微生理計(jì)的軟件設(shè)計(jì)探討

作者：王江容吳成雄胡寧周潔蘇凱麒王平單位：浙江大學(xué)生儀學(xué)院集成芯片上的阻抗傳感器檢測到細(xì)胞阻抗的變化由阻抗檢測電路檢測到并傳送給中央控制電路，光尋址電位傳感器檢測到細(xì)胞代謝的離子變化信號由光尋址電位傳感器檢測電路得到并傳送至中央控制電路。中央控制電路對整個生理采集信號的過程進(jìn)行控制，并對獲取的信號數(shù)據(jù)進(jìn)行自動分析后，由usb接口傳送到計(jì)算機(jī)上［3］。圖略為微生理計(jì)的系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖，主要由集成芯片，相應(yīng)的檢測系統(tǒng)電路，以及溫度控制和流動注射等部分組成。軟件總體設(shè)計(jì)及算法分析本系統(tǒng)使用MicrosoftVisualStudio2008開發(fā)，設(shè)計(jì)計(jì)語言采用C#語言，設(shè)計(jì)器采用WindowsPresentationFoundation(WPF)，相比WindowsForms編寫的應(yīng)用，WPF將windows表示層發(fā)展至用聲明式語言進(jìn)行開發(fā)，并且融入大量的動畫和特效，更重要的是，WPF對于多線程編程的優(yōu)化使得軟件的多線程操作性能更強(qiáng)。為滿足軟件的可移植性以及可維護(hù)性需求，本系統(tǒng)采用分層架構(gòu)，分層架構(gòu)的主要原則是一層的元素只依賴于同一層的其他元素或者下一層元素［5］。使用分層架構(gòu)((a))使得系統(tǒng)的代碼((b))可維護(hù)性更強(qiáng)，修改簡便。本系統(tǒng)將使用以下分層組織設(shè)計(jì)軟件系統(tǒng)。UI顯示層———本層負(fù)責(zé)接收用戶命令，解釋用戶命令并將信息反饋給用戶，有時(shí)，用戶是另一個系統(tǒng)。如數(shù)據(jù)的顯示、測試的控制等一切用戶所需求的內(nèi)容都通過改層反饋給用戶。數(shù)據(jù)處理層———本層負(fù)責(zé)處理下層上傳的數(shù)據(jù)并上傳給UI顯示層，在本系統(tǒng)中這些數(shù)據(jù)包括IV測試、恒壓測試和恒流測試、阻抗譜掃描和阻抗長時(shí)測試的數(shù)據(jù)，環(huán)境溫濕度和CO2濃度。監(jiān)測層———封裝與測試模式相關(guān)的類接收下層(通訊層)上傳的數(shù)據(jù)并上傳給數(shù)據(jù)處理層，測試模式包括流路控制、環(huán)境監(jiān)測、IV測試、恒壓測試、恒流測試、阻抗譜掃描和阻抗長時(shí)測試。通訊層———封裝RS232串口通訊和注射泵通訊類，RS232按照預(yù)定的通訊協(xié)議與下位機(jī)通訊，注射泵采用美國EraPumpNE－1000可編程注射泵通訊層軟件系統(tǒng)與下位機(jī)的通訊主要包括串口操作類和通信協(xié)議類，串口操作類的公共接口包括:串口的參數(shù)設(shè)置、打開、關(guān)閉、寫入數(shù)據(jù)、讀取數(shù)據(jù)和串口的校驗(yàn)，串口的基本操作是對Windows串口類System．IO．Ports．SerialPort類進(jìn)一步封裝;串口接收數(shù)據(jù)事件是一個基于Windows消息模式的異步調(diào)用事件。通信協(xié)議類包括協(xié)議的讀取、保存和解析，本儀器的通信協(xié)議以可擴(kuò)展標(biāo)記語言(extensiblemarkuplanguage，XML)的格式存儲在文件中，當(dāng)用戶下次使用時(shí)，將自動應(yīng)用上次的參數(shù)設(shè)置。監(jiān)測模塊通訊LAPS和ECIS測量由RS232與下位機(jī)通訊完成，按照預(yù)定的通訊協(xié)議，握手后通過串口向下位機(jī)傳遞控制命令，下位機(jī)根據(jù)命令向上傳遞對應(yīng)的數(shù)據(jù)包，軟件根據(jù)數(shù)據(jù)包的包頭描述，將數(shù)據(jù)拆包送至處理和顯示模塊。流路模塊通訊流路模塊采用美國EraPumpNE－1000可編程注射泵，控制培養(yǎng)液和藥物的注入、廢液的抽取。該注射泵提供RS232串口的通訊接口，通過串口可控制泵的啟停、轉(zhuǎn)向轉(zhuǎn)速，轉(zhuǎn)速從0．1r/min到50r/min可控，根據(jù)泵的直徑和轉(zhuǎn)速可計(jì)算出實(shí)時(shí)的流量，同時(shí)也可根據(jù)設(shè)定的流量控制泵的啟停時(shí)間。監(jiān)測層數(shù)據(jù)監(jiān)測層負(fù)責(zé)監(jiān)測并接收下位機(jī)上傳的控制指令和數(shù)據(jù)，將數(shù)據(jù)傳遞給數(shù)據(jù)處理層，該層包括細(xì)胞參數(shù)數(shù)據(jù)監(jiān)測、環(huán)境數(shù)據(jù)監(jiān)測、流路數(shù)據(jù)監(jiān)測和控制指令監(jiān)測，其中，控制指令的監(jiān)測包括參數(shù)測量的開始、暫停和停止，注射泵的啟停等。數(shù)據(jù)監(jiān)測數(shù)據(jù)監(jiān)測包括細(xì)胞參數(shù)監(jiān)測、環(huán)境數(shù)據(jù)監(jiān)測和流路數(shù)據(jù)監(jiān)測，細(xì)胞參數(shù)監(jiān)測包括多通道LAPS參數(shù)監(jiān)測和多通道ECIS參數(shù)監(jiān)測，下位機(jī)以數(shù)據(jù)包的形式向上位機(jī)發(fā)送參數(shù)監(jiān)測數(shù)據(jù)，上位機(jī)通過拆分?jǐn)?shù)據(jù)包識別數(shù)據(jù)并將數(shù)據(jù)傳遞給對應(yīng)的數(shù)據(jù)處理類。溫濕度和CO2濃度的監(jiān)測構(gòu)成環(huán)境數(shù)據(jù)的監(jiān)測模塊，下位機(jī)同樣以數(shù)據(jù)包的形式傳遞給上位機(jī)，通過數(shù)據(jù)包的拆分獲得環(huán)境的數(shù)據(jù)，監(jiān)測層將環(huán)境數(shù)據(jù)傳遞給數(shù)據(jù)處理層，若超出上下限則啟動報(bào)警功能?？刂浦噶畋O(jiān)測控制指令主要是指上位機(jī)對下位機(jī)的控制，包括LAPS和ECIS測試控制、注射泵的控制以及環(huán)境監(jiān)測的控制，LAPS和ECIS的測試控制由測試的啟動、暫停、停止以及測試時(shí)序的控制組成，環(huán)境的控制包括溫濕度監(jiān)測的啟動和停止，注射泵的控制包括測試時(shí)序、轉(zhuǎn)速和運(yùn)轉(zhuǎn)的控制，一旦監(jiān)測到顯示層往下傳遞的控制指令，該層按照預(yù)先設(shè)定的協(xié)議將制定打包傳遞給通訊模塊，再由通訊模塊傳遞給下位機(jī)，進(jìn)一步控制儀器實(shí)現(xiàn)功能。數(shù)據(jù)處理層數(shù)據(jù)處理層主要包含ECIS和LAPS的數(shù)據(jù)校準(zhǔn)、在線數(shù)據(jù)處理、數(shù)據(jù)回放。數(shù)據(jù)校準(zhǔn)因?yàn)闄z測電路本身存在的誤差，導(dǎo)致了模數(shù)轉(zhuǎn)換后得到的測量值與真實(shí)值間存在一定的誤差，因此，需要對測量值進(jìn)行校準(zhǔn)。LAPS和ECIS檢測系統(tǒng)上傳的數(shù)據(jù)均為阻抗值，因此數(shù)據(jù)校準(zhǔn)分為幅值校準(zhǔn)和相位校準(zhǔn)。(1)幅值校準(zhǔn)幅值誤差與測量頻率有關(guān)，經(jīng)過理論分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后，我們得到這一關(guān)系滿足如下表達(dá)式:其中，Y表示真實(shí)值，X表示測量值，a，b表示與測量頻率f相關(guān)的系數(shù)，他們可以通過測量已知數(shù)值的精確電阻電容網(wǎng)絡(luò)得到。(2)相位校準(zhǔn)相位誤差與測量頻率有關(guān)，采用拉格朗日插值進(jìn)行校準(zhǔn)，即在頻率為f時(shí)相位的測量相位Tm0與實(shí)際相位Tr0之間存在關(guān)系：為與測量頻率f相關(guān)的變量，Nj為實(shí)際測量的相位，Mj為電路測量到的相位，他們是通過已知的精確電阻電容網(wǎng)絡(luò)計(jì)算得出的。LAPS在線數(shù)據(jù)處理方法研究LAPS測量模式分為Ⅰ～Ⅴ掃描、恒壓測試和恒流測試，測量方式可由用戶根據(jù)具體情況選擇。IV掃描用于自動確定傳感器的最佳工作點(diǎn)，恒壓測試或者恒流測試用于長時(shí)程實(shí)時(shí)地監(jiān)測細(xì)胞酸化率的變化。(1)自動檢測工作點(diǎn)方法研究在LAPS檢測中，Ⅰ～Ⅴ曲線工作點(diǎn)的偏移反映了被檢測物質(zhì)的濃度變化［6］，且該工作點(diǎn)是該曲線線性區(qū)的拐點(diǎn)［7］，基于這點(diǎn)，本文設(shè)計(jì)了一種自動檢測工作點(diǎn)算法，該算法結(jié)合數(shù)據(jù)歸一化和一階求導(dǎo)的方法檢測工作點(diǎn)，是針對Ⅰ～Ⅴ曲線的工作點(diǎn)處于曲線線性區(qū)，且位于歸一化值的中間值附近這一特點(diǎn)設(shè)計(jì)的，算法針對性強(qiáng)，相較于以前所采用的非線性最小二乘擬合和三次樣條插值，該算法時(shí)間復(fù)雜度低，執(zhí)行效率高，易于c#實(shí)現(xiàn)，完全可以實(shí)現(xiàn)在線的實(shí)時(shí)檢測，同時(shí)也提高了LAPS恒流測電壓的效率。算法分為四步。第1步，平滑。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)和應(yīng)用驗(yàn)證，采用奇數(shù)點(diǎn)平滑(通常采用九點(diǎn)平滑)測試數(shù)據(jù)，以濾除噪聲。第2步，Ⅰ～Ⅴ曲線歸一化。第3步，搜索曲線的中間點(diǎn)，并鎖定該店左右可控范圍內(nèi)的數(shù)據(jù)點(diǎn)。第4步，將第三步中鎖定的數(shù)據(jù)點(diǎn)用一階求導(dǎo)的方法查找拐點(diǎn)。算法查找工作點(diǎn)精確度柱狀圖與算法執(zhí)行時(shí)間柱狀圖為了驗(yàn)證上述算法的有效性，我們對三種離子，分別為Ca2+，Cl－，K+，共九個濃度梯度(每種離子有三個濃度梯度)進(jìn)行Ⅰ～Ⅴ掃描，中列出了采用本算法和采用平滑后三次樣條插值的方法檢測掃描數(shù)據(jù)的工作點(diǎn)在準(zhǔn)確度和執(zhí)行時(shí)間上的區(qū)別。從查找工作點(diǎn)的準(zhǔn)確度和時(shí)間復(fù)雜度都有明顯改善。(2)酸化率計(jì)算恒流測量模式酸化率計(jì)算:微生理計(jì)在計(jì)算細(xì)胞新陳代謝方面是一個有效的工具，在恒流模式下測量電壓隨時(shí)間的變化，因此必須定義一個代表細(xì)胞產(chǎn)生質(zhì)子與電壓變化關(guān)系的表達(dá)式［8］。假設(shè)S(mV/pH)是LAPS的靈敏度，α(V/mV)是特征S型曲線拐點(diǎn)處的斜率，Δt是時(shí)間間隔，ΔVout(mV)代表在Δt內(nèi)輸出電壓的變化。酸化率可以表示為（式略）恒壓測量模式酸化率計(jì)算:在恒壓測量模式下計(jì)算酸化率的方式與恒流測量模式相似，只是S型特征曲線的縱軸取電流值，α單位為μA/MV，ΔIout代表在Δt內(nèi)輸出的電流變化，其余變量表示的意義與恒流模式下相同。酸化率可以表示為（式略）ECIS在線數(shù)據(jù)處理方法研究(1)細(xì)胞指數(shù)計(jì)算在測量阻抗時(shí)常用細(xì)胞指數(shù)表征細(xì)胞狀態(tài)［9］，細(xì)胞指數(shù)與阻抗之間的關(guān)系如下（式略）其中，CIK(t)表示第K通道的細(xì)胞在t時(shí)刻的細(xì)胞指數(shù)，ZK(t)表示第K通道在t時(shí)刻的阻抗值，Z0(t)表示參考通道(無細(xì)胞附著通道)在t時(shí)刻的阻抗值。為了進(jìn)一步研究細(xì)胞的變化，我們提出標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞指數(shù)的概念［10］（式略）CIK(t)表示第K通道在t時(shí)刻的細(xì)胞指數(shù)，CInml_time表示在歸一化時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞指數(shù)，我們可以選擇通道起始點(diǎn)為歸一化時(shí)間點(diǎn)，則標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞指數(shù)可以表示為（式略）(7)其中，t0表示選定的歸一化的時(shí)間點(diǎn)(一般選定為實(shí)驗(yàn)起始點(diǎn))(2)藥物半數(shù)抑制濃度(HalfMaximalInhibitoryConcentration，IC50)計(jì)算IC50是藥物評價(jià)中一種常用的指標(biāo)，在某一指定時(shí)刻由于一定濃度的藥物誘導(dǎo)細(xì)胞數(shù)量減少50%，該濃度就被記做這一時(shí)刻的IC50，IC50反映了藥物的誘導(dǎo)能力和細(xì)胞的耐受程度。標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞指數(shù)與抑制性藥物濃度的關(guān)系呈現(xiàn)S型曲線關(guān)系［11－12］，可利用LOGIT模型采用最小二乘擬合:（式略）和分別表示空白對照組和理論最大劑量組的標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞指數(shù)，x為某時(shí)刻的藥物濃度，y是該時(shí)刻對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞指數(shù)。采用非線性最小二乘擬合得到系數(shù)k和s，根據(jù)IC50的定義數(shù)據(jù)回放數(shù)據(jù)的回放功能便于用戶在實(shí)驗(yàn)完成后查看和分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。測試數(shù)據(jù)在數(shù)據(jù)處理層保存，保存后綴名與測試數(shù)據(jù)種類相關(guān)聯(lián)，當(dāng)用戶導(dǎo)入需回放的數(shù)據(jù)文件時(shí)，軟件識別導(dǎo)入文件的數(shù)據(jù)類型并自動提供對應(yīng)的離線數(shù)據(jù)處理接口。（圖略）軟件測試界面UI顯示層UI顯示層是直接面向用戶層，即用戶界面，用戶的一切輸入和操作通過顯示層向下傳遞，通過預(yù)訂的協(xié)議傳遞給下位機(jī)，同時(shí)實(shí)時(shí)反饋測試的信息。用戶界面的布局方式采用標(biāo)簽頁的形式，一共四個標(biāo)簽頁，分別為主界面標(biāo)簽頁、ECIS測試標(biāo)簽頁、LAPS測試標(biāo)簽頁和數(shù)據(jù)處理標(biāo)簽頁，用標(biāo)簽頁組織功能模塊的方式便于用戶理解軟件功能和操作。（圖略）為軟件的測試界面。本軟件的界面顯示最主要部分是測試數(shù)據(jù)的顯示，采用微軟研發(fā)的DynamicDataDisplay(圖略)庫實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)的動態(tài)顯示，這是一個最新的用于科學(xué)軟件中數(shù)據(jù)顯示的庫，提供創(chuàng)建數(shù)據(jù)曲線的接口，可實(shí)現(xiàn)曲線的矢量放大、縮小、復(fù)制和整體移動，數(shù)據(jù)圖片的保存等功能，便于測試過程中查看數(shù)據(jù)的微小變化。軟件實(shí)現(xiàn)為了測試軟件的穩(wěn)定性以及算法的可靠性，進(jìn)行了一系列的實(shí)驗(yàn)。首先，采用LAPS芯片測量細(xì)胞微環(huán)境的變化。用注射泵將低緩沖濃度的培養(yǎng)基以60μL/min的速度分別注入培養(yǎng)有腎細(xì)胞和無細(xì)胞的培養(yǎng)腔中，注入持續(xù)時(shí)間為2min，斷開時(shí)間為1min，以此自定義采用ECIS芯片測試活化的肝星狀細(xì)胞在藥物作用下阻抗的變化。在ECIS芯片上以20萬/mL的密度培養(yǎng)肝星狀細(xì)胞，參考通道為空片，即無細(xì)胞附著。細(xì)胞阻抗響應(yīng)的大小依賴于細(xì)胞在芯片上的貼附質(zhì)量和細(xì)胞覆蓋面積的大?。?3－14］，細(xì)胞形態(tài)從圓形變得平整和伸展的時(shí)候，細(xì)胞貼附變得更好的同時(shí)，覆蓋面積也增加，引起阻抗響應(yīng)的增加，相反地，細(xì)胞在抑制藥物的作用下凋亡后脫離芯片表面，阻抗減小。在本實(shí)時(shí)序控制注射泵自動工作。以恒壓模式測量光生電流的變化，以此計(jì)算酸化率的改變。使用本文中所介紹的軟件系統(tǒng)進(jìn)行測試的結(jié)果如圖6。圖6中藍(lán)色標(biāo)注是通泵的標(biāo)識，在蠕動泵關(guān)閉的1min內(nèi)，細(xì)胞分泌的物質(zhì)加速了培養(yǎng)腔內(nèi)的酸化過程，腔內(nèi)PH值減小，光生電流隨之減小，這與圖6(a)中LAPS在Ⅰ～Ⅴ模式下測試的特征曲線是一致的，而作為對照組的無細(xì)胞培養(yǎng)腔體(圖6(c))在斷泵時(shí)沒有光生電流下降的變化。軟件實(shí)時(shí)檢測斷泵的起止時(shí)間，將斷泵期間的光生電流擬合，按照前述式(4)實(shí)時(shí)計(jì)算酸化率的變化，圖6(d)反映的是每一個斷泵周期的酸化率與測試起始時(shí)腔內(nèi)酸化率的比值，可以看到，該比值穩(wěn)定在0．70～0．84之間，沒有太大變化，這是因?yàn)闇y試時(shí)只加入了低濃度的緩沖溶液，而沒有加入任何其他影響細(xì)胞代謝的藥物。驗(yàn)中，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)開始兩天后向活化的肝星狀細(xì)胞和空片培養(yǎng)腔中同時(shí)加入藥物，可從圖7(a)中觀察到加藥前阻抗值增加，這是由于細(xì)胞的分裂和增殖引起細(xì)胞貼附在芯片表面，在加藥后細(xì)胞阻抗急劇減小，這是由于細(xì)胞在抑制藥物的作用下逐漸凋亡，死亡的細(xì)胞脫離芯片變成懸浮狀態(tài)后導(dǎo)致的。圖7(b)中細(xì)胞指數(shù)值是根據(jù)圖7(a)中細(xì)胞阻抗值按照式(5)實(shí)時(shí)計(jì)算所得，細(xì)胞指數(shù)值以歸一化的方式更直觀地反映出細(xì)胞貼附狀態(tài)的改變?？偨Y(jié)與討論本文介紹的新型微生理計(jì)的軟件系統(tǒng)基于．net平臺，采用分層架構(gòu)，便于軟件的二度