分子生物學(xué)實驗院系：生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院

生物科學(xué)（基地）201101班分子生物學(xué)基礎(chǔ)實驗分子生物學(xué)實驗技術(shù)已成為生物化學(xué)及分子生物學(xué)以及相關(guān)學(xué)科院系教學(xué)科研不可缺DNA基因擴增等等。一、實驗原理

實驗一質(zhì)粒DNA的小量制備要把一個有用的外源基因通過基因工程手段，送進細胞中去進行繁殖和表達，需要運載工具，攜帶外源基因進入受體細胞的這種工具就叫載體（。載體的設(shè)計和應(yīng)用是DNA是一個復(fù)制子，載體有復(fù)制點才能使與它結(jié)合的外源基因復(fù)制繁殖）載體在受體細胞中能大量增殖，只有高復(fù)制率才能使外源基因在受體細胞中大量擴增）A1到幾個限制如有抗四環(huán)素基因，抗新霉素基因）等，以此知道它是否已進入受體細胞，也可根據(jù)這個標(biāo)記將受體細胞從其他細胞中分離篩選出來。細菌質(zhì)粒具備上述條件，它是基因工程中常用的載體之一。質(zhì)粒（plasmid）是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子，大小在1～120kb之間，具有雙鏈閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的DNA的許多生物學(xué)功能也是對宿主細胞的補償。質(zhì)粒在細胞內(nèi)的復(fù)制，一般分為兩種類型：嚴密控制型和松弛控制型d。前者只在細胞周期的一定階段進行復(fù)制，染色體不復(fù)制時，它也不復(fù)制。每個細胞內(nèi)只含有1復(fù)制，在細胞里，它有許多拷貝，一般在20個以上。通常大的質(zhì)粒如F因子等，拷貝數(shù)較少，復(fù)制受到嚴格控制。小的質(zhì)粒，如EⅠ質(zhì)粒（含有產(chǎn)生大腸桿菌素1基因，DNA復(fù)制203000DNADNA2驗分離提純化的質(zhì)粒pBR322、pUC19就是由ColEⅠ衍生的質(zhì)粒。所有分離質(zhì)粒DNA的方法都包括三個基本步驟:培養(yǎng)細菌使質(zhì)粒擴增；收集和裂解細菌；分離和純化質(zhì)粒。采用溶菌酶可破壞菌體細胞壁，十二烷基硫酸鈉）可使細胞壁解，經(jīng)溶菌酶和陰離子去污劑DNA纏繞附著在細胞DNA。DNApBR322的相對分子質(zhì)量為2.8×106，質(zhì)粒pUC19的相對分子質(zhì)量為1.7×106。在細胞內(nèi)，共價閉環(huán)DNA（covalentlyclosedcircular常以超螺旋形式存在。如果兩條鏈nr。在電泳時，同一質(zhì)粒如以A形式存在，它比其開環(huán)和線狀DNADNA在電泳3條區(qū)帶。二、實驗?zāi)康恼莆兆畛Ｓ玫奶崛≠|(zhì)粒DNA的方法和檢測方法。了解制備原理及各種試劑的作用。三、實驗材料和試劑材料：大腸桿菌pBR322質(zhì)粒。試劑：LBNaOHpH至7.3左右。如固體培養(yǎng)基則添加15g/L瓊脂。T緩沖液0L。滅菌后存放。S加入0.2mol/LNaOH，4℃保存。溶液Ⅲ8乙酸鉀溶液：L、雙蒸餾水。l抽提幾次以平1，4℃保存。無水乙醇7.70％乙醇8.pH8.0TEl儀器：

1mmol/LEDTA，其中含RNA酶20μg/mL。EP(1.5mL、吸頭。四、操作步驟（一）培養(yǎng)細菌pBR322的大腸桿菌接種在含50μg/mLLB液體培AmpLB（二）從菌落中快速提取制備質(zhì)粒DNA1.4mL1.5mLEp。棄上清加入150μL GET緩沖液在渦旋混合器上充分混勻在室溫下放置。加入LL，加蓋，顛倒（不要振蕩～3次，使之混勻，冰上放置4min，最多不能超過5min。150μL。5．10000rpm，上清液吸至另一干凈的1.5mLEp中，如上清液渾濁則需重新離心一次。轉(zhuǎn)移至另一1.5mLEp管中，注意勿將兩液相中間的白色蛋白薄層吸出。7．向上清液加入2。用離心機于10000rpm離心5min。倒去上清液。0.5mL70燥(將離心管倒置于一張紙巾上)，備用。30uLDNARNase(20TE4℃保存，供下午電泳使用。這里因為要檢測質(zhì)粒是否提取成功以及提取質(zhì)粒的濃度，故在此要進行一次電泳，下面為瓊脂糖凝膠電泳的原理及方法：原理：根據(jù)DNA分子量不同，采用外加電場使其分開，用EB嵌入DNA分子后在紫外下DNA就可以估計出待測樣品的濃度。電泳后的瓊脂凝膠糖直接在紫外燈下拍照，只需要5－由于電泳時所用的樣品量非常少，只要將濃度控制在幾十納克即可，所以在基因工程中經(jīng)常被用做檢測DNA樣品。表λDNA/HindⅢ中DNA片斷片段堿基對數(shù)目/kb相對分子質(zhì)量DNA含量/%DNA含量/(ng/mg)123.13015.0×10647.7476.929.4196.12×10619.4194.136.5574.26×10613.5135.244.3712.84×106989.952.3221.51×1064.847.962.0281.32×1064.241.870.5640.37×1061.111.680.1250.08×1060.32.6總DNA含量為100%瓊脂糖凝膠板的制備瓊脂糖凝膠的制備1.0g瓊脂糖，置于錐形瓶中，加入100mLTBE緩沖液，于電爐上加熱，注意：防止溢出，由于瓊脂糖較難溶解，如果水分損失較大，則補充一定量的蒸餾水，使其終濃1％。膠板的制備將有機玻璃內(nèi)槽洗凈、晾干。取膠帶紙將有機玻璃內(nèi)槽的兩端邊緣封好，形成一個邊腳模子。注意：將橡皮膏緊貼在有機玻璃內(nèi)槽兩端邊上，不能留空隙。將有機玻璃內(nèi)槽置于水平位置，放好樣品槽模板(一般稱之為梳子)，將冷卻至65℃左右的瓊脂糖凝膠，小心地倒在內(nèi)槽上，控制灌膠速度，使膠液緩慢地展開，直到整個有機玻璃板表面形成均勻的膠層。室溫下靜置1h左右，待凝固完全后，輕輕拔出樣品槽模板，撕去膠帶紙，膠板上即形成相互隔開的樣品槽。將有機玻璃內(nèi)槽放入電泳槽中，加入0.5×TBE電泳緩沖液，以蓋過膠板為宜。加樣

膠板內(nèi)的樣品小槽用移液槍將上述樣品分別加入膠板的樣品小槽內(nèi)，每次加完一個樣品為了避免交叉污10uL每塊膠板需點一個λDNA/HindⅢ)電泳DNA片段的遷移速度與DNA。當(dāng)溴酚藍染料（藍色）移動到距離膠板下沿約1～2cm處，停止電泳。染色將電泳后的凝膠浸入EB染液中，進行染色以觀察在瓊脂糖凝膠中的DNA帶。染色20min后，用大量水沖洗。觀察254nmDNA條帶。用凝膠自動成像儀處理代替。五、注意事項收集菌體提質(zhì)粒前，培養(yǎng)基要去除干凈，同時保證菌體在懸浮液中充分懸浮。絮狀沉淀。苯酚具有腐蝕性，能造成皮膚的嚴重?zé)齻耙挛飺p壞，使用時應(yīng)注意。如不小心皮膚上碰到苯酚則應(yīng)用堿性溶液、肥皂及大量的清水沖洗。l進行平衡。所以異戊醇時應(yīng)取下層溶液，因為上層是Tris-HCl液隔絕空氣層。異戊醇抽提后，吸取上清液時注意不要把中間的白色層吸入，其中含有蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。Ep不回收。有些質(zhì)粒本身可能在某些菌種中穩(wěn)定存在，但經(jīng)過多次移接有可能造成質(zhì)粒丟失不要頻繁轉(zhuǎn)接，每次接種時應(yīng)挑單菌落。六、實驗結(jié)果與分析提取質(zhì)粒DNA后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，圖譜如下：MDNA凝膠電泳的檢測圖，本人所用的質(zhì)粒為DNA分子DNA濃度很高；DNA包括超螺旋結(jié)構(gòu)，開環(huán)結(jié)構(gòu)以及線性結(jié)構(gòu)等，它們在凝膠中的泳動速度不同，所以在圖譜中顯示有多條帶；膠孔中比較亮的部分表明提取的質(zhì)粒中有大量蛋白質(zhì)殘留；條帶非常寬而且兩側(cè)有輕微的拖尾跡象表明點樣時樣品量加的過多，在質(zhì)粒檢測中可以適當(dāng)減少加樣量，使得條帶清晰均勻一點。一般在實驗室中，不會單獨檢測質(zhì)粒DNA，或者檢測質(zhì)粒DNA時不用Marker，這主要是因為質(zhì)粒DNA分子結(jié)構(gòu)多樣，在電泳圖譜中并不能夠正確顯示其大小。七、思考題裂解細菌時需注意的事項有哪些？SDS-NaOHNaOH,5DNA質(zhì)粒的基本性質(zhì)有哪些？DNA制和轉(zhuǎn)錄能力；可獨立游離在細胞質(zhì)內(nèi)，也可以整合到細菌染色體中。3DNA中各溶液的作用是什么？溶液Ｉ:pH8.0GET的底部，增加溶液的粘度，維持滲透壓及防止DNAEDTA＋和＋I金屬離子都螯合掉。從而起到抑制DNaseDNA1SDS)，NaOH雙層膜結(jié)構(gòu)向微囊）SDSbcR-O-SO3

-…R＋-蛋白質(zhì)的復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來。SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在接下來的提取過程必須把它去除干凈，以便下一步試驗的更好進行。溶液Ⅲ：pH4.8pH變性的質(zhì)粒DNAIIIK+置換了SDS形成了不溶性的RNA蛋白復(fù)者是因為鹽與酚DNase的降解作用，由于蛋白與DNA蛋白分子溶于酚相，而DNADNase的降解作用；氯仿能克服酚的缺點，加速有機相與液相分層，去除核酸溶液中的跡量酚（酚易溶于氯仿中；異戊醇的作用是減少蛋白質(zhì)變性操作過程中產(chǎn)生的氣泡，異戊醇可以降低表面DNA的水相、中間的變性蛋白相及下層有機溶劑相維持穩(wěn)定。乙醇可以以任意比和水相混溶，而DNADNADNA70%乙醇：將質(zhì)粒DNA表面的離子洗去。pH8.0TE緩沖液：由于緩沖液是TrisH+/Tris，不存在金屬離子的干擾作用，而TE緩沖液中的EDTADNADNADNADNATrispH8是因為DNApHRNADNARNADNADNA的方法包括哪幾個步驟？DNA變性，利用醋酸鹽沉淀基因組氯、將DNADNA在醇中不可溶而黏在一起，這一步也能除掉鹽分。DNA的產(chǎn)量？答：第一是擴大質(zhì)粒DNA的拷貝數(shù)，一般認為，培養(yǎng)16LBDNA氯仿溶液離心之后小心吸取的同時盡量吸取完全，減少損失。DNA4些什么？TE緩沖液中含有水分，會結(jié)成冰晶插入到DNA分子的間隙中，而在4℃條件下不會出現(xiàn)這種狀況。若是質(zhì)粒DNA分子反復(fù)凍溶，水溶液的反復(fù)結(jié)冰會導(dǎo)致環(huán)狀DNA分子斷裂，導(dǎo)致得到線性的質(zhì)粒DNA4長期保存。一、實驗原理

實驗二DNA的含量、純度與分子量的電泳法測定測定核酸通常采用兩種方法：即紫外分光光度法與瓊脂糖凝膠電泳法。1．紫外分光光度法DNARNA260nm280nm260nm1ug/mLDNAA0.20，即在A=1DNA，單鏈DNA260RNA含量為40ug/mL，單鏈寡核苷酸的含量為33ug/mL。雙鏈DNA含量＝A×50×稀釋倍數(shù)（ug/mL）260RNA含量＝A×40×稀釋倍數(shù)（ug/mL）260單鏈DNA含量＝A×33×稀釋倍數(shù)（ug/mL）260此外還可以根據(jù)260nm280nm

/A）估計核酸的純度。2．瓊脂糖凝膠電泳法

260

280DNA分子量不同，采用外加電場使其分開，用EBDNA分子后在紫外下顯熒光。而熒光強度正比于DNA的含量，如將已知濃度的標(biāo)準樣品表就可以估計出待測樣品的濃度。電泳后的瓊脂凝膠糖直接在紫外燈下拍照，只需要5－由于電泳時所用的樣品量非常少，只要將濃度控制在幾十納克即可，所以在基因工程中經(jīng)常被用做檢測DNA樣品。表λDNA/HindⅢ中DNA片斷片段堿基對數(shù)目/kb相對分子質(zhì)量DNA含量/%DNA含量/(ng/mg)123.13015.0×10647.7476.929.4196.12×10619.4194.136.5574.26×10613.5135.244.3712.84×106989.952.3221.51×1064.847.962.0281.32×1064.241.870.5640.37×1061.111.680.1250.08×1060.32.6總DNA含量為100%二、實驗?zāi)康?．從以上實驗中提取到的質(zhì)粒DNA，為了能作下一步的酶切，連接及轉(zhuǎn)化實驗，必須測定DNA的純度、含量以及分子量大小。2三、實驗材料和試劑材料：自制的質(zhì)粒、λDNA/HindDNAmarker(λDNA/HindⅢ)限制性內(nèi)切酶10X緩沖液40溴化乙錠染液0B是一種誘變劑，水沖洗干凈。Esg用蒸餾水定容至。5×TBE母液，使用時稀釋10Eppendorf架、恒溫Ep、吸頭。四、實驗操作（一）質(zhì)粒DNA的酶解1．新提的質(zhì)粒，在10uL的體系中用單一酶（如EcoRⅠ）進行處理，即：質(zhì)粒DNA 10×緩沖液 ddHO 22．37℃，保溫30min。3．加入1/10體積的酶反應(yīng)終止液，混勻以停止酶解反應(yīng)。各酶解樣品于冰箱中貯存?zhèn)溆?。（二）瓊脂糖凝膠板的制備瓊脂糖凝膠的制備1.0g瓊脂糖，置于錐形瓶中，加入100mLTBE緩沖液，于電爐上加熱，注意：防止溢出，由于瓊脂糖較難溶解，如果水分損失較大，則補充一定量的蒸餾水，使其終濃度為1％。膠板的制備將有機玻璃內(nèi)槽洗凈、晾干。取膠帶紙將有機玻璃內(nèi)槽的兩端邊緣封好，形成一個邊腳模子。注意：將橡皮膏緊貼在有機玻璃內(nèi)槽兩端邊上，不能留空隙。將有機玻璃內(nèi)槽置于水平位置，放好樣品槽模板(一般稱之為梳子)，將冷卻至65℃左右的瓊脂糖凝膠，小心地倒在內(nèi)槽上，控制灌膠速度，使膠液緩慢地展開，直到整個有機玻璃板表面形成均勻的膠層。室溫下靜置1h左右，待凝固完全后，輕輕拔出樣品槽模板，撕去膠帶紙，膠板上即形成相互隔開的樣品槽。將有機玻璃內(nèi)槽放入電泳槽中，加入0.5×TBE電泳緩沖液，以蓋過膠板為宜。加樣

膠板內(nèi)的樣品小槽用移液槍將上述樣品分別加入膠板的樣品小槽內(nèi)，每次加完一個樣品為了避免交叉污10uL每塊膠板需點一個λDNA/HindⅢ)電泳DNA片段的遷移速度與DNA。當(dāng)溴酚藍染料（藍色）移動到距離膠板下沿約1～2cm處，停止電泳。染色將電泳后的凝膠浸入EB染液中，進行染色以觀察在瓊脂糖凝膠中的DNA帶。染色20min后，用大量水沖洗。觀察254nmDNA條帶。用凝膠自動成像儀處理代替。五、注意事項120℃冰箱，不要將酶在冰浴中放置過久，或放在高于0℃以上的環(huán)境中，以防止酶失活。3．酶切加樣次序為水、緩沖液和DNA，然后混勻。酶永遠是最后加入的，如將酶直接加入濃縮的緩沖液中會引起嚴重的失水。酶切反應(yīng)體系的溶液加完后，用手指輕彈管壁使溶液混勻，也可用微量離心機甩一下，使溶液集中在管底，不要用振蕩器。此步操作是整個實驗成敗的關(guān)鍵，注意防止錯加、漏加。4被污染。5作。勿將溶液滴灑在臺面或地面上，用后用水徹底沖洗干凈。六、實驗結(jié)果與分析為1為被酶EcoRI所切1pEGFP-N3質(zhì)粒2號泳道為未酶切DNA通過瓊脂糖凝膠時速度不一。由DNA七、思考題EB顯色的原理。答：溴化乙錠答：溴化乙錠EtBE，是芳香族熒光化合物，用于觀察瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠中的核酸。是一種核酸染料，常在瓊脂糖凝膠電泳中用于核酸染色，是一種強的誘變劑，可能EB未與核酸結(jié)合的溴化乙錠可被激發(fā)出橙紅色螢光。在與DNA或雙股RNA結(jié)合時，螢光強2倍，使得核酸電泳后的膠片可以辨識核酸的相對位置。在核酸分子中EB分子電泳過程中隨時觀察核酸的遷移情況，這種方法使用于一般性的核酸檢測。電泳過程中隨時觀察核酸的遷移情況，這種方法使用于一般性的核酸檢測。使用溴化乙錠時應(yīng)注意什么？答：不慎與眼睛接觸后，立即用大量清水沖洗并征求醫(yī)生意見；穿戴適當(dāng)?shù)姆雷o服、手套和護目鏡或面具；若發(fā)生事故或感不適，立即就；避免皮膚接觸；吸入有極高毒性，避免吸入。和護目鏡或面具；若發(fā)生事故或感不適，立即就；避免皮膚接觸；吸入有極高毒性，避免吸入。說明不同電壓對電泳結(jié)果的影響是什么？答：限制性內(nèi)切酶消化后的DNADNA段的遷移率將以不同的幅度增長，片段越大，因場強升高引起的遷移率升高幅度也越大，因此電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。原則上場強度不要超過DNA變性50V左右的低電壓可以讓DNA分子片段沉降到膠孔中的適當(dāng)位置，分散更加均一后緩慢泳出加樣孔，條帶整齊集中，對于微量珍貴樣本和小片段樣本（容易在凝膠中擴散消失，顯色不清），可以轉(zhuǎn)換高電壓，當(dāng)溴酚藍條帶移動到距凝0.5~1.0cm時，停止電泳。綜上，兩種電壓交替使用既提高分離效果，又較好節(jié)余時間。DNA的純度？答：DNAOD260/OD280DNA其OD260/OD2801.6-1.8有。實驗三感受態(tài)細胞的制備及轉(zhuǎn)化一、實驗原理感受態(tài)就是細菌吸收轉(zhuǎn)化因子的生理狀態(tài)，只有發(fā)展為感受態(tài)的細胞才能穩(wěn)定攝取外DNA分子。轉(zhuǎn)化是將外源DNADNADNase的羥基－鈣磷酸混合物粘附于細胞表面，經(jīng)42℃短時間熱沖擊處理，促使細胞吸收DNA復(fù)合物，在選擇性培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，可選出所需的轉(zhuǎn)化子。二、實驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)和理解影響細胞感受態(tài)的因素，掌握感受態(tài)細胞的制備方法。掌握質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化方法。把體外DNA擇出轉(zhuǎn)化子。三、實驗材料和用具材料：自制的質(zhì)粒DNA、大腸桿菌(E.coli)菌種(DH5α菌株)。試劑：LB瓊脂平板(無抗生素)、LB50μg/L、LB、LB液體培養(yǎng)基100mL(無抗生素)、LB50μg/L、。儀器：恒溫培養(yǎng)箱、恒溫搖床、接種環(huán)、涂布器、冷凍離心機、離心管、超凈工作臺、高壓蒸汽滅菌鍋。四、操作步驟(一)大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備從新活化的5mL50mLLB37℃快速振蕩培養(yǎng)。5mL培養(yǎng)液放入離心管中，在冰上放置4℃5000rpm。1mL溶液輕輕懸浮細胞，。4℃，5000rpm。200μL溶液，小心懸浮細胞，冰上放置片刻，即制成了感受態(tài)細胞懸液。制好的感受態(tài)細胞可在冰上放置。(二)細胞轉(zhuǎn)化編號質(zhì)粒感受態(tài)細胞無菌水0.1mol/LCaCl2樣品2100//對照1/1002/對照22//100L搖勻后的感受態(tài)細胞懸液，進行下一步的轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化如下（DNA對照1為受體菌對照組：100μL感受態(tài)細胞＋2μL無菌水2DNA對照組：100μL0.1mol/LCaCl

＋2μL質(zhì)粒DNA2將以上各樣品輕輕搖勻，冰上放置30min42。上述各管中分別加入400μLLB液體培養(yǎng)基，使總體積為37態(tài)，并使轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生抗藥性。(三)平板培養(yǎng)取各樣品培養(yǎng)液100μL分別接種于含卡那霉素和不含卡那霉素的LB平板培養(yǎng)基上（，待菌落生長良好且未相互重疊時停止培養(yǎng)。(四)檢出轉(zhuǎn)化體不含抗生素培養(yǎng)基

含抗生素培養(yǎng)基

結(jié)果分析受體菌對照組質(zhì)粒對照組轉(zhuǎn)化實驗組

有大量菌落長出無菌落長出有大量菌落長出

無菌落長出無菌落長出有菌落長出

本實驗未產(chǎn)生抗藥性菌株質(zhì)粒DNA不含雜菌質(zhì)粒進入受體菌中產(chǎn)生抗藥性五、注意事項這一個實驗中的所有操作均要為無菌操作，在超凈工作臺內(nèi)進行。90s要準確操作。制備感受態(tài)細胞過程中，需要在冰上放置的一定不要在室溫中放置。六、實驗結(jié)果與分析912即質(zhì)粒對照組不含卡那的平板上發(fā)現(xiàn)一個菌落，含卡那的平板沒有菌落。轉(zhuǎn)化實驗組受體菌對照組質(zhì)粒對照組思考題感受態(tài)細胞制備好后，為什么在轉(zhuǎn)化前還要在冰上放置？0DNADNase42DNA思考