血清和關(guān)節(jié)液中YKL-40對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎診斷價(jià)值的研究導(dǎo)師:衛(wèi)小春教授研究生:王國(guó)金科研開(kāi)題報(bào)告一、課題簡(jiǎn)介關(guān)節(jié)軟骨特性：光滑、耐磨、富有彈性及一些特有的機(jī)械性能功能：傳導(dǎo)載荷、吸收震蕩、潤(rùn)滑關(guān)節(jié)

由于關(guān)節(jié)軟骨沒(méi)有血管、神經(jīng)，一旦損傷，很難自我修復(fù)(oncedestoryed，isnotrepaired)謝謝！前言關(guān)節(jié)軟骨是一種高度分化的組織，由于缺乏血供，損傷后很難自我修復(fù)（oncedestoryed，isnotrepaired）

AutologousChondrocyteTransplantation（ACT）1994年，Brittberg謝謝謝謝OA概況(1)OA是引起關(guān)節(jié)疼痛和活動(dòng)受限的常見(jiàn)病變,是世界性的關(guān)節(jié)疾病。在美國(guó)50歲以上的人群中已成為勞動(dòng)力喪失的第二大疾患。在我國(guó)OA的發(fā)病率:農(nóng)村為9.6%,城市人群為4.9%。OA診斷的現(xiàn)狀目前臨床所通用的是1986年美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)關(guān)于OA的診斷標(biāo)準(zhǔn)，主要是以癥狀+X線征像為依據(jù)的。現(xiàn)有檢查手段對(duì)OA軟骨退變?cè)\斷的局限性MRIX線其征象改變比軟骨發(fā)生退變遲3-5年。OA的生物學(xué)標(biāo)志物(BM)(1)

----概況近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者欲在OA患者的體液中尋找理想的病變標(biāo)志物，來(lái)及時(shí)反映關(guān)節(jié)軟骨代謝狀態(tài)和局部病變的進(jìn)展情況，揭示病情活動(dòng)或預(yù)后，并為臨床提供療效評(píng)價(jià)的客觀依據(jù)。美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院2000年建議用Biomarker取代marker,這樣可更好地揭示其生物學(xué)本質(zhì)。OA的生物學(xué)標(biāo)志物(BM)(2)

----研究現(xiàn)狀大量實(shí)驗(yàn)研究已發(fā)現(xiàn)許多能反映OA病情的BM：反映骨代謝的BM；反映軟骨代謝的BM；反映滑膜代謝的BM。

YKL-40：可能是反映軟骨和滑膜代謝的BM之一。近年來(lái)，國(guó)外開(kāi)始進(jìn)行臨床試驗(yàn)研究。OA的生物學(xué)標(biāo)志物（BM）（2）

——研究現(xiàn)狀（1）反映骨代謝的BM

合成代謝I型膠原：I型前膠原氨基端前肽,I型前膠原羧基端前肽。非膠原蛋白：骨特異性堿性磷酸酶;骨鈣素。分解代謝I型膠原：脫氧吡啶酚,吡啶酚;I型膠原氨基端端肽,I型膠原羧基端端肽-1,2。非膠原蛋白：血漿酒石酸鹽耐受性酸性磷酸酶,骨唾液蛋白。OA的生物學(xué)標(biāo)志物（BM）（2）

——研究現(xiàn)狀（2）反映軟骨代謝的BM合成代謝Ⅱ型膠原：Ⅱ型前膠原羧基端前肽,ⅡA型前膠原氨基端前肽?？删鄣鞍锥嗵牵毫蛩彳浌撬乇砦?46,3B3,7D4。其它蛋白：YKL-40即人軟骨糖蛋白-39分解代謝Ⅱ型膠原：吡啶酚;Ⅱ型膠原新表位COL2-3/4m,COL2-1/4N1;Ⅱ型膠原羧基端端肽?？删鄣鞍锥嗵牵嚎删鄣鞍锥嗵瞧瑪?硫酸角質(zhì)素表位5D4,AN9P1;其它蛋白：軟骨寡聚基質(zhì)蛋白。YKL-40概況YKL-40（又稱人軟骨糖蛋白-39，humancartilageglycoprtein39，HCgp-39/GP-39）在非泌乳期牛的乳清分泌物中被首次發(fā)現(xiàn)的。來(lái)源：軟骨細(xì)胞、滑膜細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等。相對(duì)分子量為40000的糖蛋白，含383個(gè)氨基酸。由10個(gè)外顯子構(gòu)成的含開(kāi)放讀碼框架完全互補(bǔ)cDNA序列編譯。是殼質(zhì)酶(chitinase)糖蛋白家族的成員,但不具備殼質(zhì)酶活性。YKL-40的研究現(xiàn)狀（1）目前YKL-40的相關(guān)研究主要集中于以下領(lǐng)域：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；骨性關(guān)節(jié)炎；巨細(xì)胞性動(dòng)脈炎；肝纖維化；乳腺癌和結(jié)腸直腸癌，等等。雖然YKL-40的作用機(jī)制尚不清楚，但研究表明它與許多組織的重塑和細(xì)胞外基質(zhì)降解有關(guān)。YKL-40的研究現(xiàn)狀（3）YKL-40是一個(gè)反映滑膜和關(guān)節(jié)軟骨代謝的BM?經(jīng)檢索十年的CBMDisc未發(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)關(guān)于YKL-40在骨性關(guān)節(jié)炎方面的研究論文發(fā)表。OA的生物學(xué)標(biāo)志物（BM）（3）

——血清BM研究中的混雜因素血清BM除反映關(guān)節(jié)的病情外，還可能受其它因素的影響：生物節(jié)律的影響腸蠕動(dòng)的影響體育活動(dòng)的影響肝腎等疾病的影響年齡和性別的影響手術(shù)的影響藥物因素的影響本研究目的明確關(guān)節(jié)液（synovialfluid,SF）中YKL-40水平對(duì)膝OA的診斷價(jià)值；探討血清（Serum）中YKL-40水平對(duì)膝OA的診斷價(jià)值。本研究的特點(diǎn)診斷試驗(yàn)的“金標(biāo)準(zhǔn)”關(guān)節(jié)鏡下關(guān)節(jié)軟骨損傷和滑膜炎病理變化程度的評(píng)分；WOMAC骨性關(guān)節(jié)炎指數(shù)（由患者自我評(píng)估）；X線的Kellgren&Lawrence分級(jí)，負(fù)重位X線的膝關(guān)節(jié)間隙寬度。充分控制混雜因素探討血清YKL-40診斷價(jià)值。本研究的意義學(xué)術(shù)意義可以明確YKL-40對(duì)OA的診斷價(jià)值；可為OA的癥狀解釋、早期診斷及其分期提供一種實(shí)驗(yàn)室檢查手段；可為OA的治療提供一種療效評(píng)價(jià)的客觀指標(biāo)；可為進(jìn)一步研究確定國(guó)人體液YKL-40的正常參考值奠定基礎(chǔ)。經(jīng)濟(jì)效益近期效益；遠(yuǎn)期效益。技術(shù)關(guān)鍵體液標(biāo)本的采集和預(yù)處理體液標(biāo)本的檢測(cè)統(tǒng)計(jì)學(xué)的統(tǒng)計(jì)處理研究方法（1）

——病例選擇病例來(lái)源：山醫(yī)二院骨科行膝關(guān)節(jié)鏡檢查和膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的患者。擇入標(biāo)準(zhǔn):非發(fā)育期患者（年齡＞18歲）；排除肝腎疾病、全身感染和癌癥等的患者；體液標(biāo)本采集前兩月未使用糖皮質(zhì)激素類藥物的患者。樣本含量：≥60例。研究方法（2）

——體液標(biāo)本的采集、預(yù)處理、儲(chǔ)存和檢測(cè)體液標(biāo)本的采集、儲(chǔ)存前處理、儲(chǔ)存和取用、以及檢測(cè)前處理和檢測(cè)，應(yīng)依據(jù)課題技術(shù)規(guī)范進(jìn)行。本課題相關(guān)技術(shù)規(guī)范主要參考《PooleR.NIHWhitePaper:Biomakers,theOsteoarthritisInitiative(ABasisforDiscussion).Ferbruary3rd,2000.》制定。技術(shù)規(guī)范（1）

——體液標(biāo)本的采集體液標(biāo)本的采集規(guī)范血液標(biāo)本在清晨6-8時(shí)空腹抽取靜脈血5ml，留存于無(wú)菌非抗凝試管中送檢。并應(yīng)限制病人在采集標(biāo)本前活動(dòng)。關(guān)節(jié)液標(biāo)本在行關(guān)節(jié)鏡手術(shù)時(shí)麻醉后采集：抽取關(guān)節(jié)液原液留存于無(wú)菌非抗凝試管中（盡量多抽?。?。技術(shù)規(guī)范（2）

——體液標(biāo)本的儲(chǔ)存前處理

體液標(biāo)本均應(yīng)在采樣后2小時(shí)內(nèi)進(jìn)行離心處理：血清標(biāo)本：在至少×600g，3000rpm，10分鐘的條件下離心。關(guān)節(jié)液標(biāo)本：在×2500g，4℃，15分鐘的條件下離心。（4500rpm，20min）技術(shù)規(guī)范（3）

—體液標(biāo)本的儲(chǔ)存和取用體液標(biāo)本的儲(chǔ)存標(biāo)本離心后取上清液，經(jīng)快速冷凍后,-70℃條件下凍存。體液標(biāo)本的取用在室溫下復(fù)溫解凍。標(biāo)本避免反復(fù)凍融。技術(shù)規(guī)范（4）

——體液標(biāo)本檢測(cè)前處理和檢測(cè)體液標(biāo)本的檢測(cè)前處理關(guān)節(jié)液標(biāo)本應(yīng)先經(jīng)離心后，取上清液測(cè)定其含量；血清標(biāo)本不需進(jìn)行特殊處理。體液標(biāo)本的檢測(cè)ELISA法。研究方法（3）

——其它相關(guān)資料的收集臨床資料一般資料；臨床癥狀、體征；問(wèn)卷調(diào)查：WOMAC指數(shù)實(shí)驗(yàn)室檢查資料常規(guī)項(xiàng)目，血清Ⅳ型膠原。X線資料關(guān)節(jié)間隙的寬度；Kellgren&Lawrence分級(jí)。手術(shù)資料關(guān)節(jié)軟骨損傷和滑膜炎程度的評(píng)分；手術(shù)錄像資料。技術(shù)規(guī)范（5）

——手術(shù)資料收集的注意事項(xiàng)手術(shù)中對(duì)關(guān)節(jié)內(nèi)組織的病變程度進(jìn)行評(píng)價(jià)：關(guān)節(jié)軟骨損傷：Outerbridge膝關(guān)節(jié)軟骨損傷評(píng)分法；滑膜炎：Ayral膝滑膜炎評(píng)分法。術(shù)中對(duì)病變部位用探鉤進(jìn)行相對(duì)測(cè)量，并注意留存錄像資料。研究方法（4）

—OA病變程度的對(duì)照評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)關(guān)節(jié)組織的關(guān)節(jié)鏡征象評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)關(guān)節(jié)軟骨退變程度：Outerbridge法；滑膜炎程度：Ayral膝滑膜炎評(píng)分法。OA病變程度的X線征象評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Kellgren&Lawrence分級(jí)；負(fù)重位的膝關(guān)節(jié)間隙寬度。OA病變程度的患者自我評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)WOMAC骨性關(guān)節(jié)炎指數(shù)。研究方法（5）

—統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析OA組和非OA組之間體液YKL-40水平的比較用多元協(xié)方差分析。體液YKL-40水平與關(guān)節(jié)鏡下相關(guān)組織的病變程度評(píng)分之間用多元線性回歸。體液YKL-40水平與膝關(guān)節(jié)間隙寬度或WOMAC評(píng)分間用相關(guān)分析?？赡苡龅降膯?wèn)題及解決辦法標(biāo)本的采集、預(yù)處理和檢測(cè)等的標(biāo)準(zhǔn)化嚴(yán)格依據(jù)課題技術(shù)規(guī)范進(jìn)行，才能保證結(jié)果的有效性和可比性?；祀s因素的控制探討血清YKL-40水平對(duì)OA診斷價(jià)值的關(guān)鍵?；祀s因素的控制（1）生物節(jié)律影響的控制血液標(biāo)本的采集在固定時(shí)間（清晨6-8時(shí)）進(jìn)行。腸蠕動(dòng)影響的控制血液標(biāo)本在清晨空腹時(shí)采集。體育活動(dòng)影響的控制采集血液標(biāo)本前限制病人的體育活動(dòng)。混雜因素的控制（2）肝腎等疾病影響的控制選擇肝腎功能均正常的病例；若樣本含量不足時(shí)，用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行控制。經(jīng)術(shù)前檢查可排除全身感染和腫瘤等的影響。年齡和性別影響的控制采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行控制?；祀s因素的控制（3）手術(shù)影響的控制由于體液標(biāo)本是在麻醉后手術(shù)前采集的，故麻醉的影響可忽略。藥物因素影響的控制采集標(biāo)本前兩月內(nèi)未使用糖皮質(zhì)激素類藥物。進(jìn)度安排

2005年1月~2005年4月文獻(xiàn)檢索，課題設(shè)計(jì)，課題技術(shù)規(guī)范的制定,開(kāi)題報(bào)告。2005年5月~2005年9月標(biāo)本的采集和預(yù)處理，臨床和手術(shù)資料的收集。2005年10月~2005年12月預(yù)實(shí)驗(yàn)，部分體液標(biāo)本YKL-40含量的測(cè)定，分析關(guān)節(jié)液和血清YKL-40水平與膝骨性關(guān)節(jié)炎WOMAC評(píng)分和X線分級(jí)的相關(guān)性。2006年1月~2006年2月體液標(biāo)本YKL-40含量的測(cè)定，分析關(guān)節(jié)液和血清YKL-40水平與膝關(guān)節(jié)鏡下相關(guān)組織大體病理變化程度的相關(guān)性。2006年3月~2006年6月數(shù)據(jù)整理，統(tǒng)計(jì)分析，撰寫論文,論文答辯。開(kāi)題條件（1）

——學(xué)術(shù)及技術(shù)條件研究人員衛(wèi)小春教授長(zhǎng)期從事關(guān)節(jié)軟骨損傷的研究,具有豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)和很強(qiáng)的科研能力.能及時(shí)把握國(guó)際上關(guān)節(jié)軟骨損傷研究的最新進(jìn)展。主持承擔(dān)國(guó)家863計(jì)劃一項(xiàng)及省部級(jí)科研項(xiàng)目多項(xiàng)，在國(guó)內(nèi)外期刊上發(fā)表論文多篇。文獻(xiàn)和技術(shù)準(zhǔn)備已檢索并熟讀了大部分相關(guān)核心文獻(xiàn)，了解該領(lǐng)域的研究進(jìn)展、YKL-40的檢測(cè)方法。病源及標(biāo)本來(lái)源山醫(yī)二院骨科病源充足；課題所需的體液標(biāo)本較易獲得。開(kāi)題條件（2）

——實(shí)驗(yàn)設(shè)備條件山醫(yī)二院所具備的實(shí)驗(yàn)條件手術(shù)室：關(guān)節(jié)鏡設(shè)備；骨科實(shí)驗(yàn)室：酶標(biāo)儀及相關(guān)波長(zhǎng)的濾光片、深低溫冰箱、低速離心機(jī)、高速離心機(jī)、電熱恒溫孵育箱、電子天平、普通冰箱；放射科：拍片相關(guān)設(shè)備。開(kāi)題條件（3）

——經(jīng)費(fèi)預(yù)算科研業(yè)務(wù)費(fèi)3000元實(shí)驗(yàn)材料費(fèi)7000元儀器設(shè)備費(fèi)4000元協(xié)作費(fèi)1500元科研組織費(fèi)2000元合計(jì)17500元

參考文獻(xiàn)PooleR.NIHWhitePaper:Biomakers,theOsteoarthritisInitiative(ABasisforDiscussion).Ferbruary3rd,2000.MorganteM,MetelliMR,MorganteD.ObservationsontheincreasedserumlevelsofYKL-40inpatientswithrheumatoidarthritisandosteoarthritis.MinervaMed.2001;92(3):151-3.JohansenJS,OleeT,PricePA,etal.RegulationofYKL-40productionbyhumanarticularchondrocytes.ArthritisRheum.2001;44(4):826-37.VolckB,JohansenJS,StoltenbergM,etal.StudiesonYKL-40inkneejointsofpatientswithrheumatoidarthritisandosteoarthritis.InvolvementofYKL-40inthejointpathology.OsteoarthritisCartilage.2001;9(3):203-14.KawasakiM,HasegawaY,KondoS,etal.ConcentrationandlocalizationofYKL-40inhipjointdiseases.JRheumatol.2001;28(2):341-5.VosK,SteenbakkersP,MiltenburgAM,etal.Raisedhumancartilageglycoprotein-39plasmalevelsinpatientswithrheumatoidarthritisandotherinflammatoryc