葉綠素含量的測定一、原理根據(jù)葉綠體色素提取液對可見光譜的吸收，利用分光光度計(jì)在某一特定波長下測定其吸光度，即可用公式計(jì)算出提取液中各色素的含量。根據(jù)朗伯-比爾定律，某有色溶液的吸光度A與其中溶質(zhì)濃度C和液層厚度L成正比，即：A=acl式中：a為比例常數(shù)。當(dāng)溶液濃度以百分濃度為單位，液層厚度為1cm時，a為該物質(zhì)的吸光系數(shù)。各種有色物質(zhì)溶液在不同波長下的吸光系數(shù)可通過測定已知濃度的純物質(zhì)在不同波長下的吸光度而求得。如果溶液中有數(shù)種吸光物質(zhì)，則此混合液在某一波長下的總吸光度等丁各組分在相應(yīng)波長下吸光度的總和，這就是吸光度的加和性。今欲測定葉綠體色素混合提取液中葉綠素a、b和類胡蘿卜素的含量，只需測定該提取液在三個特定波長下的吸光度A，并根據(jù)葉綠素a、b及類胡蘿卜素在該波長下的吸光系數(shù)即可求出其濃度。在測定葉綠素a、b時，為了排除類胡蘿卜素的干擾，所用單色光的波長選擇葉綠素在紅光區(qū)的最大吸收峰。已知葉綠素a、h的80%丙酮提取液在紅光區(qū)的最大吸收峰分別為663nm和645nm，又知在波長663nm下，葉綠素a、b在該溶液中的吸光系數(shù)分別為82.04和9.27，在波長645nm下分別為16.75和45.60，可根據(jù)加和性原則列出以下關(guān)系式：由于葉綠體色素在不同溶劑中的吸收光譜有差異，因此，在使用其他溶劑提取色素時，計(jì)算公式也有所不同。葉綠素a、b在95%乙醇中最大吸收峰的波長二、材料、儀器設(shè)備及試劑（一）材料新鮮（或烘干）的植物葉片。（二）儀器設(shè)備分光光度計(jì)，電子頂載天平（感量0.01g），研缽，棕色容量瓶，小漏斗，定量濾紙，吸水紙，擦鏡紙，滴管。（三）試劑（1）95%乙醇（或80%丙酮）。石英砂。碳酸鈣粉。三、實(shí)驗(yàn)步驟（1）取新鮮植物葉片（或其他綠色組織）或干材料，擦凈組織表面污物，剪碎（去掉中脈），混勻。（2）稱取剪碎的新鮮樣品0.2g，共3份，分別放入研缽中，加少量石英砂和碳酸鈣粉及2~3mL95%乙醇（或80%丙酮），研成勻漿，再加乙醇10mL，繼續(xù)研磨至組織變白。靜置3~5min。（3）取濾紙1張，置漏斗中，用乙醇濕潤、沿玻棒把提取液倒入漏斗中，過濾到25mL棕色容量瓶中，用少量乙醇沖洗研缽、研棒及殘?jiān)鼣?shù)次，最后連同殘?jiān)黄鸬谷肼┒分?。?）用滴管吸取乙醇，將濾紙上的葉綠體色素全部洗入容量瓶中，直至濾紙和殘?jiān)袩o綠色為止。最后用乙醇定容至25mL，搖勻。（5）把葉綠體色素提取液倒人光徑1cm的比色杯內(nèi)。以95%乙醇為空白，在波長665nm、649mm和470nm下測定吸光度。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算與分析按公式（10）、（11）、（12）（如用80%丙酮，則按公式7、8、9）分別計(jì)算葉綠素a、b和類胡蘿卜素的濃度（mg/L）。（10）、（11）式相加即得葉綠素總濃度。求得色素的濃度后，再按下式計(jì)算組織中單位鮮重或干重的各色素的含量：【注意事項(xiàng)】（1）為了避免葉綠素光分解，操作時應(yīng)在弱光下進(jìn)行，研磨時間應(yīng)盡量短些。（2）葉綠體色素提取液不能混濁。可在710nm或750nm波長下測量吸光度，其值應(yīng)小于當(dāng)波長為葉綠素a吸收峰時吸光度值的5%，否則應(yīng)重新過濾。（3）用分光光度計(jì)法測定葉綠素含量，對分光光度計(jì)的波長精確度要求較高。如果波長與原吸收峰波長相差1nm，則葉綠素a的測定誤差為2%，葉綠素b為19%，使用前必須對分光光度計(jì)的波長進(jìn)行校正。校正方法除按儀器說明書外，還應(yīng)以純的葉綠素a和b來校正（表2-12-1）。（4）在使用低檔型號分光光度計(jì)（如：722型、721型等）測定葉綠素a、b含量時，因儀器的狹縫較寬，分光性能差，單色光的純度低（5~7mm），與高中檔儀器如島津UV-120、UV-240等測定