值都很接近，分子量相差5倍的蛋白質(zhì)之間，m0值只相差10%，如果忽略這個差別,就可以認為，各種蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物的m0基本上是一個定值。這表明，不同蛋白質(zhì)的SDS復(fù)合物都帶有相同密度的負電荷，并具有同樣的構(gòu)象它們的凈電荷量與摩擦系數(shù)(f由溶液的粘滯性、蛋白質(zhì)分子的大小和形狀決定)之比（q/f）都接近于一個定值而不受各種蛋白質(zhì)原來電荷、分子大小和形狀的影響，因而，在溶液中，自由遷移率就表現(xiàn)出一致性；但在一定濃度的凝膠中，由于引入凝膠的分子篩效應(yīng)，電泳遷移率mR就成為蛋白質(zhì)分子量函數(shù).SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第9頁!3.影響SDS電泳的關(guān)鍵因素

(1)溶液中SDS單體濃度（>1mmol/L)

大多數(shù)蛋白質(zhì)與SDS結(jié)合的重量比為1：1.4

(2)樣品緩沖液的離子強度（不>0.26)

低離子強度的溶液中，SDS單體才具有較高的平衡濃度。SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第10頁!（二）緩沖系統(tǒng)的選擇

一般情況下，在被分析的蛋白質(zhì)穩(wěn)定的pH范圍，凡不與SDS發(fā)生相互作用的緩沖液都可以使用，但緩沖液的選擇對蛋白質(zhì)的分離和電泳的速度是非常關(guān)鍵的。SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第11頁!（三）凝膠濃度的選擇

由于SDS電泳分離并不取決于蛋白質(zhì)的電荷密度，只取決于分子解聚后SDS-蛋白質(zhì)膠束的大小，因此凝膠濃度的選擇會直接影響分辨率。

*不同分子量范圍的蛋白質(zhì)應(yīng)選用不同的凝膠濃度.

SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第12頁!SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第13頁!SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第14頁!2.作圖

以已知蛋白質(zhì)分子量的常用對數(shù)值為縱坐標，

Rf為橫坐標繪圖SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第15頁!

3.通過測定未知蛋白質(zhì)的Rf值，便可在標準曲線上讀出他的分子量*a.標準蛋白質(zhì)的相對遷移率最好在0.2—0.8之間均勻分布.

b.SDS-凝膠電泳法測定分子量，每次測定樣品必須同時做標準曲線，而不得利用另一次電泳的標準曲線。

SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第16頁!

三.去污劑的選擇

無離子去污劑：LubroW；Brij35，Tween

Triton

陽離子去污劑：cetyltrimethylammonium

bromide（CTAB）

cetylpyyridinium（CPC）

陰離子去污劑：SDSdeoxycholateSDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第17頁!（2）根據(jù)緩沖系統(tǒng)和凝膠孔徑的不同

連續(xù)電泳

不連續(xù)電泳

（3）根據(jù)電泳的形式

圓盤電泳

垂直電泳

平板電泳

水平電泳SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第18頁!SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第19頁!不連續(xù)系統(tǒng)中的三種物理效應(yīng)：

①電荷效應(yīng)：

②分子篩效應(yīng):

③濃縮效應(yīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第20頁!SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第21頁!SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第22頁!SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第23頁!SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第24頁!(3)加樣

樣品的處理

在蛋白溶液中加入過量的SDS后,可引起以下的反應(yīng)：

蛋白質(zhì)本身的電荷被屏蔽

氫鍵斷裂

疏水相互作用被取消

多肽被去折疊(二級結(jié)構(gòu)破壞),并形成橢球形SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第25頁!②帶有烷基化作用的還原SDS處理

烷基化作用可以很好地并經(jīng)久牢固地保護SH基團，而得到窄的電泳帶。SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第26頁!SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第27頁!(5)固定(6)染色

考馬斯亮藍（coomassiebrilliantblue）

①R-250

三苯基甲烷，紅藍色，每個分子含有兩個SO3H基團，偏酸性，和氨基黑一樣也是結(jié)合在蛋白質(zhì)的堿性基團上。

SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第28頁!②G-250

二甲花青亮藍，藍綠色SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第29頁!銀染色

銀染的機制是將蛋白帶上的硝酸銀（銀離子）還原成金屬銀，以使銀顆粒沉積在蛋白帶上。SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第30頁!(7)照相，凝膠干燥(8)定量測定SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第31頁!（2）“皺眉”現(xiàn)象

由于垂直電泳槽的裝置不合適引起的，特別是當凝膠和玻璃板組成的“三明治”底部有氣泡或靠近隔片的凝膠聚合不完全。

SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第32頁!(3)“拖尾”現(xiàn)象

樣品溶解不佳引起SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第33頁!(5)偏斜現(xiàn)象

電極放置不平行引起或加樣位置偏斜而引起SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第34頁!蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移

蛋白質(zhì)經(jīng)凝膠電泳分離后所得的區(qū)帶通過另一次電泳轉(zhuǎn)移到特定的固相支持物(常用硝酸纖維膜)上,稱為轉(zhuǎn)移電泳.蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移并固定特定的固相支持物上,然后一特定的親和反應(yīng)、免疫反應(yīng)或結(jié)合反應(yīng)以及顯色系統(tǒng)分析此印跡,稱為Western印跡法(WesternBlot).SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第35頁!SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第36頁!Western印跡:鑒定蛋白質(zhì)。Western使用的探針是抗體，它與附著于固相支持體的靶蛋白所呈現(xiàn)的抗原表位發(fā)生特異性反應(yīng)。這種技術(shù)的作用是對非放射性標記蛋白組成的復(fù)雜混合物中的某些特異蛋白進行鑒別和鑒定。

步驟:1.固定:蛋白質(zhì)行SDS電泳并從聚丙烯酰胺凝膠上轉(zhuǎn)移至固相載體上.2.封閉:保持膜上沒有特殊抗體結(jié)合的場所,使場所處于飽和狀態(tài),用以保護特異性抗體結(jié)合到膜上并與蛋白質(zhì)反應(yīng).3.初級抗體(抗體):特異性4.第二抗體或配體試劑:與一抗特異性結(jié)合并作為指示劑5.顯色SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第37頁!*階段為SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)?？乖鹊鞍讟悠方?jīng)SDS處理后帶陰電荷，在聚丙烯酰胺凝膠中從陰極向陽極泳動，分子量越小，泳動速度越快。此階段分離效果肉眼不可見(只有在染色后才顯出電泳區(qū)帶)。

第二階段為電轉(zhuǎn)移。將在凝膠中已經(jīng)分離的條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，選用低電壓(100V)和大電流(1—2A)，通電45min轉(zhuǎn)移即可完成。此階段分離的蛋白質(zhì)條帶肉眼仍不可見。

第三階段為酶免疫定位。將印有蛋白條帶的硝酸纖維素膜(相當于包被了抗原的固相載體)依次與特異性抗體和酶標第二抗體作用后，加入能形成不溶性顯色物的酶反應(yīng)底物，使區(qū)帶染色。常用的HRP底物為3，3，—二氨基聯(lián)苯胺(呈硝酸纖維素膜棕色)和4—氯—1—萘酚(呈藍紫色)。陽性反應(yīng)的條帶清晰可辨，并可根據(jù)SDS時加入的分子量標準，確定各組分的分子量。SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第38頁!SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第39頁!應(yīng)用：1.檢測樣品中特異蛋白的存在與否2.細胞中特異蛋白的半定量分析同一蛋白質(zhì)在不同細胞或統(tǒng)一細胞不同條件下的相對含量分析.3.蛋白質(zhì)分子相互作用的研究SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第40頁!*分子量范圍 適用的凝膠濃度(%) 蛋白質(zhì)

104 20-30 1-4×104 15-201-5×104-1×105 10-15 1×105 5-10

5×105 2-5 核酸 104 15–20 104–105 5-10 105-2×106

2-2.6

SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第41頁!聚丙烯酰胺凝膠為電泳支持物,電泳系統(tǒng)中加入一定濃度的SDS稱為SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS).

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳主要用于蛋白質(zhì)的分離、蛋白質(zhì)或肽類分子量的測定.SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第42頁!(一)蛋白質(zhì)分子的解聚

樣品介質(zhì)和聚丙烯酰胺中加入離子去污劑和強還原劑后，蛋白質(zhì)亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大小,而電荷因素可以被忽略。SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第43頁!2.強還原劑a.β-巰基乙醇b.二硫蘇糖醇(DTT)使半胱氨酸殘基之間的二硫鍵斷裂.SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第44頁!SDS和還原劑的作用：（1）分子被解聚

（2）氨基酸側(cè)鏈與SDS充分結(jié)合形成帶負電荷的蛋白質(zhì)-SDS膠束。

（3）蛋白質(zhì)-SDS膠束所帶的負電荷大大超

過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，消除了不同分子之間原有的電荷差異SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第45頁!

膠束在SDS系統(tǒng)中的電泳遷移率不再受蛋白質(zhì)原有電荷的影響，而主要取決于橢圓棒的長軸長度，即蛋白質(zhì)或亞基分子量的大小。

當?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在15KD—200KD之間時，電泳遷移率與分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系.SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第46頁!SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第47頁!（3）二硫鍵是否完全被還原：

只有在蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵被徹底還原的情況下，蛋白質(zhì)分子才能被解聚,SDS才能定量地結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上去，并使之具有相同的構(gòu)象而給出相對遷移率和分子量對數(shù)的線性關(guān)系。SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第48頁!電泳緩沖液的種類：

1.磷酸緩沖液

2.Tris-醋酸鈉緩沖系統(tǒng)

3.咪唑緩沖液系統(tǒng)：比磷酸緩沖系統(tǒng)的導(dǎo)電性低，電泳速度比后者快一倍.

4.尿素系統(tǒng)：

適用分子量低于15KD的蛋白樣品.

5.Tris-甘氨酸系統(tǒng)：

使用最多的緩沖液

6.Tris-硼酸鹽緩沖液：

測定糖蛋白的分子量

SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第49頁!SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第50頁!SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第51頁!（四）分子量測定

1.相對遷移率（relativemobility，Rf）

Rf即用每個帶的遷移距離除以溴酚藍前沿的遷移距離得到的。

測量位置應(yīng)在蛋白帶的中央。

蛋白帶遷移距離

Rf=————————

溴酚藍遷移距離

SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第52頁!SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第53頁!SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第54頁!四.方法

1.分類(1)根據(jù)對樣品的處理方式的不同

還原SDS電泳

非還原SDS電泳

帶有烷基化作用的還原SDS電泳

SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第55頁!SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第56頁!連續(xù)系統(tǒng)：電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷和分子篩效應(yīng).

不連續(xù)系統(tǒng)：緩沖液離子成分,pH,凝膠濃度及電位梯度均不連續(xù)性，帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應(yīng)，分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳.

SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第57頁!

2.操作

(1)制備分離膠（separatinggel)

(2)制備積層膠(stackinggel）SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第58頁!SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第59頁!SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第60頁!SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第61頁!SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第62頁!①還原SDS處理

當加入還原試劑DTT或β-二巰基乙醇后，蛋白質(zhì)被完全去折疊，只根據(jù)分子量分離。SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第63頁!③非還原的SDS處理

許多樣品，如生理體液、血清或尿素，一般只需用1%SDS在100℃煮沸3分鐘，并不需要加還原劑，此時二硫鍵不能被斷裂，蛋白并沒有完全被去折疊。SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第64頁!SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第65頁!SDS-聚丙烯酰胺凝膠共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第66頁!SDS-聚丙烯酰胺