基因工程制藥簡(jiǎn)介張義浜2017-05-20概述目的基因的獲得基因的表達(dá)基因工程菌的培養(yǎng)基因工程藥物的分離純化傳統(tǒng)制藥（生化制藥）存在的問題:1.材料來源或制造技術(shù)困難而無法研制出產(chǎn)品；

2.從動(dòng)物臟器中提取易感染病毒；

3.存在免疫原性，使用受限制?；蚬こ讨扑幍膬?yōu)點(diǎn)大量生產(chǎn)過去難以獲得的生理活性蛋白和多肽提供足夠數(shù)量的生理活性物質(zhì)發(fā)現(xiàn)更多的內(nèi)源性生理活性物質(zhì)利用基因工程和蛋白質(zhì)工程對(duì)生理活性物質(zhì)進(jìn)行修飾和改造，提高藥效價(jià)值獲得新型化合物，擴(kuò)大藥物篩選來源基因工程技術(shù)所生產(chǎn)的藥物

用傳統(tǒng)方法很難生產(chǎn)的，主要是藥用活性蛋白質(zhì)/多肽，包括：（1）免疫相關(guān)蛋白各種抗原、單克隆抗體。（2）細(xì)胞因子如IFN、IL、CSF、EGF、VIII、EPO（3）激素胰島素、生長(zhǎng)激素、心鈉素、人腦激素、人松馳激素。（4）酶類尿激酶、鏈激酶、葡聚糖酶、組織型纖維蛋白溶解酶原激活劑、SOD、a-淀粉酶、凝乳酶、人溶菌酶、胰蛋白酶抑制劑。早期部分基因工程產(chǎn)品的研制、開發(fā)、上市時(shí)間產(chǎn)品研制國(guó)家用途上市國(guó)家人生長(zhǎng)激素釋放抑制素(SRM)1977日本巨人癥人胰島素1978美國(guó)糖尿病1982歐洲人生長(zhǎng)激素（HGH）1979美國(guó)侏儒癥1985美國(guó)人α-干擾素（IFN）1980美國(guó)病毒1985歐洲乙肝疫苗1983美國(guó)乙肝1986歐洲人白細(xì)胞介素（IL）1984美國(guó)腫瘤1989歐洲人促紅細(xì)胞生成素（EPO）日本貧血1988歐洲人粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)白血病1991美國(guó)人組織纖溶酶原激活劑（t-PA）血栓癥1987美國(guó)我國(guó)批準(zhǔn)上市的部分生物技術(shù)藥物批準(zhǔn)年份藥品批準(zhǔn)年份藥品1989IFN-α1b1999125AlaIL-2、人胰島素、Anti-CD3鼠源單抗1992IFN-α2a2000人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、EGF衍生物霍亂疫苗（rBS-WC）1994白介素2（IL-2）2001抗IL-8鼠源單抗凝乳劑1995乙肝疫苗（酵母）2003IL-11、腫瘤細(xì)胞細(xì)胞核嵌合抗體注射液重組葡激酶（r-SAK）1996IFN-α2b，乙肝疫苗（CHO）粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）2004重組人p53腺病毒注射液抗EGFR人源單抗1997粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）重組鏈激酶（γ-SK）、EPO2005重組人腦利鈉肽、重組人血管內(nèi)皮抑素重組人5型腺病毒注射液（H101）、rhTNF-α、rhTPO1998IFN-γ、125SerIL-2、生長(zhǎng)激素（GH）痢疾疫苗、牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）2006重組TNFR-Fc融合蛋白

什么是基因工程技術(shù)？ 基因工程（geneticengineering）：也稱基因操作、遺傳工程，重組體DNA技術(shù)，基因克隆或分子克隆，指將不同生物的遺傳物質(zhì)——基因，在體外進(jìn)行剪切、組合和拼接，使遺傳物質(zhì)重新組合，然后通過載體（質(zhì)粒、噬菌體或病毒等）轉(zhuǎn)入微生物、植物或動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)行無性繁殖，并使所需要的基因在細(xì)胞中表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需要的產(chǎn)物或組建成新的生物類型。制備基因因工程藥藥物的基基本過程程獲得目的的基因↓↓構(gòu)構(gòu)建重重組質(zhì)粒?！M組建基基因工程程菌(或細(xì)胞)↓↓培養(yǎng)工程程菌↓↓產(chǎn)產(chǎn)物分離離純化↓↓除除菌過濾濾↓↓半半成品檢檢定↓↓成成品品檢定↓↓包包裝裝上游階段選擇表達(dá)達(dá)系統(tǒng)主主要考慮慮：必須保證證所表達(dá)達(dá)的蛋白白質(zhì)具有有生物活活性考慮基因因工程蛋蛋白質(zhì)表表達(dá)量的的多少蛋白質(zhì)分分離純化化的難易易程度下游階段基因的克隆工具酶功能限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個(gè)DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補(bǔ)3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標(biāo)記等反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶在3′羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基目的基因因的獲得得一、反轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄法二、反轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄PCR三、化學(xué)學(xué)合成法法常用的方方法:一、反轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄法為了克隆隆編碼某某種特異異蛋白質(zhì)質(zhì)多肽的DNA序列，可可以從產(chǎn)產(chǎn)生該蛋蛋白質(zhì)的真真核細(xì)胞胞中提取取mRNA,以其為模板板，在反反轉(zhuǎn)錄酶酶的作用用下，反轉(zhuǎn)錄生生成該蛋蛋白質(zhì)mRNA互補(bǔ)DNA（cDNA第一鏈）），再以以cDNA第一鏈為為模板，，在DNA聚合酶Ⅰ作用下，最最終合成成編碼該該多肽的的雙鏈DNA序列。cDNA克隆示意圖DNA聚合酶ImRNA

反轉(zhuǎn)錄酶ss-DNAds-cDNAds-cDNA核酸酶S1二、反轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄PCR提取組織織或細(xì)胞胞中的總總RNA，以其中中的mRNA作為模板，采用用Oligo(dT)或隨機(jī)引引物利用用逆轉(zhuǎn)錄錄酶反轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈，直接接以其為為模板（不需要要合成cDNA第二鏈）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得目的基因因，用于于重組、、克隆。。三、化學(xué)學(xué)合成法法前提：核核苷酸序列已知知；或已知其其蛋白質(zhì)質(zhì)的氨基基酸序列列，再推推導(dǎo)出核核苷酸序序列限制性：：1）不能直接合成太長(zhǎng)長(zhǎng)的基因因；2）遺傳密密碼的簡(jiǎn)簡(jiǎn)并性可可導(dǎo)致中中性突變變；3）成本較高DNA合成儀基因的克隆與與表達(dá)基因表達(dá)達(dá)：基因在生生物體中中的轉(zhuǎn)錄錄、翻譯譯及所有有加工過過程。基因高效效表達(dá)：：外源基基因在某某種宿主主細(xì)胞中中的表達(dá)達(dá)活動(dòng)，，即剪切切下一個(gè)個(gè)外源基基因片段段，重組組到另一一個(gè)基因因表達(dá)體體系中，，使其能能獲得既既有原生生物活性性又可高高產(chǎn)的表表達(dá)產(chǎn)物物。基因表達(dá)達(dá)研究的的主要問問題：目目的基因因的表達(dá)達(dá)產(chǎn)量、、表達(dá)產(chǎn)產(chǎn)物的穩(wěn)穩(wěn)定性、、產(chǎn)物的的生物學(xué)學(xué)活性和和表達(dá)產(chǎn)產(chǎn)物的分分離純化化。建立最佳佳的基因因表達(dá)體體系，是是基因表表達(dá)設(shè)計(jì)計(jì)的關(guān)鍵鍵一、宿主主菌的選選擇宿主菌應(yīng)應(yīng)滿足以以下要求求：具有高濃濃度、高高產(chǎn)量、、高產(chǎn)率率；能利用易易得廉價(jià)價(jià)原料；；不致病、、不產(chǎn)生生內(nèi)毒素素；發(fā)熱量低低，需氧氧低，適適當(dāng)?shù)陌l(fā)發(fā)酵溫度度和細(xì)胞胞形態(tài)；；容易進(jìn)行行代謝調(diào)調(diào)控；方便重組組DNA操作；產(chǎn)物容易易提取純純化。1.原核細(xì)胞胞（1）大腸桿桿菌表達(dá)產(chǎn)物物的形式式：細(xì)胞胞內(nèi)不溶溶性表達(dá)達(dá)(包涵體)、胞內(nèi)可可溶性表表達(dá)、細(xì)細(xì)胞周質(zhì)質(zhì)表達(dá)，，極少數(shù)數(shù)情況下下也可分分泌到細(xì)細(xì)胞外。。不同的的表達(dá)形形式具有有不同的的表達(dá)水水平及完完全不同同的雜質(zhì)質(zhì)。大腸桿菌菌表達(dá)外源基因因的優(yōu)勢(shì)勢(shì)全基因組組測(cè)序，，遺傳背背景清楚楚（共4405ORF）基因克隆隆表達(dá)系系統(tǒng)成熟熟完善繁殖迅速速、培養(yǎng)養(yǎng)簡(jiǎn)單、、操作方方便、遺遺傳穩(wěn)定定被美國(guó)FDA批準(zhǔn)為安安全的基基因工程程受體生物缺陷缺乏對(duì)真真核生物物蛋白質(zhì)質(zhì)的復(fù)性性功能缺乏對(duì)真真核生物物蛋白質(zhì)質(zhì)的修飾飾加工系系統(tǒng)內(nèi)源性蛋蛋白酶降降解空間間構(gòu)象不不正確的的異源蛋蛋白細(xì)胞周質(zhì)質(zhì)內(nèi)含有有種類繁繁多的內(nèi)內(nèi)毒素（2）枯草芽芽孢桿菌菌分泌能力力強(qiáng)，可可將蛋白白質(zhì)產(chǎn)物物直接分分泌到培培養(yǎng)液中中，不形形成包涵體；不能使使蛋白質(zhì)質(zhì)糖基化化，另外外由于它它有很強(qiáng)強(qiáng)的胞外外蛋白酶酶，會(huì)對(duì)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)進(jìn)行不同同程度的的降解（3）鏈霉菌菌重要的工工業(yè)微生生物。不不致病、、使用安安全，分分泌能力力強(qiáng)，可可將表達(dá)達(dá)產(chǎn)物直直接分泌泌到培養(yǎng)養(yǎng)液中，，具有一定定的糖基化能力2、真核細(xì)細(xì)胞（1）酵母特點(diǎn)：真核生物物細(xì)胞，，表達(dá)產(chǎn)產(chǎn)物能糖糖基化；；基因組小小，僅為為大腸桿桿菌的4倍；世代時(shí)間間短，繁繁殖迅速速；基因操作作與原核核生物相相似；建立了有有分泌功功能的表表達(dá)系統(tǒng)統(tǒng)，將產(chǎn)產(chǎn)物分泌泌出胞外外，分離離純化工工藝相對(duì)對(duì)簡(jiǎn)單。。（2）絲狀真真菌特點(diǎn)：有很強(qiáng)的的蛋白分分泌能力力；能正確進(jìn)進(jìn)行翻譯譯后加工工，包括括肽剪切切和糖基基化等;其糖基化化方式與與高等真真核生物物相似；；絲狀真菌菌（如曲曲霉等））等被確確認(rèn)是安安全菌株株，有成成熟的發(fā)發(fā)酵和后后處理工工藝。真核生物物和原核核生物基因表達(dá)達(dá)過程示意意圖克隆載體:克隆了外源DNA后，轉(zhuǎn)入入宿主細(xì)細(xì)胞中進(jìn)進(jìn)行繁殖殖，使克隆的DNA片段數(shù)量量大大增增加表達(dá)載體:將外源基因因或DNA片段在宿宿主細(xì)胞胞中表達(dá)達(dá)蛋白質(zhì)質(zhì)插入型型載體體:將外源源基因因或DNA插入其其中置換型型載體體:切除載體部部分DNA，代之之以外外源基基因或或DNA。載體（（vector）質(zhì)粒（（plasmid）質(zhì)粒是是生物物細(xì)胞胞內(nèi)固固有的的、能能獨(dú)立立于寄寄主細(xì)細(xì)胞染染色體體外而而自主主復(fù)制制、并并被穩(wěn)穩(wěn)定遺遺傳的的一類類核酸酸分子子。絕大大多數(shù)數(shù)質(zhì)粒是是DNA型的，，天然然DNA質(zhì)粒具具有共共價(jià)、、封閉閉、環(huán)環(huán)狀的的分子子結(jié)構(gòu)構(gòu)，即即cccDNA?；蚩丝寺〉牡妮d體體質(zhì)粒粒DNA分子都都具有有復(fù)制制子、、選擇擇性標(biāo)標(biāo)記、、克隆隆位點(diǎn)點(diǎn)。原核細(xì)細(xì)胞表達(dá)載載體非融合合型pKK223-3分泌型型PINⅢ-ompA1融合蛋蛋白表表達(dá)載載體pGEX結(jié)構(gòu)包涵體體型pBV220結(jié)構(gòu)融合蛋蛋白表表達(dá)載載體非融合合型表表達(dá)載載體分泌型型表達(dá)達(dá)載體體包涵體體型表表達(dá)載載體（一））表達(dá)達(dá)載體體表達(dá)載載體必必須具具備的的條件件：載體能能夠獨(dú)獨(dú)立的的復(fù)制制；具有靈靈活的的克隆隆位點(diǎn)點(diǎn)和方方便的的篩選選標(biāo)記記,且克隆隆位點(diǎn)點(diǎn)應(yīng)在在啟動(dòng)動(dòng)子序序列后后，以以便外外源基基因表表達(dá)；；具有很很強(qiáng)的的啟動(dòng)動(dòng)子，，能為為大腸腸桿菌菌的RNA聚合酶酶識(shí)別別；具有阻阻遏子子，使使啟動(dòng)動(dòng)子受受到控控制，，只有有當(dāng)誘誘導(dǎo)時(shí)時(shí)才能能進(jìn)行行轉(zhuǎn)錄錄；具有很很強(qiáng)的的終止止子，，使RNA聚合酶酶集中中力量量轉(zhuǎn)錄錄克隆隆的外外源基基因，，而不不轉(zhuǎn)錄錄無關(guān)關(guān)的基基因；；所產(chǎn)生生的mRNA必須具具有翻翻譯的的起始始信號(hào)號(hào)，即即起始始密碼碼AUG和SD序列，，以便便轉(zhuǎn)錄錄后能能順利利翻譯譯。（二））影響響目的的基因因在大大腸桿桿菌中中表達(dá)達(dá)的因因素外源基基因的的劑量量外源基基因的的表達(dá)達(dá)效率率：A、啟動(dòng)動(dòng)子的的強(qiáng)弱弱：將將目的的基因因插入入大腸腸桿菌菌RNA聚合酶酶能識(shí)識(shí)別的的強(qiáng)啟啟動(dòng)子子下游游B、核糖糖體結(jié)結(jié)合位位點(diǎn)的的有效效性C、SD序列和和起始始密碼碼的間間距D、密碼碼子組組成：：設(shè)計(jì)計(jì)引物物或合合成基基因時(shí)時(shí)選擇擇大腸腸桿菌菌“偏偏愛””的密密碼子子表達(dá)產(chǎn)產(chǎn)物的的穩(wěn)定定性：：A、組建建融合合蛋白白；B、利用用信號(hào)號(hào)肽將將真核核基因因產(chǎn)物物搬至至周質(zhì)質(zhì)空隙隙中；；C、位點(diǎn)特異異性突變，，增加蛋白白的穩(wěn)定性性；D、采用蛋白白酶缺陷型型大腸桿菌菌，減弱降降解作用細(xì)胞的代謝謝負(fù)荷：A、宿主細(xì)胞胞的生長(zhǎng)與與外源基因因的表達(dá)分分開；B、宿主細(xì)胞胞的生長(zhǎng)與與重組質(zhì)粒粒的復(fù)制分分開；C、形成不溶溶性的包涵涵體工程菌的培培養(yǎng)條件（三）真核核基因在大大腸桿菌中中表達(dá)的形形式1.以融合蛋白白的形式表表達(dá)藥物基基因其氨基端是是原核序列列，羧基端端是真核序序列，以原原核多肽和和真核蛋白白結(jié)合在一一起，稱融融合蛋白。。優(yōu)點(diǎn)：操作作簡(jiǎn)便，表表達(dá)蛋白在在菌體內(nèi)穩(wěn)穩(wěn)定，不易易被細(xì)菌酶類降降解；易實(shí)實(shí)現(xiàn)高效表表達(dá)；缺點(diǎn)：有免免疫原性，，需切除原原核多肽2.以非融合蛋蛋白的形式式表達(dá)藥物物基因非融合蛋白白指在大腸腸桿菌中表表達(dá)的蛋白白質(zhì)以真核核蛋白的mRNA的AUG為起始，在在其氨基端端不含細(xì)菌菌多肽序列列。優(yōu)點(diǎn)：保持持原有蛋白白活性；缺點(diǎn)：易被被蛋白酶破破壞；可能能引起人體體免疫反應(yīng)應(yīng)3.分泌型表達(dá)達(dá)蛋白藥物物基因?qū)⑼庠椿蛞蛉诤系骄幘幋a信號(hào)肽肽序列的下下游。常用的信號(hào)號(hào)肽有：堿堿性磷酸酶酶信號(hào)肽；；膜外周質(zhì)質(zhì)蛋白信號(hào)肽；霍霍亂弧菌毒毒素B亞單位；優(yōu)點(diǎn)：在周周質(zhì)中穩(wěn)定定，有活性性，不含甲甲硫氨酸殘殘基；缺點(diǎn)：產(chǎn)量量不高，信號(hào)肽不被切割或或不在特定定位置上切切割。酵母中的基因表達(dá)達(dá)（一）表達(dá)達(dá)載體1.載體的復(fù)制制序列（1）YEp類（酵母附附加體質(zhì)粒粒）（2）YRp類（酵母復(fù)復(fù)制型質(zhì)粒粒）（3）YCp類（酵母著著絲粒質(zhì)粒粒）（4）YIp類（酵母整合型型質(zhì)粒）2.克隆載體向酵母載體體中引入大大腸桿菌質(zhì)質(zhì)粒pBR322的ori部分和Ampr或Tetr部分，這樣樣構(gòu)成的克克隆載體同同時(shí)帶有細(xì)菌和酵酵母的復(fù)制制原點(diǎn)和選選擇標(biāo)記。。酵母常用的的選擇性標(biāo)標(biāo)記：氨基基酸或核苷苷酸合成酶酶系基因，對(duì)對(duì)抑制酵母母生長(zhǎng)的藥藥物具有抵抵抗力的抗抗性基因3.表達(dá)載體普通表達(dá)載載體：只能能方便地引引入外源基基因并進(jìn)行行表達(dá)，對(duì)表達(dá)達(dá)產(chǎn)物的組組成，特別別是對(duì)其N末端氨基酸酸是否增減并并無嚴(yán)格要要求。精確表達(dá)載載體：要求求在啟動(dòng)子子或前導(dǎo)肽肽編碼序列列的適當(dāng)部位有有內(nèi)切酶位位點(diǎn)，以利利于接入外外源基因，，并使它在表達(dá)達(dá)和加工后后N末端氨基酸酸序列與天天然產(chǎn)物相同，既無無多余的氨氨基酸，也也無缺失的的氨基酸。。（二）影響響目的基因因在酵母菌菌中表達(dá)的的因素1.外源基因的的劑量：質(zhì)質(zhì)粒拷貝數(shù)數(shù)及其在宿宿主細(xì)胞內(nèi)內(nèi)的穩(wěn)定性性2.外源基因的的表達(dá)效率率：A、啟動(dòng)子B、分泌信號(hào)號(hào)的效率C、終止序列列的影響3.外源蛋白的的糖基化4.宿主菌株的的影響：A、菌體生長(zhǎng)長(zhǎng)力強(qiáng)；B、菌體內(nèi)源源蛋白酶要要弱；C、菌株性能能穩(wěn)定；D、分泌能力力強(qiáng)基因工程菌菌的培養(yǎng)基因工程菌菌發(fā)酵的基基本操作方方式有：分批培養(yǎng)分批培養(yǎng)操操作簡(jiǎn)單，，但因不能能控制生長(zhǎng)長(zhǎng)，獲得的的菌體密度度也有限半連續(xù)培養(yǎng)養(yǎng)（補(bǔ)料分分批）在一次投料發(fā)發(fā)酵的基礎(chǔ)礎(chǔ)上，流加加一定量的的營(yíng)養(yǎng)，使使細(xì)胞進(jìn)一一步的生長(zhǎng)，或得到更更多的代謝謝產(chǎn)物連續(xù)培養(yǎng)不斷地流加加營(yíng)養(yǎng)，并并不斷地取取出發(fā)酵液液。連續(xù)培培養(yǎng)則多用用于動(dòng)力學(xué)學(xué)特性和穩(wěn)穩(wěn)定性等研研究。透析培養(yǎng)固定化培養(yǎng)養(yǎng)基因工程菌菌培養(yǎng)方式式補(bǔ)料分批培培養(yǎng)補(bǔ)料分批培培養(yǎng)是將種種子接入發(fā)發(fā)酵反應(yīng)器器中進(jìn)行培培養(yǎng)，經(jīng)過過一段時(shí)間間，間歇或或連續(xù)地補(bǔ)補(bǔ)加新鮮培培養(yǎng)基，使使菌體進(jìn)一一步生長(zhǎng)的的培養(yǎng)方法法。在分批培養(yǎng)養(yǎng)中，為保保持基因工工程菌生長(zhǎng)長(zhǎng)所需的良良好微環(huán)境境，延長(zhǎng)其其生長(zhǎng)對(duì)數(shù)數(shù)期，獲得得高密度菌菌體，通常常把溶氧控控制和流加加補(bǔ)料措施施結(jié)合起來來，根據(jù)基基因工程菌菌的生長(zhǎng)規(guī)規(guī)律來調(diào)節(jié)節(jié)補(bǔ)料的流流加速率。。連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)是是將種子接接入發(fā)酵反反應(yīng)器中，，攪拌培養(yǎng)養(yǎng)至菌體濃濃度達(dá)到一一定程度后后，開動(dòng)進(jìn)進(jìn)料和出料料蠕動(dòng)泵，，以一定稀稀釋率進(jìn)行行不間斷培培養(yǎng)。連續(xù)培養(yǎng)可可以為微生生物提供恒恒定的生活活環(huán)境，控控制其比生生長(zhǎng)速率，，為研究基基因工程菌菌的發(fā)酵動(dòng)動(dòng)力學(xué)、生生理生化特特性、環(huán)境境因素對(duì)基基因表達(dá)的的影響等創(chuàng)創(chuàng)造了良好好的條件。。但由于基因因工程菌的的不穩(wěn)定性性，連續(xù)培培養(yǎng)比較困困難。為了了解決這一一問題，人人們將工程程菌的生長(zhǎng)長(zhǎng)階段和基基因表達(dá)階階段分開，，進(jìn)行兩階階段連續(xù)培培養(yǎng)。在這這樣的系統(tǒng)統(tǒng)中關(guān)鍵的的控制參數(shù)數(shù)是誘導(dǎo)水水平、稀釋釋率和細(xì)胞胞比生長(zhǎng)速速率。優(yōu)化化這三個(gè)參參數(shù)以保證證在第一階階段培養(yǎng)時(shí)時(shí)質(zhì)粒穩(wěn)定定，菌體進(jìn)進(jìn)入第二階階段后可獲獲得最高表表達(dá)水平或或最大產(chǎn)率率。透析培養(yǎng)透析培養(yǎng)技技術(shù)是利用用膜的半透透性原理使使培養(yǎng)物和和培養(yǎng)基分分離，其主主要目的是是通過去除除培養(yǎng)液中中的代謝產(chǎn)產(chǎn)物來解除除其對(duì)生產(chǎn)產(chǎn)菌的不利利影響。采用膜透析析裝置是在在發(fā)酵過程程中用蠕動(dòng)動(dòng)泵將發(fā)酵酵液抽出打打入罐外的的膜透析器器的一側(cè)循循環(huán)，其另另一側(cè)通入入透析液循循環(huán)，在補(bǔ)補(bǔ)料分批培培養(yǎng)中，大大量乙酸在在透析器中中透過半透透膜，降低低培養(yǎng)基中中的乙酸濃濃度，并可可通過在透透析液中補(bǔ)補(bǔ)充養(yǎng)分而而維持較合合適的基質(zhì)質(zhì)濃度，從從而獲得高高密度菌體體。膜的種類、、孔徑、面面積，發(fā)酵酵液和透析析液的比例例，透析液液的組成，，循環(huán)流速速，開始透透析的時(shí)間間和透析培培養(yǎng)的持續(xù)續(xù)時(shí)間段都都對(duì)產(chǎn)物的的產(chǎn)率有影影響固定化培養(yǎng)養(yǎng)基因工程菌菌培養(yǎng)的一一大難題是是如何維持持質(zhì)粒的穩(wěn)穩(wěn)定性。有有人將固定定化技術(shù)應(yīng)應(yīng)用到這一一領(lǐng)域，發(fā)發(fā)現(xiàn)基因工工程菌經(jīng)固固定化后，，質(zhì)粒的穩(wěn)穩(wěn)定性大大大提高，便便于進(jìn)行連連續(xù)培養(yǎng)，，特別是對(duì)對(duì)分泌型菌菌更為有利利。由于這這一優(yōu)點(diǎn)，，基因工程程菌固定化化培養(yǎng)研究究已得到迅迅速開展。。基因工程菌菌發(fā)酵中試試基因工程菌菌中試應(yīng)考考慮的問題題：適宜商商品化生產(chǎn)產(chǎn)的工程菌菌，設(shè)計(jì)發(fā)發(fā)酵反應(yīng)器器，選擇反反應(yīng)過程，，發(fā)酵培養(yǎng)養(yǎng)基組分，，維持生產(chǎn)產(chǎn)工藝最佳佳化的方法法，工藝監(jiān)監(jiān)測(cè)方法，，工藝控制制方法，工工藝自動(dòng)化化使用方法法，生物催催化劑使用用，產(chǎn)品提提取方法的的選擇，分分離精制技技術(shù)的選擇擇?；蚬こ叹牟环€(wěn)定定性主要表現(xiàn)在重組組質(zhì)粒的不不穩(wěn)定性，，兩種表現(xiàn)形式：：1）結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定定性重組DNA分子上某一一區(qū)域發(fā)生生缺失、重重排、修飾飾，導(dǎo)致其其表觀生物物學(xué)功能的的喪失2）分配不穩(wěn)定定性整個(gè)重組DNA分子從受體體細(xì)胞中逃逸基因工程菌菌不穩(wěn)定性性的可能產(chǎn)產(chǎn)生機(jī)制：受體細(xì)胞中限制修飾飾系統(tǒng)對(duì)外源重組組DNA分子的降解解外源基因的的高效表達(dá)達(dá)嚴(yán)重干擾擾受體細(xì)胞胞正常生長(zhǎng)代代謝能量、物質(zhì)的匱乏乏和外源基基因表達(dá)產(chǎn)產(chǎn)物的毒性性誘導(dǎo)受體體細(xì)胞產(chǎn)生生應(yīng)激反應(yīng)應(yīng)：關(guān)閉合合成途徑，，啟動(dòng)降解解程序重組質(zhì)粒在在受體細(xì)胞胞分裂時(shí)的的不均勻分配重組質(zhì)粒逃逸的基本原原因受體細(xì)胞中內(nèi)內(nèi)源性的轉(zhuǎn)座座元件促進(jìn)重重組分子的缺缺失重排培養(yǎng)基比生長(zhǎng)速率限制性基質(zhì)溫度pH和溶氧外源基因表達(dá)遺傳特性影響基因工程程菌穩(wěn)定性的的因素載體的選擇宿主的選擇外源基因整合合到宿主染色色體上發(fā)酵工藝1.培養(yǎng)基一些基因重組組菌在復(fù)合培培養(yǎng)基中顯示示較高的質(zhì)粒粒穩(wěn)定性微生物在含有有有機(jī)氮源如如酵母抽提物物、蛋白胨等等營(yíng)養(yǎng)豐富的的復(fù)合培養(yǎng)基基中培養(yǎng)時(shí)，，由于培養(yǎng)基基提供了生長(zhǎng)長(zhǎng)必須的氨基基酸和其他物物質(zhì)，微生物物的生長(zhǎng)較基基本培養(yǎng)基快快。培養(yǎng)條件對(duì)基因工程菌穩(wěn)定性的影響響2.比生長(zhǎng)速率基因重組菌的的比生長(zhǎng)速率率對(duì)質(zhì)粒穩(wěn)定定性有很大影影響。提高比比生長(zhǎng)速率有有助于提高質(zhì)質(zhì)粒穩(wěn)定性。。基因重組菌的的比生長(zhǎng)速率率與培養(yǎng)環(huán)境境有關(guān)，如溫溫度，pH，溶氧，限制制性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)質(zhì)濃度，有害害代謝產(chǎn)物濃濃度等。在一一定的溫度和和pH下，限制性基基質(zhì)濃度往往往是決定比生生長(zhǎng)速率的主主要因素。3.限制性基質(zhì)一般培養(yǎng)基中中各成分并不不是完全平衡衡的，經(jīng)過一一段時(shí)間的培培養(yǎng)，微生物物的生長(zhǎng)通常常會(huì)受到一種種或幾種物質(zhì)質(zhì)的限制。限限制性基質(zhì)的的種類對(duì)重組組菌有不同的的影響4.pH和溶解氧pH和溶氧是影響微微生物生長(zhǎng)的的重要參數(shù)，，在發(fā)酵罐培培養(yǎng)基因重組組菌時(shí)，通常常都需要維持持一定的pH和溶氧水平。。在基因重組組菌的高密度度培養(yǎng)時(shí)，為為了維持所需需的溶氧水平平，除了提高高攪拌轉(zhuǎn)速和和通氣量，往往往還要在通通入的空氣中中補(bǔ)充氧氣，，以提高發(fā)酵酵罐的供氧能能力。5.外源基因的表表達(dá)外源基因的表表達(dá)會(huì)引起重重組質(zhì)粒的不不穩(wěn)定；尤其其當(dāng)外源基因因高效表達(dá)時(shí)時(shí)，有可能因因競(jìng)爭(zhēng)利用物物質(zhì)、能量、、核糖體等干干擾宿主細(xì)胞胞的正常代謝謝活動(dòng)，并造造成質(zhì)粒不穩(wěn)穩(wěn)定。例如，吲哚丙丙烯酸（IAA）是trp操縱子阻遏物物的部分去阻阻遏劑，在培培養(yǎng)大腸桿菌菌MV12（pVH5）時(shí)，在培養(yǎng)養(yǎng)基中加入不不同量的IAA，發(fā)現(xiàn)隨IAA量的增加，pVH5帶有的分支酸酸合成酶和色色氨酸合成酶酶基因的表達(dá)達(dá)水平有很大大提高，同時(shí)時(shí)比生長(zhǎng)速率率下降，培養(yǎng)養(yǎng)液中Trp－的比例上升。。電泳分析表表明60%～70%色氨酸合成能能力喪失是由由于質(zhì)粒結(jié)構(gòu)構(gòu)的變化，其其余是由于質(zhì)質(zhì)粒丟失造成成。1、改進(jìn)載體受體系統(tǒng)統(tǒng)以增加質(zhì)粒穩(wěn)定定性為目的的的構(gòu)建方法包包括：1）將R1質(zhì)粒上的parB基因引入表達(dá)達(dá)型載體中，，其表達(dá)產(chǎn)物物可以選擇性性地殺死由于于分配不均勻勻所產(chǎn)生的無無質(zhì)粒細(xì)胞2）正確確設(shè)置置載體體上的的多克克隆位位點(diǎn)，，禁止止DNA片段插插在穩(wěn)穩(wěn)定區(qū)區(qū)內(nèi)3）將受受體細(xì)細(xì)胞的的致死死性基基因安安裝在在載體體上，，同時(shí)時(shí)構(gòu)建建條件件致死死性的的相應(yīng)應(yīng)受體體系統(tǒng)統(tǒng)，如如大腸腸桿菌菌的ssb基因（（DNA單鏈結(jié)結(jié)合蛋蛋白編編碼基基因））提高基基因工工程菌菌穩(wěn)定定性的的策略略2、施加加選擇壓壓力根據(jù)載載體上上的抗抗藥性性標(biāo)記記，向向培養(yǎng)養(yǎng)系統(tǒng)統(tǒng)中添添加相相應(yīng)的的抗生生素藥物和和食品品生產(chǎn)產(chǎn)時(shí)禁禁止使使用抗抗生素素；加加入大大量的的抗生生素會(huì)會(huì)使生生產(chǎn)成成本增增加；；添加加一些些容易易被水水解失失活的的抗生生素，，只能能維持持一定定時(shí)間間；添添加抗抗生素素選擇擇壓力力對(duì)質(zhì)質(zhì)粒結(jié)結(jié)構(gòu)不不穩(wěn)定定無能能為力力載體上上的營(yíng)營(yíng)養(yǎng)缺缺陷型型標(biāo)記記，向向培養(yǎng)養(yǎng)系統(tǒng)統(tǒng)中添添加相相應(yīng)的的營(yíng)養(yǎng)養(yǎng)組份份培養(yǎng)基基復(fù)雜雜，成成本較較高提高基基因工工程菌菌穩(wěn)定定性的的策略略3、分階段控控制培培養(yǎng)因外源源基因因表達(dá)達(dá)造成成質(zhì)粒粒不穩(wěn)穩(wěn)定時(shí)時(shí)，可可以考考慮將將發(fā)酵酵過程程分階階段控控制在生長(zhǎng)長(zhǎng)階段段使外外源基基因處處于阻阻遏狀狀態(tài)，，避免免因表表達(dá)造造成不不穩(wěn)定定性問問題的的發(fā)生生；在在獲得得需要要的菌菌體密密度后后，再再去阻阻遏或或誘導(dǎo)導(dǎo)外源源基因因表達(dá)達(dá)。連續(xù)培培養(yǎng)時(shí)時(shí)可以以考慮慮采用用多級(jí)級(jí)培養(yǎng)養(yǎng)，如如在第第一級(jí)級(jí)進(jìn)行行生長(zhǎng)長(zhǎng)，維維持菌菌體的的穩(wěn)定定性，，在第第二級(jí)級(jí)進(jìn)行行表達(dá)達(dá)。提高基基因工工程菌菌穩(wěn)定定性的的策略略4、控制制目的基基因的的過量量表達(dá)達(dá)使用可可控型型啟動(dòng)動(dòng)子控控制目目的基基因的的定時(shí)時(shí)表達(dá)達(dá)及表表達(dá)程程度使用可可控型型復(fù)制制子控控制質(zhì)質(zhì)粒的的定時(shí)時(shí)增殖殖或降降低質(zhì)質(zhì)粒的的拷貝貝數(shù)5、優(yōu)化化基因工工程菌菌的培培養(yǎng)工工藝培養(yǎng)基基組成成：限限制培培養(yǎng)基基比豐豐富培培養(yǎng)基基更有有利于于穩(wěn)定定培養(yǎng)溫度：：較低低的培養(yǎng)養(yǎng)溫度度有利利于重重組質(zhì)質(zhì)粒的的穩(wěn)定提高基基因工工程菌菌穩(wěn)定定性的的策略略6、控制制培養(yǎng)條條件有些含質(zhì)粒粒的菌菌對(duì)發(fā)發(fā)酵環(huán)環(huán)境的的改變變比不不含質(zhì)質(zhì)粒的的菌反反應(yīng)慢慢，因因而采采用間間隙改改變培培養(yǎng)條條件的的方法法以改改變這這兩種種菌的的比生生長(zhǎng)速速率，，從而而改善善質(zhì)粒粒的穩(wěn)穩(wěn)定性性。通通過間間隙供供氧的的方法法和通通過改改變稀稀釋速速率的的方法法都可可提高高質(zhì)粒粒的穩(wěn)穩(wěn)定性性。例如研究表表達(dá)干擾素素的大腸桿桿菌W3110(pEC901)在不同同比生生長(zhǎng)速速率下下的質(zhì)質(zhì)粒穩(wěn)穩(wěn)定性性，隨隨著稀稀釋率率的增增加，，質(zhì)粒粒穩(wěn)定定性明明顯增增加，，干擾擾素的的比效效價(jià)也也明顯顯增大大.提高基基因工工程菌菌穩(wěn)定定性的的策略略7、固固定定化化培養(yǎng)養(yǎng)固定定化化可可以以提提高高基基因因重重組組大大腸腸桿桿菌菌的的穩(wěn)穩(wěn)定定性性基因因重重組組大大腸腸桿桿菌菌進(jìn)進(jìn)行行固固定定化化后后，，質(zhì)質(zhì)粒粒的的穩(wěn)穩(wěn)定定性性及及目目的的產(chǎn)產(chǎn)物物的的表表達(dá)達(dá)率率都都有有了了很很大大提提高高。。在在游游離離重重組組菌菌系系統(tǒng)統(tǒng)中中常常用用抗抗生生素素，，氨氨基基酸酸等等選選擇擇性性壓壓力力穩(wěn)穩(wěn)定定質(zhì)質(zhì)粒粒的的手手段段，，往往往往在在大大規(guī)規(guī)模模生生產(chǎn)產(chǎn)中中難難以以應(yīng)應(yīng)用用。。而而采采用用固固定定化化方方法法后后，，這這種種選選擇擇壓壓力力則則可可被被省省去去。。不不同同的的宿宿主主菌菌及及質(zhì)質(zhì)粒粒在在固固定定化化系系統(tǒng)統(tǒng)中中均均表表現(xiàn)現(xiàn)出出良良好好的的穩(wěn)穩(wěn)定定性性。。提高基因因工程菌菌穩(wěn)定性性的策略略基因工程程藥物的的分離純純化目的產(chǎn)物在初初始物料料中的含含量較低低；含目的產(chǎn)產(chǎn)物的初初始物料料組成復(fù)復(fù)雜，除除目的產(chǎn)產(chǎn)物外，，還有大大量的細(xì)細(xì)胞、代代謝物、、殘留培培養(yǎng)基、、無機(jī)鹽鹽等，特特別是產(chǎn)產(chǎn)物類似似物對(duì)目目的產(chǎn)物物的分離離純化影影響很大大；目的產(chǎn)物物的穩(wěn)定定性差，，具有生生物活性性的物質(zhì)質(zhì)對(duì)pH、溫度、、金屬離離子、有有機(jī)溶劑劑、剪切切力、表表面張力力等十分分敏感，，容易失失活、變變性；種類繁多多，包括括大、中中、小分分子、結(jié)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單單或復(fù)雜雜的有機(jī)機(jī)化合物物，以及及結(jié)構(gòu)和和性質(zhì)復(fù)復(fù)雜又各各異的生生物活性性物質(zhì)；；應(yīng)用面廣廣，對(duì)其其質(zhì)量、、純度要要求高，，甚至要要求無菌菌、無熱熱原?；蚬こ坛趟幬锘蚧蛏锛技夹g(shù)產(chǎn)品品特點(diǎn)一、建立立分離純純化工藝藝需了解解的各種種因素1.含目的產(chǎn)產(chǎn)物的初初始物料料的特點(diǎn)點(diǎn)（1）菌種類型及其其代謝特特性（2）原材料料和培養(yǎng)養(yǎng)基的來來源及質(zhì)質(zhì)量是否否穩(wěn)定（3）生產(chǎn)工工藝和條條件（4）初始物料的物物理、化化學(xué)和生生物學(xué)特特性2.物料中雜雜質(zhì)的種種類和性性質(zhì)3.目的產(chǎn)物物特性4.產(chǎn)品質(zhì)量量的要求求二、分離離純化的的基本過過程基因工程程藥物的的分離純純化主要要分為5個(gè)步驟，，包括細(xì)胞胞破碎、、固液分分離、濃濃縮與初初步純化化、高度度純化直至至得到純純品，以以及成品品加工。。分離純化化目的產(chǎn)產(chǎn)物主要要依賴于于色譜分分離技術(shù)術(shù)。色譜技術(shù)術(shù)分為：：離子交換換色譜親和色譜譜凝膠過濾濾色譜高效液相相色譜等等三、重組組蛋白質(zhì)的的分離純純化產(chǎn)物的主主要特性性及在分分離純化化中的作作用基因工程程藥物生生產(chǎn)中常常用的分分離純化化方法基因工程程藥物制制造實(shí)例例干擾素是是真核細(xì)細(xì)胞對(duì)各各種刺激激作出反反應(yīng)而自自然形成成的一組組復(fù)雜的的蛋白質(zhì)質(zhì)。干擾擾素除具具有廣譜譜抗病毒毒活性，，還具有有抑制細(xì)細(xì)胞分裂裂，特別別是抑制制腫瘤細(xì)細(xì)胞生長(zhǎng)長(zhǎng)和免疫疫調(diào)節(jié)等等功能，，作為一一種生物物活性蛋蛋白有著著良好的的臨床應(yīng)應(yīng)用價(jià)值值。干擾素在在我國(guó)已已經(jīng)批準(zhǔn)準(zhǔn)上市的的基因工工程藥物物。早期獲得得方法：：用病毒毒誘導(dǎo)人人白血球球(白細(xì)胞)產(chǎn)生，產(chǎn)產(chǎn)量低，，價(jià)格貴貴。300L人血才提提取1mg（一）干干擾素2003年抗非典典期間，，江南大大學(xué)與麗麗珠集團(tuán)團(tuán)蘇州新新寶制藥藥廠合作作攻關(guān)，，通過發(fā)發(fā)酵工程程和生物物制藥工工程研制制成功了了重組人人α-2b干擾素口口鼻腔噴噴霧劑，，解決了了干擾素素常溫保保存穩(wěn)定定性問題題。在疫疫區(qū)特殊殊人群捐捐贈(zèng)使用用，效果果顯著。。誘生的白白細(xì)胞或或者成纖纖維細(xì)胞胞提取核核酸↓通過寡dT-纖維素柱柱提取mRNApBR322質(zhì)?！?%-23%蔗糖密度度梯度離離心提取取12S-mRNA內(nèi)切酶切切割↓↓由mRNA轉(zhuǎn)錄成cDNA切割段位位于β內(nèi)酰胺基基酶基因因內(nèi)↓結(jié)結(jié)果導(dǎo)致致內(nèi)酰胺胺基酶失失活，不不抗青霉霉素雙鏈cDNA用末端Pst-I酶切割↓再用DNA轉(zhuǎn)移酶接接上dT或者dG在pBR322質(zhì)粒DNA的切割段段加上dA或者dC++++++++++++++++退火獲得得雜交質(zhì)質(zhì)?！D(zhuǎn)轉(zhuǎn)化大腸腸桿菌K-12擴(kuò)增雜交交質(zhì)?！Y選能夠夠抗四環(huán)環(huán)素、但但是對(duì)氨氨芐青霉霉素敏感感的細(xì)菌菌克隆株株↓采用雜交交翻譯法法挑選含含有干擾擾素cDNA的克隆↓↓將將干擾擾素cDNA克隆進(jìn)表表達(dá)載體體↓↓在在大大腸桿菌菌中進(jìn)行行高效表表達(dá)↓（進(jìn)入下下游工藝藝）工程菌構(gòu)構(gòu)建工程菌的的發(fā)酵生生產(chǎn)人干擾素素a-2b的基因工工程菌為為SW-IFNa-2b/E.coli—DH5a。

質(zhì)粒粒使用PL啟動(dòng)子，，含有氨氨芐青霉霉素抗性性基因。。

種子子培養(yǎng)液液含1%蛋白胨、、0.5%酵母提取取物、0.5%NaCl?！?/p>

基因因工程菌菌接種到到4個(gè)1000ml三角燒瓶瓶之中，，每個(gè)燒燒瓶?jī)?nèi)裝裝有250ml種子培養(yǎng)養(yǎng)基，30℃搖床培養(yǎng)養(yǎng)10小時(shí)，作作為發(fā)酵酵罐的種種子?！糜?5L發(fā)酵罐進(jìn)進(jìn)行發(fā)酵酵，裝發(fā)發(fā)酵培養(yǎng)養(yǎng)基10L發(fā)酵培養(yǎng)養(yǎng)基組成成如下（（1%蛋白胨、、0.5%酵母提取取物、0.05%NaCl、0.01%NH4Cl、0.6%Na2HPO4、0.001%CaCl2、0.3%KH2PO4、0.01%MgSO4、0.4%葡萄糖、、50mg/ml氨芐青霉霉素、少少量防泡泡沫劑。。pH=6.8。）↓↓攪攪拌轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)速500r/min、通氣量量為1：1v/v*min、溶氧量量為50%30℃℃發(fā)酵8小時(shí)（細(xì)細(xì)菌增殖殖階段））42℃誘導(dǎo)2-3小時(shí)（產(chǎn)產(chǎn)物生產(chǎn)產(chǎn)階段））↓↓[監(jiān)控手段段：每隔隔不同時(shí)時(shí)間，取取2毫升發(fā)酵酵液，10000r/min離心除去