關于基因工程的常規(guī)技術第一頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日1第一節(jié)凝膠電泳技術

什么是電泳技術？電泳法，是指帶電荷的供試品（蛋白質、核苷酸等）在惰性支持介質（如紙、醋酸纖維素、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等）中，于電場的作用下，向其對應的電極方向按各自的速度進行泳動，使組分分離成狹窄的區(qū)帶，用適宜的檢測方法記錄其電泳區(qū)帶圖譜或計算其百分含量的方法。第二頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日2特點：1.可以制成非常均勻的凝膠，帶電質點在凝膠的孔中泳動。2.電泳操作方法簡便，電泳速度快3.分辨率高，重復性好，電泳圖譜清晰。

瓊脂糖半乳糖及其衍生物構成的中性物質，不帶電荷本節(jié)主要介紹瓊脂糖凝膠電泳技術。瓊脂糖與瓊脂有區(qū)別么？第三頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日3

瓊脂糖鏈依分子內和分子間氫鍵及其它力的作用使其互相盤繞形成繩狀瓊脂糖束，構成大網(wǎng)孔型凝膠。D-半乳糖3，6-脫水-L-半乳糖第四頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日4第五頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日5瓊脂糖凝膠電泳特點第六頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日6瓊脂糖凝膠的配置1.

根據(jù)電泳需要，配置合適濃度的電泳及制膠緩沖液。一般為1×TAE或0.5×TBE。

注意：用于電泳的緩沖液和用于制膠的緩沖液必須是相同的。2.

根據(jù)制膠量及凝膠濃度，在加有一定量的電泳緩沖液的三角錐瓶中，加入準確稱量的瓊脂糖粉。注意：總液體量不宜超過三角錐瓶的50%容量。3.在微波爐中加熱溶解瓊脂糖

注意：必須保證瓊脂糖充分完全溶解，否則，會造成電泳圖像模糊不清。加熱時如膠液劇烈沸騰發(fā)泡，停止加熱。微波爐中加熱時間不宜過長。第七頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日7瓊脂糖凝膠的配置3.

使溶液冷卻至60℃左右，如需要可在此時加入溴化乙錠(EB)溶液使其終濃度為0.5ug/ml，并充分混勻——不提倡使用。

注意：溴化乙錠是一種致癌物質。使用含有溴化乙錠的溶液時，請戴用手套。溴化乙錠在可見光下會分解。5.將瓊脂糖溶液倒入制膠模中，然后在適當位置處插上梳子。凝膠厚度一般在3－5mm之間。

注意：不要產(chǎn)生氣泡，溶液溫度太高(>60℃)，會使得水分過分蒸發(fā)，改變凝膠離子濃度，影響電泳效果。6.在室溫下使膠凝固（大約30分鐘），然后放置于電泳槽中進行電泳。

注意：凝膠不立即使用時，用保鮮膜將凝膠包好在4℃下保存，或者放在制膠的緩沖液中，一般可保存2～5天。第八頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日8瓊脂糖凝膠緩沖液有幾種緩沖液適用于天然雙鏈DNA的電泳Tris-乙酸鹽和EDTA緩沖液（pH8.0,TAE，也稱為E緩沖液）Tris-硼酸鹽緩沖液(TBE)Tris-磷酸鹽緩沖液(TPE)第九頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日9瓊脂糖凝膠緩沖液第十頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日10瓊脂糖凝膠緩沖液TBE可以使用10次左右，而TAE用2~3次就要更換。電泳緩沖液多次使用后，離子強度降低，pH值上升，緩沖性能下降，可能使DNA條帶模糊或不規(guī)則DNA帶遷移。電泳緩沖液剛好沒過凝膠1mm為好，太多則電流加大，凝膠發(fā)熱。第十一頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日11瓊脂糖凝膠載樣緩沖液載樣緩沖液是上樣時與樣品一起加入泳道的。載樣緩沖液有三個作用：增加樣品密度以保證DNA沉入加樣孔內；使樣品帶有顏色便于上樣操作；其中的染料在電場中以可以預測的泳動速率向陽極遷移。上樣緩沖液有幾種，但基本都包括溴酚藍和二甲苯氰FF。第十二頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日12瓊脂糖凝膠載樣緩沖液溴酚藍在瓊脂糖凝膠中遷移速率是二甲苯氰FF的2.2倍，這一特性與瓊脂糖凝膠的濃度無關；在0.5×TBE瓊脂糖凝膠電泳中溴酚藍的速率約與長約300bp的線性雙鏈DNA相同，而二甲苯氰FF約與長4kb的DNA相同。在0.5%-1.4%濃度的瓊脂糖凝膠中基本不會變化。第十三頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日13瓊脂糖凝膠載樣緩沖液第十四頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日14影響電泳遷移率的因素DNA分子的大小1凝膠的濃度2DNA的構象3使用的電壓4瓊脂糖的種類5電泳緩沖液6嵌入染料的存在7第十五頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日15影響電泳遷移率的因素DNA分子的大小1凝膠的濃度2DNA的構象3使用的電壓4瓊脂糖的種類5電泳緩沖液6嵌入染料的存在7DNA分子大小遷移速率U與logN成反比（N為堿基對數(shù)目）。分子越大，摩擦阻力越大，同時大分子通過凝膠孔徑的效率也低于較小的分子，所以分子大的遷移慢。等量的空間結構，緊密的電泳快（超螺旋>線性DNA）一般來說，分子帶的電荷量越大、直徑越小、形狀越接近球形，則其電泳遷移速度越快。第十六頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日16影響電泳遷移率的因素DNA分子的大小1凝膠的濃度2DNA的構象3使用的電壓4瓊脂糖的種類5電泳緩沖液6嵌入染料的存在7簡言之，濃度越大，分子孔徑就越小，DNA遷移速率就越低，反之遷移速率就大。另外，濃度也跟凝膠的分辨率有關，濃度越大，分辨率越高，但分離的ＤＮＡ片段就越小。第十七頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日17瓊脂糖凝膠的濃度第十八頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日18影響電泳遷移率的因素DNA分子的大小1凝膠的濃度2DNA的構象3使用的電壓4瓊脂糖的種類5電泳緩沖液6嵌入染料的存在7一般遷移速率超螺旋環(huán)狀>線狀DNA>單鏈開環(huán)。第十九頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日19影響電泳遷移率的因素DNA分子的大小1凝膠的濃度2DNA的構象3使用的電壓4瓊脂糖的種類5電泳緩沖液6嵌入染料的存在7

低電壓時，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。使分辨效果好，凝膠上所加電壓不應超過5-8V/cm第二十頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日20影響電泳遷移率的因素DNA分子的大小1凝膠的濃度2DNA的構象3使用的電壓4瓊脂糖的種類5電泳緩沖液6嵌入染料的存在7

包括標準瓊脂糖和低熔點瓊脂糖以及正在研制的介于二者之間的瓊脂糖。其分辨率等各有不同。第二十一頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日21瓊脂糖凝膠的濃度第二十二頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日22影響電泳遷移率的因素DNA分子的大小1凝膠的濃度2DNA的構象3使用的電壓4瓊脂糖的種類5電泳緩沖液6嵌入染料的存在7溶液pH值距離其等電點愈遠，其所帶凈電荷量就越大，電泳的速度也就越大，尤其對于蛋白質等兩性分子，緩沖液pH還會影響到其電泳方向;溶液的離子強度過低，會使電導率降低，DNA不是全然不動就是遷移極慢；而離子過強時，電導率上升，會產(chǎn)生大量熱能，使凝膠變化甚至熔化，也會使DNA變性。第二十三頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日23影響電泳遷移率的因素DNA分子的大小1凝膠的濃度2DNA的構象3使用的電壓4瓊脂糖的種類5電泳緩沖液6嵌入染料的存在7染色劑溴化乙錠插入雙鏈DNA造成其負電荷減少、剛性和長度增加，因此，線性DNA-染料復合物在凝膠中的遷移率約降低15%。第二十四頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日24DNA分子的遷移速度與其分子質量的對數(shù)值成反比關系。

在電場的作用下，帶有負電荷的DNA或RNA核苷酸鏈，依靠無反應活性的穩(wěn)定的介質（瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠）和緩沖液，以一定的遷移率從負極移向正極。根據(jù)核酸分子大小不同、構型或形狀的差異，可以通過電泳將其混合物中的不同成分彼此分開。

瓊脂糖凝膠電泳基本原理第二十五頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日25

當用EB對DNA樣品染色時，加入的EB就插入DNA分子中形成熒光結合物，熒光的強度與DNA含量成正比，如果用DNA片段的標準品作電泳對照，就可以估計出待測樣品的分子量大小和濃度。第二十六頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日26DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測

+-儀器

電泳儀、電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)、移液槍；藥品Agarose、TAEbuffer、EB（溴化乙錠）上樣緩沖液（6X）0.25%溴酚藍（指示100-200bp的帶）、0.25%二甲苯青（指示800-100bp的帶）、40%蔗糖；水溶液4℃保存。第二十七頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日27玻璃片第二十八頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日28第二十九頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日29預染色的標本第三十頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日30第三十一頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日31第三十二頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日32第三十三頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日33第二節(jié)分子雜交技術

所依據(jù)的原理是，帶有互補的特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA，當它們混合在一起時，其相應的同源區(qū)段將會退火形成雙鏈的結構。

核酸雜交技術主要有Southern雜交、Northern雜交和菌落原位雜交等。第三十四頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日34一、探針與探針標記雜交的主要目的是為了檢測出同源DNA序列，而為了達到這一目的，必需要有標記的探針。帶有能檢測的標記物的DNA或RNA叫探針。使DNA或RNA帶有可檢測的標記物的過程叫探針標記。第三十五頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日351.切口平移標記用一定濃度的DNaseI在雙鏈DNA的一條鏈的有限位置上打開切口。利用DNA聚合酶I的5’→3’的核酸外切酶活性將DNA一條鏈上的核苷酸一個一個的切除，同時暴露出另一條單鏈DNA。以這條單鏈DNA為模板，利用DNA聚合酶I的5’→3’的DNA聚合功能把一個一個帶有標記的dNTP合成上去。第三十六頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日3637

大腸桿菌聚合酶I的應用示例缺口轉移制備探針PolI+Mg2++［α－32P］

dNTPs第三十七頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日372.隨機引物標記能與任何DNA模板的多個位點配對互補的多個不均一序列寡聚核苷酸DNA片段叫隨機引物。DNA聚合酶Klenow大片段能在隨機引物的引導下以帶有標記的dNTP為原料合成新的與模板DNA互補的探針。第三十八頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日38二、Southern雜交

根據(jù)毛細管作用的原理，使在電泳凝膠中分離的DNA片段轉移并結合在適當?shù)臑V膜上，然后通過同標記的單鏈DNA或RNA探針的雜交作用檢測這些被轉移的DNA片段，這種實驗方法叫做DNA印跡雜交技術。由于它是由E.Southern于1975年首先設計出來的，故又叫SouthernDNA印跡轉移技術。第三十九頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日39（a）（b）（c）（d）（e）基因組DNADNA限制片段硝酸纖維素濾膜同探針同源雜交的基因DNA片段X光底片雜交步驟：1.酶切2.電泳(變性）3.轉膜(注意DNA要小于2kb）4.封閉（預雜交）5.雜交6.顯影第四十頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日40核酸雜交常用幾種膜的性能比較第四十一頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日41

SouthernDNA印跡雜交之X光顯像圖片

水稻（OryzasativaL.)的葉綠體DNA分別用核酸內切限制酶BglⅡ(A-C)、BamHⅠ（D-F）、EcoRⅠ（G-I）、和HindⅢ（J-L）消化，加樣在含有EB染料的1%的瓊脂糖凝膠電泳中作電泳分離，然后同32P標記的玉米psbA探針作Southern雜交。X光底片中顯現(xiàn)的陽性條帶，表明含有水稻的psbA基因序列。第四十二頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日42三、Northern雜交1979年，等人發(fā)展而來，是將RNA分子從電泳凝膠轉移到硝酸纖維素濾膜或其他化學修飾的活性濾紙上，進行核酸雜交的一種實驗方法。由于這種方法與Southern印跡雜交技術十分類似，所以叫做Northern印跡技術（Northernblotting）。第四十三頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日43Southern雜交和Northern雜交的主要差別：1.對象不同（DNA/RNA）2.DNA在凝膠電泳分離后，用堿處理變性，形成單鏈。

RNA一般是進行變性電泳，在分離RNA的同時消除二級結構。

RNA變性電泳方法主要有甲醛變性電泳、羧甲基變性電泳和乙二醛變性電泳三種。第四十四頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日44四、Western雜交Westernblotting是用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質，然后將蛋白質從電泳凝膠中轉移到硝酸纖維素膜或其它支持物上，然后同放射性同位素標記的特定蛋白質之抗體進行反應，這種技術廣泛用于基因在蛋白質水平上的表達研究。第四十五頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日45原理

聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(Acr)和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺(Bis)在加速劑N，N，N，N—四甲基乙二胺(簡稱TEMED)和催化劑過硫酸銨(簡稱AP)作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結構的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)。第四十六頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日46原理而SDS僅根據(jù)蛋白質亞基分子量的不同就可以分開蛋白質。該技術最初由shapiro于1967年建立，他們發(fā)現(xiàn)在樣品介質和丙烯酰胺凝膠中加入離子去污劑和強還原劑后，蛋白質亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大?。梢院雎噪姾梢蛩兀?。第四十七頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日47十二烷基硫酸鈉（sodiumdodecylsulfate，簡稱SDS）是一種陰離子去污劑，它能破壞蛋白質分子之間以及與其他物質分子之間的非共價鍵，使蛋白質變性而改變原有的空間構象。特別是在強還原劑，如巰基乙醇存在下，由于蛋白質分子內的二硫鍵被還原劑打開，不易再氧化，這就保證了蛋白質分子與SDS充分結合.蛋白質-SDS復合物在水溶液中的形狀，近似于雪茄煙形的長橢圓棒。不同蛋白質的SDS復合物的短軸長度都一樣，約為1.8nm，而長軸則隨蛋白質的分子量成正比變化。這樣的蛋白質-SDS復合物在凝膠中的遷移率，不再受蛋白質原有電荷和形狀的影響，而只是橢圓棒的長度，也就是蛋白質分子量的函數(shù)。帶負電荷的蛋白質-SDS復合物由于結合了大量的SDS，使蛋白質喪失了原有的電荷狀態(tài)，形成了僅保持原有分子大小為特征的負離子團塊，從而降低或消除了各種蛋白質分子之間天然的電荷差異。原理第四十八頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日48實驗原理PAGE根據(jù)其有無濃縮效應，分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類，連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷和分子篩效應。不連續(xù)系統(tǒng)中由于緩沖液離子成分，pH，凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應，分子篩效應，還具有濃縮效應，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳。第四十九頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日49各部分凝膠配制第五十頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日50

實驗過程

1.將玻璃板用蒸餾水洗凈晾干,準備2個干凈的錐形瓶.

2.把玻璃板在灌膠支架上固定好.

※固定玻璃板時，兩邊用力一定要均勻，防止夾壞玻璃板.

3.按比例配好分離膠,用移液管快速加入,大約5厘米左右,之后加少許蒸餾水,靜置40分鐘.

※凝膠配制過程要迅速,催化劑TEMED要在注膠前再加入,否則凝結無法注膠.注膠過程最好一次性完成,避免產(chǎn)生氣泡.

第五十一頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日51

實驗過程.

※水封的目的是為了使分離膠上延平直，并排除氣泡

※凝膠聚合好的標志是膠與水層之間形成清晰的界面.

4.倒出水并用濾紙把剩余的水分吸干,按比例配好濃縮膠,連續(xù)平穩(wěn)加入濃縮膠至離邊緣5mm處,迅速插入樣梳,靜置40分鐘.

※樣梳需一次平穩(wěn)插入,梳口處不得有氣泡,梳底需水平.

第五十二頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日52實驗過程5.拔出樣梳后,在上槽內加入緩沖液,沒過鋸齒時可拆去

底端的瓊脂糖.

※要使鋸齒孔內的氣泡全部排出,否則會影響加樣效果.

6、加樣三個。（1）取10μl標準蛋白溶解液于EP管內，再加入10μl2倍樣品緩沖液，上樣量為20μl。

（2）取10μl樣品1溶液，再加入10μl2倍樣品緩沖液，上樣量分別為5μl和10μl。

7.用微量注射器距槽底三分之一處進樣,加樣前,樣品在

沸水中加熱3分鐘，去掉亞穩(wěn)態(tài)聚合。

※注射器不可過低,以防刺破膠體,也不可過高,在樣下

沉時會發(fā)生擴散.

※為避免邊緣效應,最好選用中部的孔注樣.

第五十三頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日53實驗過程8.電泳槽中加入緩沖液，接通電源，進行電泳，開始電流恒定在10mA，當進入分離膠后改為20mA，溴酚藍距凝膠邊緣約5mm時，停止電泳。

9.凝膠板剝離與染色：電泳結束后，撬開玻璃板，將凝膠板做好標記后放在大培養(yǎng)皿內，加入染色液，染色1小時左右。

10.脫色：染色后的凝膠板用蒸餾水漂洗數(shù)次，再用脫色液脫色，直到蛋白質區(qū)帶清晰。

※剝膠時要小心,保持膠完好無損,染色要充分.

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11.實驗結果分析。第五十四頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日54第五十五頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日55五、菌落原位雜交

也叫原位雜交，是指把菌落或噬菌斑轉移到硝酸纖維素膜上，使溶菌的DNA同濾膜原位結合，帶有DNA的濾膜烘干后，與放射性同位素標記特異的DNA或RNA探針雜交。是直接菌落或噬菌斑為對象來檢測重組子的技術。第五十六頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日56檢測重組體克隆的菌落雜交技術第五十七頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日57第三節(jié)、PCR技術第五十八頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日58PCR技術的創(chuàng)建KaryB.Mullis（穆利斯（美））Khorana(1971)等提出在體外經(jīng)DNA變性,與適當引物雜交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的設想。

1983年,Mullis發(fā)明了PCR技術,使Khorana的設想得到實現(xiàn)。

1988年Saiki等將耐熱DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技術

1989年美國《Science》雜志列PCR為十余項重大科學發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學獎。第五十九頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日59一、PCR技術的基本成分

PCR的成分包括：待擴增的模板、引物、DNA聚合酶、四種脫氧核苷酸的混合物以及反應緩沖液。模板是含有待擴增序列的DNA或從mRNA反轉錄來的cDNA。第六十頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日60Taq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)溫度(℃)405060708090100100806040201988年Saiki等將耐熱DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技術第六十一頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日61TaqDNA聚合酶CharacteristicsofTaqPolymerase

第六十二頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日62PCR的引物

是指與待擴增的靶DNA區(qū)段兩端序列互補的人工合成的寡核苷酸片斷。第六十三頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日63引物的設計原則：1.引物堿基G＋C含量以45%－55%為宜。

2.其長度通常在15~30個核苷酸之間。

3.Tm值應高于55℃。

引物的另一個重要參數(shù)是熔解溫度（Tm）。這是當50％的引物和互補序列表現(xiàn)為雙鏈DNA分子時的溫度.Tm對于設定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時還要足夠高，以減少非特異性結合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設定比引物的Tm低5℃。2個引物要有近似的Tm值，以免相差太大，引起非特異性擴增；一般退火溫度為最高Tm值的引物溫度減5℃.第六十四頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日644.PCR擴增的長度一般：<2kb。5.引物3’端堿基要求嚴格配對。Taq酶在3′末端錯配時延伸效率是不一樣的，延伸效率為T>G＝C>A。即當引物3′末端為A時，即使有錯配堿基也最不易延伸，所以引物設計時可將3′末端設計為A，以提高復制精確性。另一種理論是3′末端應設計為G或C，因為G和C的氫鍵多于A與T，能更好地與模板結合開始DNA合成，當然對錯配延伸效率方面就不能苛求了。總而言之，引物的3′末端不要考慮使用T。

6.盡量減少自身配對。

7.避免兩條引物互補。

8.引物要特異。

9.可以在引物的5’端加上合適的酶切位點。一般引物自身配對形成莖環(huán)結構，莖的堿基對數(shù)不大于3，兩條引物間配對堿基數(shù)小于5個。第六十五頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日65引物的設計可以參照：兩分鐘StepByStep學會引物設計軟件

Primerpremier5.0/oligo軟件

核酸基因技術討論版/生物信息學討論版/PCR技術討論版primer/primer3_www.cgi

引物設計網(wǎng)址：第六十六頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日66反應條件1．PCR緩沖液常用的1×PCR緩沖液為10mmol／LTris-HClpH8.3(常溫)，50mmol／LKCl，1.5mmol／LMgCl2。由試劑公司與Taq酶一起提供。

(1)Mg2+離子濃度：Mg2+離子濃度對PCR反應影響很大，因為[Mg2+]與引物-模板及產(chǎn)物的解鏈溫度、產(chǎn)物的特異性、引物二聚體的生成、產(chǎn)物的忠實性、酶活力、產(chǎn)物的產(chǎn)量等諸多因素有關。Mg2+一般使用濃度為0.5～2.5mmol／L，必要時可以0.5mmol／L梯度間隔做Mg2+最適濃度試驗。第六十七頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日67(2)dNTP：常用dNTP濃度為20μmol／L(可用范圍為20～200μmol／L)。dNTP的用量與PCR產(chǎn)量及產(chǎn)物忠實性有關，dNTP量過少時合成的產(chǎn)物減少。(3)K+離子濃度：PCR反應中K+離子的作用是促進Taq酶活力與促進引物退火，一般使用濃度是50mmol／L，但當K+離子濃度高于50mmol／L時會抑制Taq酶活力。第六十八頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日682．模板PCR模板可以是DNA或RNA，RNA需反轉錄后再擴增。模板可以是基因組DNA或純化的質粒DNA，當然兩者的DNA量在PCR起始模板中相差很大。每個PCR反應中加入的模板數(shù)量可在102～105分子之間，必要時可低至50個分子，模板的量少時應酌情增加循環(huán)次數(shù)。小于100ng的哺乳動物細胞基因組DNA(相當于約104個細胞)，經(jīng)30個循環(huán)，10％的反應物應能夠在溴化乙錠染色的凝膠上看到一條主要產(chǎn)物帶。使用較大量的模板時，循環(huán)數(shù)可減少；如果模板量很少，可能需要增加至45個循環(huán)反應。第六十九頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日693．引物濃度常用引物濃度為0.1～0.5μmol／L。隨著引物濃度的降低，PCR反應的特異性提高但產(chǎn)物得率降低；隨著引物濃度的升高，情況正好相反。第七十頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日70二、PCR技術的原理和過程

947260？主要是為了保險起見，使模板DNA的二級結構充分打開。

有些化學修飾的熱啟動酶這一步時間還要長，目的是充分釋放酶活第七十一頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日71溫度（℃）時間（min）94726094℃變性（1min）60℃退火（1min）72℃延伸（1.5min）循環(huán)1循環(huán)2循環(huán)3PCR反應的溫度循環(huán)周期

PCR反應的每一個溫度循環(huán)周期都是由DNA變性、引物退火和反應延伸三個步驟完成的。圖中設定的反應參數(shù)是94℃變性1min，60℃退火1min，72℃延伸1.5min。如此周而復始，重復進行，直至擴增產(chǎn)物的數(shù)量滿足實驗需求為止。第七十二頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日72第七十三頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日73PCR擴增過程中片段增殖的計算第七十四頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日74PCR反應體系的確立WaterBuffer（10×）Mg++（25mM）dNTPs（10mM）Primer1（10uM）Primer2（10uM）Taq（5U/uL）Templets12.821.60.4110.2120uL反應體系中各成分的母液濃度及加入量PCR擴增程序舉例Tem.94℃94℃60℃72℃72℃Time00:08:0000:00:3000:00:4000:01:0000:07:00Cycles――30――第七十五頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日75經(jīng)典循環(huán)參數(shù)（500bp以內）94℃30s55℃45s72℃1min94℃5min×30次72℃5min42℃forever第七十六頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日76PCR擴增結果分析舉例M1234567MM,marker;1-2,PCRforCP4-EPSPSgene;3-4,PCRfor35SPromoter;5-6,PCRforlectingene;7,Negtivecontrol.第七十七頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日77PCR常見問題

無擴增產(chǎn)物

非特異性擴增

拖尾

假陽性第七十八頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日78PCR常見問題之一無擴增產(chǎn)物模板:含有抑制物，含量低Buffer對樣品不合適引物設計不當或者發(fā)生降解反應條件：退火溫度太高，延伸時間太短

原因對策純化模板或者使用試劑盒提取模板DNA或加大模板的用量更換Buffer或調整濃度重新設計引物（避免鏈間二聚體和鏈內二級結構）或者換一管新引物降低退火溫度、延長延伸時間現(xiàn)象：正對照有條帶，而樣品則無；第七十九頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日79PCR常見問題之二

非特異性擴增

現(xiàn)象：PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶與非特異性擴增帶。第八十頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日80PCR常見問題之二引物特異性差模板或引物濃度過高酶量過多Mg2+濃度偏高退火溫度偏低循環(huán)次數(shù)過多

原因對策重新設計引物或者使用巢式PCR適當降低模板或引物濃度適當減少酶量降低鎂離子濃度適當提高退火溫度或使用二階段溫度法減少循環(huán)次數(shù)

非特異性擴增第八十一頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日81PCR常見問題之三

拖尾

現(xiàn)象：產(chǎn)物在凝膠上呈Smear狀態(tài)。M12第八十二頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日82PCR常見問題之三模板不純Buffer不合適退火溫度偏低酶量過多dNTP、Mg2+濃度偏高循環(huán)次數(shù)過多

原因對策純化模板更換Buffer適當提高退火溫度適量用酶適當降低dNTP和鎂離子的濃度減少循環(huán)次數(shù)

拖尾第八十三頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日83PCR常見問題之四

假陽性（篩選轉基因、檢測基因表達情況)

原因：靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染

現(xiàn)象：空白對照出現(xiàn)目的擴增產(chǎn)物

對策：操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外；除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及加樣槍頭等均應一次性使用。各種試劑最好先進行分裝，然后低溫貯存。第八十四頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日84三、熒光定量PCR是通過熒光染料或熒光標記的特異性探針，對PCR產(chǎn)物進行標記跟蹤，實時在線監(jiān)控反應過程結合相應軟件可以對產(chǎn)物進行分析，計算待測樣品的初始模板量。熒光定量PCR儀是一種帶有激發(fā)光源和熒光信號檢測系統(tǒng)的PCR儀，通常配有電腦系統(tǒng)及相應的軟件。標記方法主要有：內插染料、雙標記探針、分子信標等。第八十五頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日85SYBRGREENI1、SYBRGreen法第八十六頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日86第八十七頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日87SYBRGreen熔解曲線分析

第八十八頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日882、TaqMan探針法

第八十九頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日89TaqMan作用機理

第九十頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日90Molecularbeacon？第九十一頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日91熒光定量PCR的優(yōu)點1.全封閉的PCR過程，無需跑膠。2.采用dUTP－UNG酶防污染，有效降低污染機會。原理：UNG酶的作用原理是選擇性水解斷裂含有dU的雙鏈或單鏈DNA中的尿嘧啶糖苷鍵，形成的有缺失堿基的DNA鏈，在堿性介質以及高溫下會進一步水解斷裂，從而被消除.UNG酶的最佳活性溫度為50℃，95℃滅活。作用：為保證PCR結果的準確性，要預防非特異性PCR擴增和污染。常用的措施是使用UNG酶(Uracil-N-Glycosylase)和Taq酶熱啟動。PCR反應最常見,最重要的污染物是PCR產(chǎn)物,防污染熱啟動PCR試劑盒以dUTP取代dTTP，所以PCR產(chǎn)物都是含有dU的DNA鏈。在PCR開始前增加50℃的保溫步驟，UNG酶即可將反應體系中已有的U-DNA污染物中的尿嘧啶堿基降解，并在隨后變性這步的條件下DNA鏈斷裂,消除由于污染DNA產(chǎn)生的擴增，從而保證擴增結果的特異性，準確性。同時UNG酶被滅活,不會再降解新擴增的產(chǎn)物U-DNA。第九十二頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日923.對樣品擴增的整個過程進行實時監(jiān)控。4.使用引物和熒光探針同時與模板特異性結合，提高了PCR反應的特異性。5.在樣品擴增反應的最佳階段進行數(shù)據(jù)采集，增加了定量的精確性。6.線性關系直接。7.結果分析更加快捷方便。熒光定量PCR的優(yōu)點第九十三頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日93第四節(jié)、生物芯片

美國《財富》雜志載文指出，在20世紀科技史上有兩件事影響深遠，一是微電子芯片，它是計算機和許多家電的心臟，它改變了我們的經(jīng)濟和文化生活，并已進入每一個家庭；另一件事就是生物芯片，它將改變生命科學的研究方式，革新醫(yī)學診斷和治療，極大地提高人口素質和健康水平。第九十四頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日94第四節(jié)、生物芯片生物芯片就是在一塊指甲大小的玻片、硅片、尼龍膜等材料上放上生物樣品，然后由一種儀器收集信號，用計算機分析數(shù)據(jù)結果。目前制備芯片的固相材料有玻片、硅片、金屬片、尼龍膜等。生物芯片主要分為基因芯片和蛋白芯片。第九十五頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日95一、基因芯片基因芯片技術是指將大量寡核苷酸或DNA探針（與核酸分子雜交相反，亦稱靶基因）按特定的排列方式固化在固相支持物表面，按堿基互補配對的原則，與標記的特異的單鏈DNA或RNA（待測樣品）分子雜交形成雙鏈，通過對雜交信號的檢測分析，即可得出樣品分子的數(shù)量和序列信息。由于基因芯片上固定的探針可以是cDNA、寡核苷酸或來自基因組的基因片段，且這些探針固化于芯片上形成基因探針陣列，故基因芯片又被稱為DNA芯片、DNA陣列、cDNA芯片、寡核苷酸陣列等。第九十六頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日96DNA芯片技術工作流程主要包括：芯片的制備、樣品的準備與標記、雜交、信號檢測和數(shù)據(jù)分析處理，其中最關鍵的是芯片的制備。DNA芯片基本應用可分為兩個主要方面：定量分析（主要指測序和突變檢測）與定性分析（主要指對基因表達的研究）。如：1.DNA序列測定

2.突變及多肽性分析

3.基因表達分析

4.基因組研究

5.基因診斷

6.藥物研究與開發(fā)第九十七頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日97基因芯片雜交檢測流程圖第九十八頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日98二、蛋白芯片

蛋白芯片是以蛋白質代替DNA作為檢測對象。其原理是將各種蛋白質有序的固定于某種介質的載體上成為檢測的芯片，然后用標記了有特定熒光物質的抗體與芯片作用，與芯片上的蛋白質相匹配的抗體將與其對應的蛋白質結合，在將未與芯片上的蛋白質互補的抗體洗去之后利用熒光掃描儀或激光共聚焦掃描技術，檢測芯片上各點的熒光強度，在通過計算機分析蛋白質之間的相互關系以及基因表達功能等。第九十九頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日99基因文庫的基本概念

從特定生物個體中分離的全部基因，這些基因以克隆的形式存在（人工構建）。根據(jù)構建方法的不同，基因文庫分為：基因組文庫（含有全部基因）

cDNA文庫（含有全部蛋白質編碼的結構基因）

第五節(jié)、基因文庫構建第一百頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日100一、基因組文庫基本步驟:1.分離基因組DNA2.DNA的斷裂物理剪切(包括吹吸、振蕩和超聲波）和限制性酶解

3.DNA片斷的分離與連接

4.包裝，轉染或者轉化第一百零一頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日101二、cDNA文庫的構建基本步驟：

1)mRNA分離、純化和分級分離

2)cDNA的合成

3)與載體的連接

4)轉化第一百零二頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日102RNA提取流程－－樣品前處理注意點

選擇新鮮血液，不得超過4小時選擇新鮮的幼嫩組織選擇處于生長旺盛的時期收集細胞選擇新鮮組織，生長旺盛的組織第一百零三頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日103可將新鮮血液先進行紅細胞裂解，得到的白細胞然后加入一定量的TRNzol，-70℃保存較長時間去掉培養(yǎng)基，加入一定量TRNzol-70℃保存較長時間推薦使用專門的RNA樣品儲存液進行儲存液氮或加入RNase抑制劑中保存，避免反復凍融RNA提取流程－－樣品前處理中如何保存樣本第一百零四頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日104所有RNA的提取過程中都有五個關鍵點，即①樣品細胞或組織的有效破碎；②有效地使核蛋白復合體變性；③對內源RNA酶的有效抑制；④有效地將RNA從DNA和蛋白混合物中分離；⑤對于多糖含量高的樣品還牽涉到多糖雜質的有效除去。但其中最關鍵的是抑制RNA酶活性第一百零五頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日105模板mRNA的質量直接影響到cDNA合成的效率。在提取過程中要嚴格防止RNA酶的污染,并設法抑制其活性,這是本實驗成敗的關鍵。所有的組織中均存在RNA酶,人的皮膚、手指、試劑、容器等均可能被污染，因此全部實驗過程中均需戴手套操作并經(jīng)常更換（使用一次性手套）。第一百零六頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日106所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2小時以上。凡是不能用高溫烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液處理。DEPC是RNA酶的化學修飾劑,它和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環(huán)反應而抑制酶活性。DEPC水溶液會致癌,因而使用時需小心。第一百零七頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日107RNA提取的通用方法

RNA提取的一般步驟RNA提取的一般步驟是：破碎組織→分離RNA→沉淀RNA→洗滌RNA→融解RNA→保存RNA.第一百零八頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日108破碎組織和滅活RNA酶可以同步進行，可以用鹽酸胍、硫氰酸胍、SDS、蛋白酶K等破碎組織加入β-ME可以抑制RNA酶活性。

分離RNA一半用酚、氯仿等有機溶劑，加入少量異戊醇，經(jīng)過此步，離心，RNA一般分布于上層，與蛋白層分開。

沉淀RNA一般用乙醇、3MNaAc（pH-5.2）或異丙醇。

洗滌RNA使用70％乙醇洗滌，有時，為避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗滌之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能過于干燥，否則不易溶解。

RNA提取的通用方法第一百零九頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日109二、cDNA克隆片段的獲得cDNA第一鏈的合成

第二鏈的合成雙鏈DNA末端的處理第一百一十頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日110mRNA1.cDNA第一鏈的合成

5‘ppp’5G

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G

AAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’5‘ppp’5G

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5’cDNA第一鏈引物退火逆轉錄酶dNTPs第一百一十一頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日1112.cDNA第二鏈的合成

煮沸NaOH自身引導法：獲得的雙鏈cDNA5’端會有幾對堿基缺失AAAAAAAAAAAAAA5‘ppp’5G

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3’KlenowdNTPsS1第一百一十二頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日1123)第二鏈cDNA的合成氫氧化鈉消化雜合雙鏈中的mRNA鏈

第一鏈cDNA的3'-末端就會形成一個發(fā)夾環(huán)

合成第二鏈cDNA

S1核酸酶消化連接處

自身引導法合成cDNA第二鏈第一百一十三頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日113DNApoldNTPsRNaesH置換合成法：獲得的雙鏈cDNA5’端也會有幾對堿基缺失5‘ppp’5G

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3’3’T4-DNAligase第一百一十四頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日114第一百一十五頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日115常用方法第一百一十六頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日116CH3CH3CH3CH3CH3CH3接頭加接頭第一百一十七頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日1173.雙鏈DNA末端的處理雙鏈平頭的cDNA通常可以使用下列三種方法克隆入載體中：

平頭末端直接與載體連接，但插入的片段無法回收

平頭兩端分別接同聚物尾和酶切位點，便于片段回收加裝人工接頭引入酶切口，以便插入片段回收

第一百一十八頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日118基因組DNA文庫與cDNA文庫的比較第一百一十九頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日119感受態(tài)細胞的制備及質粒DNA的轉化Ca2+誘導的完整細胞的轉化適用于革蘭氏陰性細菌（如大腸桿菌等），1970年建立此技術，其原理是Ca2+與細菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結構，后者經(jīng)熱脈沖發(fā)生收縮作用，使細胞膜出現(xiàn)空隙，細菌細胞此時的狀態(tài)叫做感受態(tài)

基本方法：細菌經(jīng)0℃的低滲CaCl2處理，使細菌處于感受態(tài)，然后加入甘油-70℃條件下保存第一百二十頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日120感受態(tài)制備成功的驗證

分別取2個200μl感受態(tài)細胞懸液

第一組——轉化實驗組：

0.5μl(50ng)pUC18/pUC19+200μl感受態(tài)細胞

第二組——受體菌對照組：

0.5μl無菌水+200μl感受態(tài)細胞懸液第一百二十一頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日121實驗結果含抗生素LB平板培養(yǎng)基

第一組有菌落，第二組無菌落

第一組、第二組均無或有菌落

普通LB平板培養(yǎng)基第一組、第二組均無菌落

第一組、第二組均有菌落

成功失敗失敗成功第一百二十二頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日122第一百二十三頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日123轉化(Transformation)是將外源DNA分子引入受體細胞,使之獲得新的遺傳性狀的一種手段,它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領域的基本實驗技術。第一百二十四頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日124①感受態(tài)細胞新鮮配制的或從-80℃凍存取出后置于冰水中融化。②取出分裝到Eppendorf管中，每管100~200uL。③加入需轉化的DNA溶液25ul充分混勻(1~5ug/mLDNA)。④冰水中放置30分鐘。⑤37℃或42℃水浴2分鐘。(熱休克)⑥冰浴2min。⑦每管再加入1mLLB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1小時。⑧取出后稍加離心，去掉部分上清，留500uL或250mL

LB則全部鋪板。（2）轉化步驟第一百二十五頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日125第六節(jié)、酵母雙雜交系統(tǒng)酵母雙雜交技術作為發(fā)現(xiàn)和研究在活細胞體內的蛋白質與蛋白質之間的相互作用的技術平臺，在近幾年來得到了廣泛運用。酵母雙雜交技術既可以用來研究哺乳動物基因組編碼的蛋白質之間的互作，也可以用來研究高等植物基因組編碼的蛋白質之間的互作。因此，它在許多的研究領域中有著廣泛的應用。第一百二十六頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日126

酵母雙雜交系統(tǒng)的建立是基于對真核生物調控轉錄起始過程的認識。細胞起始基因轉錄需要有反式轉錄激活因子的參與。反式轉錄激活因子，例如酵母轉錄因子GAL4在結構上是組件式的（modular），往往由兩個或兩個以上結構上可以分開，功能上相互獨立的結構域（domain）構成，其中有DNA結合功能域(DNAbindingdomain,DNA-BD)和轉錄激活結構域（activationdomain，DNA-AD）。這兩個結構域將它們分開時仍分別具有功能，但不能激活轉錄，只有當被分開的兩者通過適當?shù)耐緩皆诳臻g上較為接近時，才能重新呈現(xiàn)完整的GAL4轉錄因子活性，并可激活上游激活序列（upstreamactivatingsequence,UAS）的下游啟動子，使啟動子下游基因得到轉錄。第一百二十七頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日127第一百二十八頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日128第一百二十九頁，共一百四十四頁，2022年，8月28日129

根據(jù)這個特性，將編碼DNA-BD的基因與已知蛋白質Baitprotein的基因構建在同一個表達載體上，在酵母中表達兩者的融合蛋白BD-Baitprotein。將編碼AD的基因和cDNA文庫的基因構建在AD-LIBRARY表達載體上。同時將上述兩種載體轉化改造后的酵母，這種改造后的酵母細