方法學(xué)驗(yàn)證中各項(xiàng)指標(biāo)的深度剖析謝沐風(fēng)上海市藥品檢驗(yàn)所xiemufeng@1方法學(xué)驗(yàn)證中各項(xiàng)指標(biāo)的深度剖析謝沐風(fēng)上海市藥品檢驗(yàn)所1一、線性試驗(yàn)

主成分含量測(cè)定以測(cè)定濃度為100%，50%~120%之間選取5個(gè)點(diǎn)即可。

溶出（釋放）度測(cè)定以釋放量的10%～120%間選取5個(gè)點(diǎn)即可。

雜質(zhì)含量用雜質(zhì)對(duì)照品準(zhǔn)確測(cè)定以雜質(zhì)限度為100%，50%~120%之間選取5個(gè)點(diǎn)即可。2一、線性試驗(yàn)主成分含量測(cè)定以測(cè)定濃度為1測(cè)定結(jié)果：

1）闡述如何看待截距和斜率、如何應(yīng)用。

2）誤差在哪里，應(yīng)用時(shí)的注意事項(xiàng)。

3）為什么沒(méi)有不成線性的？通常C、H、O、N結(jié)構(gòu)，紫外監(jiān)測(cè)器決定。

個(gè)別化學(xué)鍵所致。梯度洗脫時(shí)，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)不成線性。

4）都成線性、為何還要做？最小二乘法的原理知曉。3測(cè)定結(jié)果：

1）闡述如何看待截距和斜率、如何應(yīng)用。

2）誤差唑來(lái)磷酸結(jié)構(gòu)式4唑來(lái)磷酸結(jié)構(gòu)式4引申使用：

1）有關(guān)物質(zhì)測(cè)定歸一化法和自身對(duì)照法的相互妙用。

2）緩釋制劑溶出度測(cè)定，對(duì)照品濃度設(shè)定為中間濃度。舉例說(shuō)明。

3）回收率試驗(yàn)為何做80%~120%即可？亦及樣品濃度與對(duì)照品濃度接近到何等程度的理解。

4）國(guó)內(nèi)只注重相關(guān)系數(shù)，不注重截距。5引申使用：

1）有關(guān)物質(zhì)測(cè)定歸一化法和自身對(duì)照法的相互妙二、精密度試驗(yàn)

重復(fù)性試驗(yàn)：連續(xù)進(jìn)樣6次。

中間精密度試驗(yàn)和重現(xiàn)性試驗(yàn)通過(guò)“耐用性試驗(yàn)中的溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)”來(lái)體現(xiàn)。

濃度極低時(shí)才會(huì)不理想，加大進(jìn)樣量。

色譜峰形極為重要，對(duì)稱性、柱效等參數(shù)。加大柱溫、增加流動(dòng)相中有機(jī)相比例，使被測(cè)物質(zhì)峰盡快出峰。6二、精密度試驗(yàn)重復(fù)性試驗(yàn)：連續(xù)進(jìn)樣6次。

中三、準(zhǔn)確度試驗(yàn)用回收率來(lái)衡量

作法：在80%~120%間選擇3點(diǎn)或5點(diǎn)，原因是由外標(biāo)一點(diǎn)法決定的。

已知雜質(zhì)、且有雜質(zhì)對(duì)照品的，可采用加入法，即加樣回收率來(lái)評(píng)價(jià)。

一般情況下，只要空白輔料無(wú)干擾，回收率均是良好的！7三、準(zhǔn)確度試驗(yàn)用回收率來(lái)衡量作法：在80四、專屬性有關(guān)物質(zhì)為主，其他檢測(cè)項(xiàng)目（含量）基本上均參照有關(guān)物質(zhì)。

有關(guān)物質(zhì)的驗(yàn)證，采用中間體和降解產(chǎn)物（確認(rèn)結(jié)構(gòu)后人工合成）來(lái)驗(yàn)證與主成分的分離。

8四、專屬性有關(guān)物質(zhì)為主，其他檢測(cè)項(xiàng)目（含量）系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的配制方法：

在100％濃度的主成分溶液中加入1%濃度的雜質(zhì)對(duì)照品，以模擬樣品中有可能存在的狀態(tài)。

介紹配制方法

——先配制雜質(zhì)貯備液，再用供試品溶液（或濃的對(duì)照品溶液）來(lái)稀釋，簡(jiǎn)便、易行！9系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的配制方法：

在100％濃度的專屬性試驗(yàn)驗(yàn)證圖譜10專屬性試驗(yàn)驗(yàn)證圖譜10

存在問(wèn)題——配制相同濃度，測(cè)定樣品時(shí)，主成分峰驟然加大，將雜質(zhì)峰覆蓋。

強(qiáng)破壞試驗(yàn)的目的：

驗(yàn)證藥品在遭遇了極端的氣候環(huán)境條件下產(chǎn)生的雜質(zhì)，在所建立的色譜條件下是否能夠分離、測(cè)定。11存在問(wèn)題——配制相同濃度，測(cè)定樣品時(shí)，主成分峰驟●檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

涉及到各被檢測(cè)物質(zhì)在該波長(zhǎng)下的響應(yīng)因子是否相同，即所謂重量校正因子的問(wèn)題。（f=A雜質(zhì)/A被測(cè)成分）

選取主成分與各雜質(zhì)具有相同紫外吸收的波長(zhǎng)（f=1.0）。

選取各雜質(zhì)紫外吸收大于主成分紫外吸收的波長(zhǎng)（f>1.0），這樣可更加嚴(yán)格控制雜質(zhì)的限度。

如選取各雜質(zhì)紫外吸收小于主成分紫外吸收的波長(zhǎng)，應(yīng)必須加入重量校正因子（f<1.0），否則將得到錯(cuò)誤的判斷。12●檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

涉及到各被檢測(cè)物質(zhì)在該波長(zhǎng)下的介紹該項(xiàng)檢測(cè)的由來(lái)和歷史背景

要看主峰里是否有雜質(zhì)，如何判斷？但需注意DAD檢測(cè)器的局限性，介紹“土辦法”！

結(jié)果：目前從來(lái)沒(méi)有推翻現(xiàn)行色譜條件的。意義在哪里。如何應(yīng)用，拿到只是“走形式”？13介紹該項(xiàng)檢測(cè)的由來(lái)和歷史背景

要看主峰里是最小峰面積的設(shè)定

●

其設(shè)定，不是絕對(duì)值，而是相對(duì)值。

●英國(guó)藥典中有明確的說(shuō)明：凡有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)采用HPLC法測(cè)定時(shí)，均規(guī)定舍棄對(duì)照溶液主峰面積幾分之幾的峰面積。普通樣品測(cè)定時(shí)，通常為1/10~1/20（即相當(dāng)于樣品測(cè)定濃度的0.1%~0.05%）。如規(guī)定雜質(zhì)限度為1.0%，對(duì)照溶液峰面積為10000，那么，最小峰面積可考慮設(shè)定為1000~500左右。新藥穩(wěn)定性考核時(shí)，可設(shè)定到0.01%的最小峰面積。

●原料藥銷售與購(gòu)買的合同中，為確保雙方達(dá)成一致意見(jiàn)，此點(diǎn)應(yīng)予以重視。14最小峰面積的設(shè)定

●其設(shè)定，不是絕對(duì)值，而是相對(duì)值。

●強(qiáng)力破壞試驗(yàn)

●水破壞取原料適量，加水溶解后，在90℃放置24小時(shí)。

●氧化破壞取原料適量，用5%過(guò)氧化氫溶液溶解后，在90℃放置24小時(shí)。

●強(qiáng)堿破壞取原料適量，用1mol/L氫氧化鈉溶液溶解后，在90℃放置24小時(shí)。

●強(qiáng)酸破壞取原料適量，加1mol/L鹽酸溶液溶解后，在90℃放置24小時(shí)。

●高溫破壞取原料適量，依據(jù)各自品種的熔點(diǎn)不同，在高溫下破壞至外觀性狀改變

●強(qiáng)光破壞取原料適量，置紫外燈下照射48小時(shí)。15強(qiáng)力破壞試驗(yàn)

●水破壞取原料適量，加水溶解后，在90℃四、檢測(cè)限●

信噪比的三倍——純屬“紙上談兵”，實(shí)際測(cè)定中根本用不上。

●

是相對(duì)值，不是絕對(duì)值。是相對(duì)于供試品溶液濃度的多少分之一而言，一般至少要在5000倍以上。16四、檢測(cè)限●信噪比的三倍——純屬“紙上談兵”，實(shí)際測(cè)有關(guān)物質(zhì)、含量與自身對(duì)照三者濃度的關(guān)系17有關(guān)物質(zhì)、含量與自身對(duì)照三者濃度的關(guān)系17積分參數(shù)的設(shè)定●積分參數(shù)的設(shè)定是非常重要的。由斜率(Slope)、峰寬(Width)、最小峰面積(MinArea)組成?！癫捎米陨韺?duì)照法時(shí)，對(duì)照溶液與供試品溶液必須在同一斜率、峰寬下進(jìn)行積分計(jì)算?！窆┰嚻啡芤鹤钚》迕娣e的設(shè)定將直接導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果。設(shè)定得太小，會(huì)導(dǎo)致很多小峰甚至是基線漂移的小峰均被積分出作為雜質(zhì)峰，從而導(dǎo)致雜質(zhì)峰面積增加，易判斷為不合格；如設(shè)定得過(guò)大，又將反映不出雜質(zhì)情況。18積分參數(shù)的設(shè)定18方法學(xué)認(rèn)證中的耐受性試驗(yàn)

是指更換試驗(yàn)因素，如不同人員、不同儀器，不同色譜柱型號(hào)、廠家，不同試劑等因素。這一點(diǎn)才是真正至關(guān)重要的！認(rèn)證時(shí)不可能做到這一點(diǎn)，出現(xiàn)問(wèn)題時(shí)往往要考慮到。19方法學(xué)認(rèn)證中的耐受性試驗(yàn)19方法學(xué)認(rèn)證中溶液穩(wěn)定性的全面判定不能單從主成分入手！還要注意所有組分的百分比變化，絕對(duì)值變化！20方法學(xué)認(rèn)證中溶液穩(wěn)定性的全面判定20雜質(zhì)-1（為已知雜質(zhì)）青蒿琥酯雜質(zhì)-2雜質(zhì)-3新雜質(zhì)時(shí)間(h)峰面積百分比峰面積百分比峰面積百分比峰面積百分比均未檢出0148110.14%1036960099.26%575110.55%50320.05%0.5360280.35%1014652598.89%557860.54%223310.22%1595200.57%1038238898.58%580980.55%317170.30%1.5689800.66%1034454198.45%595210.57%338980.32%2789480.75%1036038698.33%591720.56%380650.36%3917080.86%1043288898.16%591850.56%4500020.42%RSD0.96％21雜質(zhì)-1（為已知雜質(zhì)）青蒿琥酯雜質(zhì)-2雜質(zhì)-3新雜質(zhì)時(shí)流速、柱溫與溶劑的選擇●在測(cè)定時(shí)通常調(diào)節(jié)流速使主成分保留時(shí)間稍長(zhǎng)些，且使主成分峰不拖尾即可。●柱溫對(duì)分離效果的影響雖有一定的影響，但不甚顯著，如有柱溫箱，通常設(shè)定不超過(guò)35℃?！袢軇┑倪x擇應(yīng)測(cè)定樣品溶液在該溶劑中的穩(wěn)定性來(lái)衡量，盡量勿選擇揮發(fā)性強(qiáng)的溶劑；同時(shí)應(yīng)保證對(duì)照溶液的主成分峰面積精密度良好。22流速、柱溫與溶劑的選擇22質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中制訂有關(guān)物質(zhì)的原則●采用雜質(zhì)對(duì)照品法、用于降解產(chǎn)物的準(zhǔn)確測(cè)定，如氫氯噻嗪、對(duì)乙酰氨基酚等。●采用強(qiáng)破壞試驗(yàn)破壞出雜質(zhì)。如中國(guó)藥典中的氧氟沙星所有品種，均在HPLC法的色譜條件下擬定了：取供試品溶液，置紫外燈下（254nm）照射4小時(shí)以上，使產(chǎn)生的緊鄰主峰前的雜質(zhì)峰與主峰的分離度應(yīng)符合規(guī)定?！癫徊捎萌魏畏绞健?3質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中制訂有關(guān)物質(zhì)的原則23典型強(qiáng)破壞試驗(yàn)圖譜24典型強(qiáng)破壞試驗(yàn)圖譜24方法學(xué)驗(yàn)證中各項(xiàng)指標(biāo)的深度剖析謝沐風(fēng)上海市藥品檢驗(yàn)所xiemufeng@25方法學(xué)驗(yàn)證中各項(xiàng)指標(biāo)的深度剖析謝沐風(fēng)上海市藥品檢驗(yàn)所1一、線性試驗(yàn)

主成分含量測(cè)定以測(cè)定濃度為100%，50%~120%之間選取5個(gè)點(diǎn)即可。

溶出（釋放）度測(cè)定以釋放量的10%～120%間選取5個(gè)點(diǎn)即可。

雜質(zhì)含量用雜質(zhì)對(duì)照品準(zhǔn)確測(cè)定以雜質(zhì)限度為100%，50%~120%之間選取5個(gè)點(diǎn)即可。26一、線性試驗(yàn)主成分含量測(cè)定以測(cè)定濃度為1測(cè)定結(jié)果：

1）闡述如何看待截距和斜率、如何應(yīng)用。

2）誤差在哪里，應(yīng)用時(shí)的注意事項(xiàng)。

3）為什么沒(méi)有不成線性的？通常C、H、O、N結(jié)構(gòu)，紫外監(jiān)測(cè)器決定。

個(gè)別化學(xué)鍵所致。梯度洗脫時(shí)，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)不成線性。

4）都成線性、為何還要做？最小二乘法的原理知曉。27測(cè)定結(jié)果：

1）闡述如何看待截距和斜率、如何應(yīng)用。

2）誤差唑來(lái)磷酸結(jié)構(gòu)式28唑來(lái)磷酸結(jié)構(gòu)式4引申使用：

1）有關(guān)物質(zhì)測(cè)定歸一化法和自身對(duì)照法的相互妙用。

2）緩釋制劑溶出度測(cè)定，對(duì)照品濃度設(shè)定為中間濃度。舉例說(shuō)明。

3）回收率試驗(yàn)為何做80%~120%即可？亦及樣品濃度與對(duì)照品濃度接近到何等程度的理解。

4）國(guó)內(nèi)只注重相關(guān)系數(shù)，不注重截距。29引申使用：

1）有關(guān)物質(zhì)測(cè)定歸一化法和自身對(duì)照法的相互妙二、精密度試驗(yàn)

重復(fù)性試驗(yàn)：連續(xù)進(jìn)樣6次。

中間精密度試驗(yàn)和重現(xiàn)性試驗(yàn)通過(guò)“耐用性試驗(yàn)中的溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)”來(lái)體現(xiàn)。

濃度極低時(shí)才會(huì)不理想，加大進(jìn)樣量。

色譜峰形極為重要，對(duì)稱性、柱效等參數(shù)。加大柱溫、增加流動(dòng)相中有機(jī)相比例，使被測(cè)物質(zhì)峰盡快出峰。30二、精密度試驗(yàn)重復(fù)性試驗(yàn)：連續(xù)進(jìn)樣6次。

中三、準(zhǔn)確度試驗(yàn)用回收率來(lái)衡量

作法：在80%~120%間選擇3點(diǎn)或5點(diǎn)，原因是由外標(biāo)一點(diǎn)法決定的。

已知雜質(zhì)、且有雜質(zhì)對(duì)照品的，可采用加入法，即加樣回收率來(lái)評(píng)價(jià)。

一般情況下，只要空白輔料無(wú)干擾，回收率均是良好的！31三、準(zhǔn)確度試驗(yàn)用回收率來(lái)衡量作法：在80四、專屬性有關(guān)物質(zhì)為主，其他檢測(cè)項(xiàng)目（含量）基本上均參照有關(guān)物質(zhì)。

有關(guān)物質(zhì)的驗(yàn)證，采用中間體和降解產(chǎn)物（確認(rèn)結(jié)構(gòu)后人工合成）來(lái)驗(yàn)證與主成分的分離。

32四、專屬性有關(guān)物質(zhì)為主，其他檢測(cè)項(xiàng)目（含量）系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的配制方法：

在100％濃度的主成分溶液中加入1%濃度的雜質(zhì)對(duì)照品，以模擬樣品中有可能存在的狀態(tài)。

介紹配制方法

——先配制雜質(zhì)貯備液，再用供試品溶液（或濃的對(duì)照品溶液）來(lái)稀釋，簡(jiǎn)便、易行！33系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的配制方法：

在100％濃度的專屬性試驗(yàn)驗(yàn)證圖譜34專屬性試驗(yàn)驗(yàn)證圖譜10

存在問(wèn)題——配制相同濃度，測(cè)定樣品時(shí)，主成分峰驟然加大，將雜質(zhì)峰覆蓋。

強(qiáng)破壞試驗(yàn)的目的：

驗(yàn)證藥品在遭遇了極端的氣候環(huán)境條件下產(chǎn)生的雜質(zhì)，在所建立的色譜條件下是否能夠分離、測(cè)定。35存在問(wèn)題——配制相同濃度，測(cè)定樣品時(shí)，主成分峰驟●檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

涉及到各被檢測(cè)物質(zhì)在該波長(zhǎng)下的響應(yīng)因子是否相同，即所謂重量校正因子的問(wèn)題。（f=A雜質(zhì)/A被測(cè)成分）

選取主成分與各雜質(zhì)具有相同紫外吸收的波長(zhǎng)（f=1.0）。

選取各雜質(zhì)紫外吸收大于主成分紫外吸收的波長(zhǎng)（f>1.0），這樣可更加嚴(yán)格控制雜質(zhì)的限度。

如選取各雜質(zhì)紫外吸收小于主成分紫外吸收的波長(zhǎng)，應(yīng)必須加入重量校正因子（f<1.0），否則將得到錯(cuò)誤的判斷。36●檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

涉及到各被檢測(cè)物質(zhì)在該波長(zhǎng)下的介紹該項(xiàng)檢測(cè)的由來(lái)和歷史背景

要看主峰里是否有雜質(zhì)，如何判斷？但需注意DAD檢測(cè)器的局限性，介紹“土辦法”！

結(jié)果：目前從來(lái)沒(méi)有推翻現(xiàn)行色譜條件的。意義在哪里。如何應(yīng)用，拿到只是“走形式”？37介紹該項(xiàng)檢測(cè)的由來(lái)和歷史背景

要看主峰里是最小峰面積的設(shè)定

●

其設(shè)定，不是絕對(duì)值，而是相對(duì)值。

●英國(guó)藥典中有明確的說(shuō)明：凡有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)采用HPLC法測(cè)定時(shí)，均規(guī)定舍棄對(duì)照溶液主峰面積幾分之幾的峰面積。普通樣品測(cè)定時(shí)，通常為1/10~1/20（即相當(dāng)于樣品測(cè)定濃度的0.1%~0.05%）。如規(guī)定雜質(zhì)限度為1.0%，對(duì)照溶液峰面積為10000，那么，最小峰面積可考慮設(shè)定為1000~500左右。新藥穩(wěn)定性考核時(shí)，可設(shè)定到0.01%的最小峰面積。

●原料藥銷售與購(gòu)買的合同中，為確保雙方達(dá)成一致意見(jiàn)，此點(diǎn)應(yīng)予以重視。38最小峰面積的設(shè)定

●其設(shè)定，不是絕對(duì)值，而是相對(duì)值。

●強(qiáng)力破壞試驗(yàn)

●水破壞取原料適量，加水溶解后，在90℃放置24小時(shí)。

●氧化破壞取原料適量，用5%過(guò)氧化氫溶液溶解后，在90℃放置24小時(shí)。

●強(qiáng)堿破壞取原料適量，用1mol/L氫氧化鈉溶液溶解后，在90℃放置24小時(shí)。

●強(qiáng)酸破壞取原料適量，加1mol/L鹽酸溶液溶解后，在90℃放置24小時(shí)。

●高溫破壞取原料適量，依據(jù)各自品種的熔點(diǎn)不同，在高溫下破壞至外觀性狀改變

●強(qiáng)光破壞取原料適量，置紫外燈下照射48小時(shí)。39強(qiáng)力破壞試驗(yàn)

●水破壞取原料適量，加水溶解后，在90℃四、檢測(cè)限●

信噪比的三倍——純屬“紙上談兵”，實(shí)際測(cè)定中根本用不上。

●

是相對(duì)值，不是絕對(duì)值。是相對(duì)于供試品溶液濃度的多少分之一而言，一般至少要在5000倍以上。40四、檢測(cè)限●信噪比的三倍——純屬“紙上談兵”，實(shí)際測(cè)有關(guān)物質(zhì)、含量與自身對(duì)照三者濃度的關(guān)系41有關(guān)物質(zhì)、含量與自身對(duì)照三者濃度的關(guān)系17積分參數(shù)的設(shè)定●積分參數(shù)的設(shè)定是非常重要的。由斜率(Slope)、峰寬(Width)、最小峰面積(MinArea)組成。●采用自身對(duì)照法時(shí)，對(duì)照溶液與供試品溶液必須在同一斜率、峰寬下進(jìn)行積分計(jì)算。●供試品溶液最小峰面積的設(shè)定將直接導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果。設(shè)定得太小，會(huì)導(dǎo)致很多小峰甚至是基線漂移的小峰均被積分出作為雜質(zhì)峰，從而導(dǎo)致雜質(zhì)峰面積增加，易判斷為不合格；如設(shè)定得過(guò)大，又將反映不出雜質(zhì)情況。42積分參數(shù)的設(shè)定18方法學(xué)認(rèn)證中的耐受性試驗(yàn)

是指更換試驗(yàn)因素，如不同人員、不同儀器，不同色譜柱型號(hào)、廠家，不同試劑等因素。這一點(diǎn)才是真正至關(guān)重要的！認(rèn)證時(shí)不可能做到這一點(diǎn)，出現(xiàn)問(wèn)題時(shí)往往要考慮到。43方法學(xué)認(rèn)證中的耐受性試驗(yàn)19方法學(xué)認(rèn)證中溶液穩(wěn)定性的全面判定不能單從主成分入手！還要注意所有組分的百分比變化，絕對(duì)值變化！44方法學(xué)認(rèn)證中溶液穩(wěn)定性的全面判定20雜質(zhì)-1（為已知雜質(zhì)）青蒿琥酯雜質(zhì)-2雜質(zhì)-3新雜質(zhì)時(shí)間(h)峰面積百分比峰面積百分比峰面積百分比峰面積