電話：400-998-2324郵箱：service_uplc_ms@163.com網(wǎng)址：本產(chǎn)品僅供科學(xué)研究使用！請勿用于臨床、診斷、食品、化妝品檢測等用途！-上海液質(zhì)檢測技術(shù)有限公司第第3頁，共3頁檸檬酸合酶（CS）活性檢測試劑盒說明書貨號：UPLC-MS-4325規(guī)格：100T/48S

微量法產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系工作人員。試劑名稱規(guī)格保存條件提取液液體50mL×1瓶-20℃保存試劑一液體10mL×1瓶4℃保存試劑二液體0.6mL×1支-20℃保存試劑三液體40mL×1瓶4℃保存試劑四液體2mL×1瓶4℃保存試劑五粉劑×2支-20℃保存試劑六粉劑×1支-20℃保存溶液的配制：1、試劑五：臨用前加入500μL雙蒸水，用不完的試劑仍-20℃保存；2、試劑六：臨用前加入1.5mL雙蒸水，用不完的試劑仍-20℃保存。產(chǎn)品說明：CS（EC）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞的線粒體基質(zhì)中，是三羧酸循環(huán)第一個限速酶，是三羧酸循環(huán)主要調(diào)控位點之一。CS催化乙酰CoA和草酰乙酸產(chǎn)生檸檬酰輔酶轉(zhuǎn)變成黃色的在412nm處有特征吸光值。注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。需自備的儀器和用品：可見分光光度計/酶標(biāo)儀、低溫離心機、水浴鍋、研缽/勻漿器、可調(diào)節(jié)移液器、微量玻璃比色皿/96孔板和蒸餾水。操作步驟：一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）1、組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：稱取約0.1g組織或收集500萬細胞，加入1mL提取液和10μL試劑二，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。將勻漿液600g，4℃離心5min。將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。上清液即胞漿提取物，可用于測定從線粒體泄漏的CS。在沉淀中加入200μL試劑一和2μL試劑二，反復(fù)吹打充分混勻，用于CS測定，并用于蛋白濃度測定。二、測定步驟1、分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至412nm，蒸餾水調(diào)零。2、試劑三置于25℃（一般物種）或者37℃（哺乳動物）水浴中預(yù)熱10min左右（保證無沉淀）。3、操作表：在微量玻璃比色皿/96孔板中分別加入試劑名稱（μL）測定管對照管試劑三172186試劑四77試劑五7-樣本77試劑六7-將上述試劑按順序加入微量玻璃比色皿/96孔板中，加試劑六的同時開始計時，記錄412nm波長下10秒時的初A1，之后迅速將比色皿連同反應(yīng)液一起放入37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)2（96孔板放入恒溫箱中412nm210A2-A1，對照管的ΔA1’=A2-A1，ΔA=ΔA1-ΔA1’。三、CS活性計算A、按微量玻璃比色皿計算：按樣本蛋白濃度計算單位的定義：37℃或25℃下每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmolTNB定義為一個酶活力單位CS（U/mgprot）=ΔA÷（ε×d）×V反總÷（Cpr×V樣本）÷T=1050×ΔA÷Cpr的消光系數(shù)，13.6×10-3mL/(nmol·cm)；V樣本：加入的樣本體積，0.007mLT：反應(yīng)時間，2min；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL。B、按96孔板計算：將上述公式中的d=1cm改為d=0.6cm（96孔板光徑）進行計算即可。注意事項：1、測定過程中樣本和所有試劑在冰上放置，以免變性和失活。237℃或37℃或25℃37℃或25℃水浴鍋中。在反應(yīng)過程中把比色皿連同反應(yīng)液放在此燒杯中。3、最好兩個人同時做此實驗，一個人比色，一個人計時，以保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。496（（，因通過單位時間內(nèi)吸光值變化計算酶活，不推薦同時測多個樣本。5酶活。6、附：使用樣本鮮重計算公式：A、按微量玻璃比色皿計算單位的定義：37℃或25℃下每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmolTNB定義為一個酶活力單位CS上清（U/g質(zhì)量）=ΔA上清÷（ε×d）×V反總÷（W×V樣本÷V提取）÷T=1061×ΔA上清÷WCS沉淀（U/g質(zhì)量）=ΔA沉淀÷（ε×d）×V反總÷（W×V樣本÷V樣總）÷T=212×ΔA沉淀CS（U/g質(zhì)量）=CS上清+CS沉淀=1061×ΔA上清÷W+212×ΔA沉淀÷WΔA上清：上清測定值；ΔA沉淀：沉淀測定值；ε：TNB的消光系數(shù)，13.6×10-3mL/(nmol·cm)；V反總