文件名稱人乳頭瘤病毒基因分型(23型)檢測(cè)試劑盒檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程文件編號(hào)版本A/0頁(yè)次起草人檢測(cè)組審核人批準(zhǔn)人起草日期審核日期批準(zhǔn)日期頒發(fā)組質(zhì)量保證組分發(fā)組人乳頭瘤病毒基因分型(23型)檢測(cè)試劑盒標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程１目的明確人乳頭瘤病毒基因分型(23型)檢測(cè)試劑盒檢測(cè)的操作規(guī)程，指導(dǎo)檢驗(yàn)人員正確進(jìn)行膜條芯片檢測(cè)。2適用范圍2.1適用于進(jìn)行人乳頭瘤病毒基因分型(23型)檢測(cè)試劑盒檢測(cè)的檢驗(yàn)人員。2.2適合儀器：常規(guī)基因擴(kuò)增儀、恒溫雜交箱。2.3方法原理：采用PCR和DNA雜交相結(jié)合的DNA芯片技術(shù)。2.4樣品要求：泌尿生殖道樣本。2職責(zé)實(shí)驗(yàn)操作人員應(yīng)嚴(yán)格按操作規(guī)程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。4試劑來(lái)源《人乳頭瘤病毒基因分型(23型)檢測(cè)試劑盒》（亞能生物技術(shù)（深圳）有限公司）。5質(zhì)控物陰性對(duì)照來(lái)源于試劑盒6試劑配制6.1配制前準(zhǔn)備6.1.1實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)入該區(qū)須穿專用工作服、鞋套；6.1.2記錄溫濕度計(jì)讀數(shù)和冰箱溫度讀數(shù)；6.1.3準(zhǔn)備所需材料：量筒，移液器，pH計(jì)，電子秤，蒸餾水及配套試劑盒；6.2擴(kuò)增試劑分裝每管加入20μlPCR反應(yīng)液，蓋好管蓋4℃放置待用；6.320×SSC（pH7.0）NaCL175.3g檸檬酸鈉88.2g加蒸餾水800ml溶解，用濃HCl調(diào)pH值至7.0，最后定容至1000ml，并高壓滅菌保存；6.410%SDS（pH7.0）SDS20g加蒸餾水180ml溶解，用濃HCl調(diào)pH值至7.0，最后定容至200ml；6.51M檸檬酸鈉（pH5.0）檸檬酸鈉294.1g加蒸餾水700ml溶解，用濃HCl調(diào)pH值至5.0，最后定容至1000ml；6.6A液（2×SSC、0.1%SDS）20×SSC100ml10%SDS10ml加蒸餾水定容至1000ml；B液（0.5×SSC、0.1%SDS）20×SSC25ml10%SDS10ml加蒸餾水定容至1000ml；C液（0.1M檸檬酸鈉）1M檸檬酸鈉100ml加蒸餾水定容至1000ml；6.7顯色液（新鮮配制使用，按順序加入以下溶液）C液19mlTMB1ml30%H2O22μl3.10配制完成后做好記錄，并對(duì)臺(tái)面進(jìn)行清潔消毒；6.8注意事項(xiàng)6.8.1擴(kuò)增反應(yīng)液根據(jù)當(dāng)天標(biāo)本數(shù)量分裝使用；6.8.2配制好的試劑貼上標(biāo)簽，標(biāo)明試劑名稱，濃度，配制日期，有效期，配制人后，置2～8℃保存?zhèn)溆?，TMB需避光保存；6.8.3不同批號(hào)的試劑勿混用，除非廠家有特別說(shuō)明；6.8.4每周一清點(diǎn)庫(kù)存試劑，看有無(wú)過(guò)期或?qū)⒔狡诘脑噭?，或作?bào)廢處理或排列優(yōu)先使用，避免浪費(fèi)，然后記錄試劑的詳細(xì)保存情況。7核酸提取操作7.1充分震蕩洗脫宮頸刷，并在管壁上擠干；7.2取1ml洗脫液轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中，編號(hào)，13000r離心10min；7.3去上清，保留管底細(xì)胞沉淀；7.4加50μl裂解液懸浮沉淀，金屬浴加熱10min；7.513000r離心10mine，保留上清待用。7.6注意事項(xiàng)7.6.1離心去上清后，必須保證管底有細(xì)胞沉淀；7.6.2加熱時(shí)，蓋緊離心管蓋，防止水進(jìn)入管內(nèi)，且要保證沸水浴恒溫10min；7.6.3加熱后必須離心，若暫時(shí)不用，可4℃保存，使用前再次離心。8產(chǎn)物分析操作步驟8.1雜交：8.1.1取15ml塑料離心管，放入標(biāo)有樣本編號(hào)的膜條（應(yīng)在膜條編號(hào)處用中性記號(hào)筆），加入A液5-6毫升及所有（25ul）的PCR產(chǎn)物，擰緊管蓋，再稍微將管蓋擰松，以避免加熱時(shí)管蓋爆開(kāi)。8.1.2將離心管放入沸水浴中，確保A液液面完全位于沸水浴液之下，加熱10分鐘。8.1.3加熱結(jié)束后取出，擰緊管蓋，放入雜交箱51℃雜交至少1.5小時(shí)。8.1.4取50ml塑料離心管，加入50mlB液，于雜交箱或水浴箱預(yù)熱至51℃。8.1.5陰性質(zhì)控品和陽(yáng)性質(zhì)控品同步處理。8.2洗膜：取出膜條，移至裝有預(yù)熱B液的50ml離心管中，于51℃輕搖洗滌5分鐘（每管50mlB液，最多可同時(shí)洗4張膜）8.3顯色8.3.1按A液：POD﹦2000:1配制孵育液（2張膜需4ulPOD，配制8ml孵育液，4張膜可用6ulPOD母液，配制成12孵育液），室溫輕搖孵育30分鐘，棄去孵育液。8.3.2用A液室溫輕搖洗兩次，每次5分鐘。8.3.3用C液室溫洗膜1~2分鐘，同時(shí)配制顯色液，顯色液需新鮮配制。8.3.4將膜條浸泡于顯色液中避光顯色至少30分鐘，轉(zhuǎn)移至去離子水中浸泡即可觀察結(jié)果。8.4結(jié)果判讀8.4.1PC為顯色質(zhì)控點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)的每張膜條在PC位點(diǎn)必須出現(xiàn)藍(lán)色顯色信號(hào)，陰性質(zhì)控品除PC位點(diǎn)出現(xiàn)顯色信號(hào)外其余位點(diǎn)均不出現(xiàn)顯色信號(hào)，陽(yáng)性質(zhì)控品除PC點(diǎn)出現(xiàn)顯色信號(hào)外，必須在相應(yīng)HPV基因型位點(diǎn)出現(xiàn)顯色信號(hào)。8.4.2根據(jù)膜條上藍(lán)色斑點(diǎn)顯現(xiàn)的位置，讀取相應(yīng)位置上標(biāo)注的基因型信息，僅一個(gè)基因型位點(diǎn)出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)，則為相應(yīng)基因型的單一感染，若多個(gè)基因型位點(diǎn)出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)，則為相應(yīng)基因型的混合感染。8.4.3臨床樣本檢測(cè)結(jié)果若只有PC位點(diǎn)顯色而其他位點(diǎn)均無(wú)色，表明被檢測(cè)樣本未感染HPV，或感染了本試劑盒檢測(cè)范圍之外的HPV，或檢測(cè)拷貝數(shù)在試劑盒檢測(cè)下限之下，即小于1.0×103copies/ml。8.5注意事項(xiàng)8.5.1應(yīng)嚴(yán)格按SOP文件進(jìn)行操作，控制好雜交、洗膜所需要的時(shí)間和溫度。8.5.2雜交全過(guò)程要避免用手接觸膜條，可用鑷子夾取膜條邊角操作，或戴手套操作；8.5.3顯色液需現(xiàn)配現(xiàn)用，配制時(shí)應(yīng)按順序加入C液、TMB和H2O2,顯色過(guò)程應(yīng)避光，可放入暗盒中操作，顯色時(shí)間不得低于30分鐘。8.5.4室溫低于20℃時(shí)，A、B液中可能會(huì)有結(jié)晶析出，雜交前應(yīng)先溫浴使之溶解。8.6支持性文件《人乳頭瘤病毒基因分型(23型)檢測(cè)試劑盒》說(shuō)明書(shū)（亞能生物技術(shù)（深圳）有限公司）9檢測(cè)報(bào)告9.1檢測(cè)人員9.1.1檢測(cè)人員負(fù)責(zé)提供檢測(cè)報(bào)告所需的數(shù)據(jù)，錄入檢測(cè)報(bào)告；9.1.2錄入結(jié)果時(shí)核對(duì)送檢基本信息，檢測(cè)唯一標(biāo)識(shí)、檢測(cè)項(xiàng)目與檢測(cè)內(nèi)容對(duì)應(yīng)性，提交審核；9.1.3檢測(cè)人員對(duì)檢測(cè)結(jié)果、送檢信息及檢測(cè)內(nèi)容的準(zhǔn)確性負(fù)責(zé)。9.2報(bào)告審核人員9.2.1報(bào)告審核人員審核檢測(cè)報(bào)告中送檢信息、檢測(cè)項(xiàng)目、檢測(cè)結(jié)果。審核完成后提交授權(quán)；9.2.2審核人員負(fù)責(zé)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性負(fù)責(zé)。9.3報(bào)告授權(quán)人員9.3.1對(duì)報(bào)告完整性進(jìn)行檢查；9.3.2授權(quán)人員對(duì)報(bào)告的一切對(duì)外法律事物負(fù)責(zé)；9.4報(bào)告發(fā)放9.4.1報(bào)告采用數(shù)據(jù)服務(wù)器訪問(wèn)及掛號(hào)信兩種方式進(jìn)行發(fā)放；9.4.2報(bào)告接收人具備網(wǎng)絡(luò)使用條件時(shí)，使用數(shù)據(jù)