PAGE·PAGE5·第二十六章免疫PCR技術(Immuno-PCRtechnique)概述（一）免疫PCR技術的概念免疫PCR是一種抗原檢測系統(tǒng)，將一段已知序列的DNA片段標記到抗原抗體復合物上，再用PCR方法將這段DNA擴增，然后用常規(guī)方法檢測PCR產物。免疫PCR集PCR的高靈敏度與抗體和抗原反應的特異性于一體。其突出的特點是指數(shù)級的擴增效率帶來了極高的敏感度，能檢出濃度低至2ｎｇ/Ｌ的抗原物質，為現(xiàn)行任何一種免疫定量方法所不及。（二）免疫PCR體系的組成免疫PCR體系由待檢抗原,特異性抗體,連接分子，DNA和PCR擴增系統(tǒng)。1．待檢抗原被檢測的樣品可以是抗原，或者是作為抗原的某種抗體。待檢的抗原可以直接吸附于固相(包被抗原)，這一過程與ELISA試驗是相同的。2．特異抗體免疫PCR中的特異性是對應于待測抗原，與ELISA一樣，抗體的特異性和親和力將影響免疫PCR的特異性和敏感性。一般均選用單克隆抗體，這個抗體常采用生物素標記，通過親和或葉綠素再結合DNA。3．連接分子連接分子是連接特異抗體與DNA之間的分子。Sano等用鏈親和素/蛋白Ａ(striptavidin-proteinA)基因工程融合體作為連接分子來連接生物素標記的DNA與抗體，此種融合蛋白的鏈親和素部分可識別DNA上的生物素，蛋白部分可識別抗體的Fc段。4．DNA和PCR系統(tǒng)免疫PCR中的DNA是一指示分子，用DNA聚合酶將結合于固相上的DNA特異放大，由此定量檢測抗原。免疫PCR的敏感性多于ELISA主要是應用了PCR強大的擴增能力。免疫PCR中的DNA分子可以選擇任何DNA，但要保證DNA的純度，且有較好的均質性，盡可能不選用受檢樣品中可能存在的DNA。一般可選用質粒DNA或PCR產物等。DNA的生物素化是用生物素標記的dATP或dUTP通過聚合酶標記在DNA分子上，一般是1個分子DNA標記2個生物素，標記率可達百分之百。免疫PCR的PCR擴增系統(tǒng)與一般PCR一樣,主要包括引物、緩沖液和耐熱DNA聚合酶。（三）、免疫PCR產物的檢測PCR擴增產物一般先用瓊脂糖凝膠進行電泳，然后經嗅化乙啶染色，再照相記錄PCR產物的電泳結果，通過底片上PCR產物的光密度可以得出PCR產物的量，即代表固相上吸附的待檢抗原量，將其與標準抗原制備的標準曲線進行比較就可以準確地得出抗原的實際量。二、免疫PCR技術應用（一）材料與方法生物素標記特異性抗體的制備免疫球蛋白（如IgG、IgM）的Fc片段上有糖基存在，因而可用能與糖基結合的Biotin-hydrazide作生物素標記。（1）將純化的抗體（IgM或IgG，0.1~1.0ml）在標記緩沖液（0.1Mol/LNaAc，pH值5.5，0.1Mol/LNaCl）中4℃透析過夜。（2）吸取0.5ml至微量離心管中，加過碘酸鈉溶液至終濃度為10mMol/L，置冰浴上于暗處孵育30min，使抗體分子上的糖基氧化。（3）將氧化的抗體過PBS平衡的SephadexG25PD-10預裝柱，使之與過碘酸鈉分開。收集蛋白峰。（4）向抗體管中加入Biotin-LC-hydrazide(Pierce)至終濃度5mMol/L，置混搖器上室溫孵育1h。（5）用含0.02%NaN3的PBS平衡SephadexG25預裝柱，將生物素標記的抗體分子過柱與游離的生物素分開。收集蛋白峰，保存-20℃。生物素標記DNA片段的制備作為將與抗體偶聯(lián)的報告DNA片段，應確保在待測抗原來源的機體DNA中無同源序列，如可選用大腸桿菌的序列作為報告DNA去檢測人源的標本。DNA片段大小為300~500bp，生物素標記可采用PCR方法，根據(jù)報告DNA的核苷酸序列合成一對引物，其中一個引物的5’端堿基上帶有生物素標記。在0.5mlPCR管中按表25-1將下列試劑混合。表25-1PCR系統(tǒng)組成試劑添加量終濃度10×PCR緩沖液10.0ul1×2.5mMol/L4dNTP混合物8.0ul0.2mMol/L50uMol/L生物素標記的上游引物1.0ul0.5uMol/l50uMol/L生物素標記的下游引物1.0ul0.5uMol/l15mMol/L模板DNA1.0ul1.0ugTaqDNA聚合酶1.0ul5U加水至100uL混勻后上面覆蓋液體石蠟。95℃加熱5min，然后在PCR儀上按下列程序擴增：94℃1min;55℃1min;72℃1min;40個循環(huán)。最后72℃延伸10min。加等量酚-氯仿抽提，然后加10ul3Mol/LKac，250uL無水乙醇，置-70℃30min。離心沉淀DNA片段，用70%乙醇洗一次。將沉淀DNA干燥后溶于TE緩沖液中，保存在-20℃。制備抗體-親和素-DNA復合物將生物素標記的抗體與親和素按等分子濃度混合于含有1mg/mlBSA的PBS中，室溫孵育30min，再加入兩倍分子濃度的生物素標記的DNA片段，繼續(xù)孵育30min，最后加入10倍分子濃度的生物素，將親和素分子上的結合部位飽和。最后過凝膠過濾柱將復合物與未結合的單體分開，加入BSA達1mg/ml，分裝后凍存于-20℃。4.免疫PCR按常規(guī)ELISA方法，用飽和緩沖液稀釋抗原，加到96孔塑料板或0.5mlPCR管中，4℃過夜。用PBS洗三次，然后每孔加200ul封閉液（PBS含10mg/mlBSA，1mg/ml魚精DNA），室溫孵育30min。用TETBS（其配方：20mMol/LEDTA，0.02%NaN3）洗三次。將抗體-親和素-DNA復合物稀釋于含有1mg/mlBSA和0.1mg/ml魚精DNA的TETBS中，每孔加50ul，室溫孵育1h。用TETBS洗5次，然后將塑料板或管倒置在吸水紙上拍打以控干水分。每管中加50ulPCR反應液，含有表25-2成分：表25-2PCR反應液試劑添加量終濃度10×PCR緩沖液5.0μl1×2.5mMol/L4dNTP混合物4.0μl0.2mMol/L50uMol/L生物素標記的上游引物0.5μl0.5μMol/l50uMol/L生物素標記的下游引物0.5μl0.5μMol/l15mMol/LMgCl25.0μl1.5μgTaqDNA聚合酶0.5μl2.5U加水至50μL混勻后上面覆蓋液體石蠟。95℃加熱5min，然后在PCR儀上按下列程序擴增35個循環(huán)：94℃1min;55℃1min;72℃1min。最后72℃延伸10min。每管取5ul作瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，溴化乙錠染色后觀察結果，如在PCR時加入了放射性核素標記，則可用X光片顯影。亦可在凝膠電泳后做Southern-blot，用特異性探針雜交，進一步提高其特異性和敏感性。三、注意事項本實驗的關鍵步驟是獲得適當?shù)目贵w-DNA復合物。用鏈親和素將生物素標記的抗體與生物素標記的DNA偶聯(lián)的方法，因每個鏈親和素分子可與四個生物素分子結合，因此要優(yōu)化反應條件，以使得每個鏈親和素分子既能結合上抗體分子，又能結合上DNA片段。此外，還可用化學方法將DNA片段與抗體分子共價偶聯(lián)，即將抗體分子和5’端氨基酸修飾的DNA片段分別用不同的雙功能偶聯(lián)劑激活，然后通過自發(fā)的反應偶聯(lián)到一起，比如，用N-Succinimidyl-S-acetylthioacetate(SATA)活化氨基修飾的DNA片段，用Sulfo-Succinimidyl4-(maleimidomethyl)Cyclohexane-1-Carboxylate(Sulfo-SMCC)修飾抗體分子，然后將二者在一小管中混合，通過加入鹽酸胲（Hydroxylaminehydrochloride）使二者偶聯(lián)在一起。免疫PCR具有高敏感性。因此，抗體和標記DNA的任何非特異性結合均可導致嚴重的本底問題。因而在加入抗體和標記DNA后必須盡可能徹底地清洗。即使有些特異性結合的抗體或標記DNA被洗掉了，亦可在最后通過增加PCR的循環(huán)次數(shù)得到彌補。此外，應用有效的封閉劑對防止非特異性結合也是非常重要的?？捎妹撝谭酆团Ｑ灏椎鞍鬃龅鞍追忾]劑，用魚精DNA做核酸封閉劑。防止本底信號的另一個重要因素是控制污染，這也是所有敏感的檢測系