GENEMANIPUTATIONANDITSAPPLICATIONINMEDICALPRACTICE基因操作及其醫(yī)學(xué)應(yīng)用鮑朗教授1醫(yī)學(xué)ppt基因操作的基本策略2醫(yī)學(xué)ppt基因操作的基本策略1.概述2．DNA和基因的近代概念3.基因操作的基本內(nèi)容和程序內(nèi)容提綱3醫(yī)學(xué)ppt理論三大發(fā)現(xiàn)★生物遺傳物質(zhì)是DNA(Avery，U.S.A．1934)★DNA雙螺旋模型(Watson,C.S.H.CrickC.B.1953)★遺傳中心法則(Nirenberg，1961-1966)概述基因操作的基本策略4醫(yī)學(xué)ppt技術(shù)上的三大發(fā)明★限制性內(nèi)切酶(Smithetal.1970)★載體(Cohen1973)★逆轉(zhuǎn)錄機(jī)制(Baltimore1970)5醫(yī)學(xué)ppt基因操作的概念

基因操作的基本策略定義：在基因水平上進(jìn)行人工操作并改變其生物遺傳性的技術(shù)稱基因操作。所采用的主要手段為DNA重組技術(shù)，主要程序是將DNA片段插入到質(zhì)粒、病毒等載體中，形成遺傳物質(zhì)的新組合，然后轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中擴(kuò)增和表達(dá)。6醫(yī)學(xué)pptDNA的生化特性DNA的結(jié)構(gòu)7醫(yī)學(xué)pptDNA的生化特性DNA的結(jié)構(gòu)8醫(yī)學(xué)pptDNA的生化特性DNA的半保留復(fù)制9醫(yī)學(xué)pptRNA的生化特性mRNAmRNA占細(xì)胞RNA總量的1%～5%，分子量范圍幾百～2萬個(gè)核苷酸，變化大（RT/PCR）。原核和真核生物mRNA的結(jié)構(gòu)不同。tRNA各種物種的tRNA均含有73～93個(gè)核苷酸，一端是CCA結(jié)合氨基酸部位，另一端為反密碼子環(huán)。tRNA通曉mRNA的核苷酸語言和蛋白質(zhì)的氨基酸語言（AARS），是蛋白質(zhì)翻譯的譯員。10醫(yī)學(xué)pptRNA的生化特型真核生物（80S,小40s大60s)原核生物(70S,小30s大50S）小亞基rRNA16S(有mRNA識別結(jié)合位點(diǎn))18S(有mRNA識別結(jié)合位點(diǎn))蛋白質(zhì)21種33種大亞基rRNA23S、5S（識別、結(jié)合tRNA）28S、5S、5.8S(識別、結(jié)合tRNA)蛋白質(zhì)34種49種

rRNArRNA與核糖體蛋白共同構(gòu)成核糖體，后者是蛋白質(zhì)合成的場所。核糖體的組成11醫(yī)學(xué)pptWhatistheGene?基因（gene）是核酸貯存遺傳信息的遺傳單位，是貯存有功能的蛋白質(zhì)多肽鏈或RNA序列信息及表達(dá)這些信息所必需的全部核苷酸序列。該順序可以產(chǎn)生或影響某種表型，可以由于突變生成等位基因變異體。12醫(yī)學(xué)ppt基因組的基本結(jié)構(gòu)基因組（genome）指細(xì)胞或生物中，一套完整單倍體遺傳物質(zhì)的總和，包括全套基因及間隔序列。人類基因組包含22條常染色體和XY兩條性染色體上的全部遺傳物質(zhì)（核基因組）以及線粒體上的遺傳物質(zhì)（線粒體基因組）。13醫(yī)學(xué)ppt原核基因組和真核基因組真核生物基因組遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于原核生物的基因組，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，基因數(shù)龐大，具有許多復(fù)制起始點(diǎn)，每個(gè)復(fù)制子大小不一人類染色體單倍體DNA全長3×109bp，含3~4萬個(gè)基因。大腸桿菌DNA全長4.6106bp，含4000個(gè)基因。14醫(yī)學(xué)ppt原核基因組ProkaryoteGenome

基因組通常僅由一條環(huán)狀雙鏈DNA分子組成?；蚪M中只有1個(gè)復(fù)制起點(diǎn)?；蚪M中的重復(fù)序列很少，編碼蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因多為單拷貝?；窘Y(jié)構(gòu)特點(diǎn)：啟動(dòng)子（promoter）、操縱基因（operator）、調(diào)控序列、結(jié)構(gòu)基因（structuregene）、終止子（terminator）?；蛐蛄惺沁B續(xù)的，無內(nèi)含子結(jié)構(gòu)連續(xù)密碼區(qū)mRNA→Protein15醫(yī)學(xué)ppt基本結(jié)構(gòu)：結(jié)構(gòu)基因（structuralgene）指能轉(zhuǎn)錄成為mRNA、rRNA或tRNA的DNA順序。結(jié)構(gòu)基因不連續(xù)，編碼序列被非編碼序列打斷，分割成幾段，編碼序列稱為外顯子(extron)，其間的序列稱為內(nèi)含子(intron),稱為斷裂基因（splitgene）。非編碼區(qū)剪切

編碼區(qū)編碼區(qū)mRNAProtein

真核基因組

EukaryoteGenomeintronexonexon有大量重復(fù)序列16醫(yī)學(xué)ppt原核生物基因表達(dá)的調(diào)控原核生物基因表達(dá)的調(diào)控方式最重要的特點(diǎn)是操縱子模式。主要通過及時(shí)調(diào)整酶系統(tǒng)基因表達(dá)以適應(yīng)環(huán)境，獲取營養(yǎng)。調(diào)控水平主調(diào)在轉(zhuǎn)錄水平，翻譯水平次之。17醫(yī)學(xué)ppt真核生物基因表達(dá)的調(diào)控真核生物基因調(diào)控遠(yuǎn)比原核生物復(fù)雜，絕大多數(shù)真核生物基因極少數(shù)與環(huán)境變化有直接或間接的關(guān)系，其調(diào)控最大特點(diǎn)是遺傳程序調(diào)控。調(diào)控主要水平是轉(zhuǎn)錄水平。其次為轉(zhuǎn)錄后水平、DNA水平、翻譯及翻譯后水平等。18醫(yī)學(xué)ppt1．目的基因的獲取

2．DNA體外重組

3．重組DNA的轉(zhuǎn)化與增殖

4．陽性重組體的篩選探針、PCR、測序

5．目的基因的表達(dá)表達(dá)產(chǎn)物的應(yīng)用限制性內(nèi)切酶

載體分子雜交

基因操作的基本內(nèi)容和程序基因操作的基本策略19醫(yī)學(xué)ppt1.目的基因的獲取1)基因庫篩選、擴(kuò)增:"Shotgun"限制性酶法，機(jī)械切割。2)逆轉(zhuǎn)錄法逆轉(zhuǎn)錄酶合成全長或近全長ds-cDNA．3)人工合成基因：小片段連接，PolymeraseChainReaction基因操作的基本內(nèi)容和程序基因操作的基本策略20醫(yī)學(xué)ppt2.DNA體外重組常用的工具酶（toolenzymes）限制性核酸內(nèi)切酶（resrictionenzymes,restrictionendonadease)DNA連接酶（DNAligase,ligase)逆轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)DNA聚合酶(DNApolymerase,DNApol)核酸酶(nuclease)末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)堿性磷酸酶(BAP或CIP)21醫(yī)學(xué)ppt粘端切割酶：錯(cuò)位切割雙鏈DNA，產(chǎn)生5`或3`粘性末端；5`---GAATTC---3`3`---CTTAAG---5`5`---GAATTC---3`3`---CTTAAG---5`EcoRⅠ5`粘性末端5`---CTGCAG---3`3`---GACGTC---5`5`---CTGCAG---3`3`---GACGTC---5`PstⅠ3`粘性末端1）.限制性核酸內(nèi)切酶（resrictionenzymes,restrictionendonadease)22醫(yī)學(xué)ppt平頭切割酶：沿對稱軸切割DNA雙鏈，產(chǎn)生平端。5`---CCCGGG---3`3`---GGGCCC---5`5`---CCCGGG---3`3`---GGGCCC---5`平端SmaⅠ同功異源酶：來源不同但能識別和切割同一位點(diǎn)的限制酶。5`---GGATCC---3`3`---CCTAGG---5`BamHⅠ和PstⅠ的共同識別位點(diǎn)限制性核酸內(nèi)切酶（resrictionenzymes,restrictionendonadease)23醫(yī)學(xué)ppt是獨(dú)立于許多細(xì)菌及某些真核細(xì)胞染色體外共價(jià)閉合環(huán)狀的雙鏈DNA分子，大小在1—200kb之間，能獨(dú)立復(fù)制的最小遺傳單位。2）.質(zhì)粒（plasmid）24醫(yī)學(xué)ppt質(zhì)粒的分類克隆載體(cloningvector)都有一個(gè)松弛的復(fù)制子，能帶動(dòng)外源基因，在宿主細(xì)胞中復(fù)制擴(kuò)增。它是用來克隆和擴(kuò)增DNA片段（基因）的載體。表達(dá)載體(Expressionvector)具有克隆載體的基本元件（ori,Ampr,Mcs等），還具有轉(zhuǎn)錄/翻譯所必需的DNA順序。為了有效的轉(zhuǎn)錄，必需有強(qiáng)大的能夠被宿主細(xì)胞識別的啟動(dòng)子。25醫(yī)學(xué)ppt人工構(gòu)建質(zhì)粒載體必備條件：較小分子量和松弛復(fù)制子，都能獨(dú)立自主的復(fù)制；基因組上有一到兩個(gè)篩選標(biāo)記，都能便利的加以檢測（抗生素抗性）；有一到數(shù)個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，容易引進(jìn)宿主細(xì)胞中去，也易從宿主細(xì)胞中分離純化（提質(zhì)粒）。理想條件：插入失活篩選標(biāo)記26醫(yī)學(xué)ppt3）.目的基因片段與載體的連接

★粘末端法：堿性磷酸酶退火

★平接法：T4噬菌體DNA連接

★接頭法：人工合成R.E識別順序

★聚尾法：分別加連polyA(T)或G27醫(yī)學(xué)ppt3．重組DNA的轉(zhuǎn)化與增殖制備CompetenceCell（氯化鈣處理幼嫩E.coli,yeast,動(dòng)物cell,昆蟲.)C．Cell--R.DNA——>”Hotshock”(42℃，2’)

——>L．B．Culture-->37℃，lhr．

-->LB．a(chǎn)gar．plate-->genomiclibrary．28醫(yī)學(xué)ppt４．陽性重組體的篩選

①抗藥基因抗Ampicilin基因Ampicilin敏感受體細(xì)胞

＋

Ampicilin培養(yǎng)基

↓未轉(zhuǎn)化菌落不能存活29醫(yī)學(xué)ppt②顏色反應(yīng)Lac+Polylinker+β-半乳糖苷酶Xgal藍(lán)色/白色利用30醫(yī)學(xué)ppt③影印原位雜交（SituHybridization)菌落ＤＮＡ

硝酸纖維濾膜陽性重組體原位固定重組探針雜交31醫(yī)學(xué)ppt④斑點(diǎn)雜交(DotBlots)已知重組DNA濾膜重組DNA同源性和特異性方陣打點(diǎn)陽性重組DNA探針雜交基因操作的基本策略32醫(yī)學(xué)ppt⑤southern雜交DNA片段吸印重組探針雜交后處理33醫(yī)學(xué)ppt5．外源基因表達(dá)克隆基因在原核細(xì)胞中表達(dá)克隆基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)克隆基因在其它表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)昆蟲表達(dá)系統(tǒng)酵母表達(dá)系統(tǒng)34醫(yī)學(xué)ppt在原核表達(dá)體系（以Ecoli為代表）：優(yōu)點(diǎn)1.遺傳背景清楚,易于調(diào)控;2.表達(dá)技術(shù)經(jīng)典成熟,應(yīng)用廣泛,目前無以取代;3.目的基因表達(dá)水平高,E.coli培養(yǎng)周期短，“物美價(jià)廉”.缺點(diǎn)1.缺少真核蛋白質(zhì)翻譯后加工修飾系統(tǒng),如剪切,糖基化,及正確二硫鍵形成等;2.表達(dá)蛋白質(zhì)多以包涵體形式存在,需經(jīng)復(fù)性才能恢復(fù)構(gòu)象與活性.3.宿主本身雜蛋